CN105724784A - 以大豆分离蛋白为基底物制备的多肽锌螯合物及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种以大豆分离蛋白为基底物制备的多肽锌螯合物及其制备方法，以大豆分离蛋白为基料，经过发酵、酶解、纳滤、螯合和干燥，以大豆分离蛋白经发酵酶解过滤后产生的多肽为螯合剂制得的多肽锌螯合物。本发明的多肽锌螯合物比同类的多肽螯合锌的纯度和含量有大幅提升，能完全取代纯微量元素添加剂直接加入饲料中，且应用效果好；有诱食效果好；产品稳定，并且含有大量的多功能多肽物质。
Description
技术领域
本发明涉及饲料生产领域，具体涉及一种以大豆分离蛋白为基底物制备的多肽锌螯合物及制备方法。
背景技术
锌是动物体必需的微量元素，在体内与近300种酶的活性有关，其中有的酶类以锌作为其结构成分，有的以锌作为其辅助因子，锌调节和控制这些酶的结构和功能，从而影响机体的许多代谢功能；同时锌也能改变消化道上皮细胞的结构和功能，调节各种含锌消化酶的活性，影响猪的消化等(冷静,2003)。传统上用于猪料的补锌剂以无机锌(如硫酸锌、氧化锌)为主，无机锌在消化过程中释放出的游离金属离子容易与肠道内的一些抗营养因子(如植酸、草酸、磷酸根离子)结合生成不溶性盐或沉淀排除体外，从而降低金属离子的吸收。
氨基酸络合锌和无机锌相比有很好多处，但由于氨基酸较单一，同一种氨基酸在吸收的时候也会受到限制，营养和吸收两方面都没有达到最佳；多肽螯合锌不仅具有氨基酸络合锌的优点，多肽物质中的氨基酸组成较为均衡，且相对氨基酸络合物来说比较稳定，在胃肠道中不易解离，容易被机体所吸收。Carlson等研究结果认为，多肽螯合锌可以利用小肽的吸收通道完整地通过小肠黏膜进入血浆，被非常有效的吸收并转运到靶器官(Carlsonetal,2004)。大量研究表明，在不同动物中使用多肽螯合锌均可提高动物的生长、繁殖性能，提高动物抵御疾病的能力。
目前，已有利用酶解一些蛋白下脚料或是豆粕棉籽粕制备多肽或小肽螯合锌的方法，但这些方法中存在许多问题，这些问题最终将导致产品质量问题。如专利一种小肽螯合微量元素饲料添加剂及其生产工艺(公开号：102657285A)，其使用的水解蛋白废液中氨基酸不平衡，重金属会超标，使用pH8.0进行螯合，产品中有相当一部分会以氢氧化锌的形式存在，喷雾干燥温度过高，影响产品质量；专利一种小肽螯合锌复合物的制备方法与应用(公开号：102827909A)，其使用发酵酶解豆粕等蛋白原料后与金属盐进行螯合，后期没用特别处理，混合物中的多肽分子量分布广，生产过程不容易控制，产品稳定性差，有效多肽含量低等，这些问题急需进行修改；专利以豆粕为基料制配的小肽螯合物及其制配方法(公开号：102669418A)，其使用豆粕作为基底物，后期获得的多肽含量较少，成品中多肽螯合锌的含量较低。
现有技术生产的多肽螯锌生产工艺较简单，成品质量不稳定，成品中的螯合锌含量低，有些产品质量较差，产品味道不佳，且价格昂贵，这些问题都亟待解决。
发明内容
本发明为解决现有技术中的上述问题，提供一种以大豆分离蛋白(Soyproteinisolate，简称SPI，蛋白含量90％以上)为基底物制备的多肽锌螯合物，它是综合利用SPI首先经乳酸菌和酵母菌发酵，给物料提供特有的发酵香味和较高的诱食性，然后经复合蛋白酶和风味蛋白酶进行酶解得到大量多肽、小肽和游离氨基酸，利用超滤得到分子量≤2000Da的多肽，并用纳滤膜进行脱盐，再以多肽和无机锌盐溶液进行螯合，最后经喷雾干燥获得成品。利用该方法得到的多肽螯合锌纯度高，含量高，质量稳定，是一种螯合率高，使用效果好，综合性优越的微量元素小肽螯合锌，并且整个反应过程解决了现有的技术不足的地方。
本发明还提供了一种多肽锌螯合物具有大量的功能性多肽，且具有较浓的发酵香味和较强的诱食性。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个方面是提供一种以大豆分离蛋白为基底物制备多肽锌螯合物的方法，以大豆分离蛋白为基料，经过发酵、酶解、纳滤、螯合和干燥，以大豆分离蛋白经发酵酶解过滤后产生的多肽为螯合剂制得的多肽锌螯合物，具体的包括以下步骤：
1)将大豆分离蛋白、超微粉的豆粕和葡萄糖按重量比为85：(5-10)：(5-10)混合均匀，配制成培养基，灭菌；
2)将乳酸菌与酵母菌按重量比1：2-1：4，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，料水重量比1：1.2-1：2.5配制成三级扩培菌种，加入到步骤1)灭菌后的培养基中，混合均匀，于37-42℃发酵36-48h；
3)将复合蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：1-1：2.5混合，复合蛋白酶和风味蛋白酶的总加入量为300-500U/g大豆分离蛋白，再与水混合后加入到步骤2)已发酵好的物料中，混合后物料的固含物含量为12％-15％，pH值控制在6.0-8.5，升温至42-45℃酶解12-16h；
4)将步骤3)酶解后的物料采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)测定步骤4多肽液中的多肽含量，加入无机锌盐溶液，混合均匀，使螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合液的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合反应，螯合时间为2-4h；
6)将步骤5)获得的反应产物干燥，得多肽锌螯合物。
7)分析检测：检测蛋白质、多肽、微量元素含量和螯合率。
进一步地，所述步骤1)中，大豆浓缩蛋白、豆粕和葡萄糖按重量比为85：(7-9)：(7-9)。
进一步地，所述步骤1)中，大豆浓缩蛋白、豆粕和葡萄糖的重量配比为85：8：7。
进一步地，所述步骤2)中，乳酸菌为植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和嗜热链球菌中的一种或几种；所述酵母菌为面包酵母菌、酿酒酵母菌中的一种或两种。
进一步地，所述步骤2)中，接种浓度为5×107-7×107cfu/ml，优选为6×107cfu/m；按料水重量比为1：1.7-1：2与水混合；将配制的三级扩培菌种加入培养基中，混合均匀，控制发酵温度为37-42℃，发酵时间为36-48h进行发酵。
进一步地，所述步骤2)中，乳酸菌：酵母菌＝1：3，发酵温度40℃，发酵时间40h。
进一步地，所述步骤3)中，将复合蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：1.5-1：2与水混合后，加入到已发酵好的物料中，混合后物料的固含物含量为14％；pH值控制在6.5-7.0，升温至42-45℃后进行酶解，酶解时间为14h。
进一步地，所述步骤3)中，还包括向已加入复合蛋白酶与风味蛋白酶的混合后物料中，加入木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex，以提高酶解速率，所述木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex的重量比为1：2-1：4，所述木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex的总加入量为400-700U/g大豆分离蛋白，搅拌均匀，混合后物料的固含物含量为14％；pH值控制在7，升温至45℃后进行酶解，酶解时间为2-4h。
进一步的，所述复合蛋白酶与风味蛋白酶的重量比为1：1.2，总加入量为350U/g大豆分离蛋白；所述木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex的重量比为1：2.5，所述木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex的总加入量为600U/g大豆分离蛋白。
进一步地，所述步骤3)中，复合蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或几种。
进一步地，所述步骤3)中，复合蛋白酶和风味蛋白酶的总加入量为400U/g大豆分离蛋白。
进一步地，所述步骤5)中，固含物含量控制在17％，螯合液的pH调至6.0，升温至74℃后进行螯合反应，螯合时间为2.5h。
进一步地，所述步骤5)中，加入无机锌盐溶液后螯合液中多肽物质含有的氨基酸和锌离子摩尔比为1：1-3：1。
进一步地，所述步骤5)中，无机锌盐为硫酸锌、硝酸锌、氯化锌和醋酸锌中的一种或几种。
进一步地，所述步骤5)中，在混合后的螯合液中多肽物质含有的氨基酸和锌离子Zn2+摩尔比为2：1。
进一步地，螯合好的物料进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为160-180℃，出风温度为70-85℃。
本发明的第二个方面，提供一种采用上述方法的以大豆分离蛋白为基底物制备的多肽锌螯合物。
进一步地，按质量百分比计，所述多肽锌螯合物中多肽分子量≤2000Da，分子量300-1200Da的多肽含量≥60％，锌离子Zn2+含量≥16％；螯合率≥85％。
进一步地，所述多肽锌螯合物的螯合率检测方法，是使用凝胶过滤、甲醇纯化提取并结合EDTA-Na2滴定的方法检测。
本发明的第三个方面，提供一种采用上述方法的以大豆分离蛋白为基底物制备的多肽锌螯合物作为饲料添加剂的应用。
本发明中所述的大豆浓缩蛋白、豆粕和葡萄糖均市售可得，所述复合蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司，酶活力为100000U/g，风味蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司，酶活力为50000U/g。
本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明是多肽螯合锌产品，相比同类的多肽锌螯合物的纯度和含量有大幅提升，使用的大豆分离蛋白是从大豆中提取的，氨基酸比较均衡，原料稳定，重金属都在控制范围内，该产品能完全取代纯微量元素添加剂直接加入饲料中，且应用效果好；产品经乳酸菌和酵母菌发酵，有独特的发酵香味，诱食效果好；产品中的多肽经超滤膜进行分离，产品稳定，并且含有大量的多功能多肽物质，营养更加全面，补充日粮的微量元素，有效提高动物体的免疫机能；本发明的各步骤的具体工艺条件经过不断的研究摸索，确定的实验条件非常符合本发明多肽锌螯合物的生产制备，简化了生产工艺，降低了成本低，具有较高的社会经济效益。
具体实施方式
本发明提供了一种以大豆分离蛋白为基底物制备的多肽锌螯合物及制备方法。
下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例1：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：以大豆浓缩蛋白为基料，与超微粉的豆粕和葡萄糖配制培养基，大豆浓缩蛋白：豆粕：葡萄糖的重量配比为85：5：10，豆粕和葡萄糖提供碳源和微生物生长所需的微量元素，配制并混合均匀，并通蒸汽进行灭菌，灭菌温度105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中乳酸菌：酵母菌＝1：3，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，按照料水比1：2.0与适当水混合后与配备好的培养基进行混合均匀，控制发酵温度37-42℃，发酵时间42h；
3)酶解阶段：将中性蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：1.5与适当水混合后加入到发酵好的物料中，中性蛋白酶与风味蛋白酶的加入量为400U/g大豆分离蛋白，加水后保证物质的固含物含量为12％-15％；pH调至6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解13h；由于酶解过程中pH会不断变化，所以整个酶解过程要不断调节pH以保证最佳pH反应；
4)过滤阶段：采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：根据多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，使多肽中氨基酸和锌离子摩尔比为1：1进行螯合，螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合锌的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合，螯合时间2h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为80℃，得多肽锌螯合物。
实施例2：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：以大豆浓缩蛋白为基料，与超微粉的豆粕和葡萄糖配制培养基，其中，大豆浓缩蛋白：豆粕：葡萄糖的重量配比为85：10：5，豆粕和葡萄糖提供碳源和微生物生长所需的微量元素，配制并混合均匀，并通蒸汽进行灭菌，灭菌温度105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中乳酸菌：酵母菌＝1：3，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，按照料水比1：1.2-1：2.5与适当水混合后与配备好的培养基进行混合均匀，控制发酵温度37-42℃，发酵时间42h；
3)酶解阶段：使用中性蛋白酶：风味蛋白酶＝1：2.0，与适当水混合后加入到发酵好的物料中，中性蛋白酶与风味蛋白酶的加入量为400U/g大豆分离蛋白，加水后保证物质的固含物含量为12％-15％；pH调至6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解13h；由于酶解过程中pH会不断变化，所以整个酶解过程要不断调节pH以保证最佳pH反应；
4)过滤阶段：采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：根据多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，使多肽中氨基酸和锌离子摩尔比为2：1进行螯合，螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合锌的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合，螯合时间2h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为80℃，得多肽锌螯合物。
实施例3：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：以大豆浓缩蛋白为基料，与超微粉的豆粕和葡萄糖配制培养基，其中，大豆浓缩蛋白：豆粕：葡萄糖的重量配比为85：8：7，豆粕和葡萄糖提供碳源和微生物生长所需的微量元素，配制并混合均匀，并通蒸汽进行灭菌，灭菌温度105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中乳酸菌：酵母菌＝1：3，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，按照料水比1：1.2-1：2.5与适当水混合后与配备好的培养基进行混合均匀，控制发酵温度37-42℃，发酵时间42h；
3)酶解阶段：使用中性蛋白酶：风味蛋白酶＝1：2.5与适当水混合后加入到发酵好的物料中，中性蛋白酶与风味蛋白酶的加入量为400U/g大豆分离蛋白，加水后保证物质的固含物含量为12％-15％；pH调至6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解13h；由于酶解过程中pH会不断变化，所以整个酶解过程要不断调节pH以保证最佳pH反应；
4)过滤阶段：采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：根据多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，使多肽中氨基酸和锌离子摩尔比为2：1进行螯合，螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合锌的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合，螯合时间2h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为80℃，得多肽锌螯合物。
实施例4：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：将大豆浓缩蛋白、超微粉的豆粕和葡萄糖按重量比为85：5：10混合均匀，配制成培养基，采用蒸汽灭菌，灭菌温度为105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中，乳酸菌：酵母菌的重量比为1：4，接种浓度为7×107-9×107cfu/ml，按料水重量比为1：1.5与水混合，配制成三级扩培菌种；将配制的三级扩培菌种加入培养基中，混合均匀，控制发酵温度为40℃，发酵时间为36h进行发酵；
3)酶解阶段：将酸性蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：1.5与水混合后，加入到已发酵好的物料中，酸性蛋白酶与风味蛋白酶的加入量为400U/g大豆分离蛋白，混合后物料的固含物含量为12％-15％；pH值控制在6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解时间为14h；
4)过滤阶段：将酶解后的物料采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的超滤多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：测定多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，使螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合液中多肽含有的氨基酸和锌离子摩尔比为1：1，螯合液的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合反应，螯合时间为3h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为160℃，出风温度为80℃，得多肽锌螯合物。
实施例5：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：将大豆浓缩蛋白、超微粉的豆粕和葡萄糖按重量比为85：5：10混合均匀，配制成培养基，采用蒸汽灭菌，灭菌温度为105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中，乳酸菌：酵母菌的重量比为1：3，接种浓度为7×107-9×107cfu/ml，按料水重量比为1：1.5与水混合，配制成三级扩培菌种；将配制的三级扩培菌种加入培养基中，混合均匀，控制发酵温度为40℃，发酵时间为36h进行发酵；
3)酶解阶段：将酸性蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：2与水混合后，加入到已发酵好的物料中，酸性蛋白酶与风味蛋白酶的加入量为400U/g大豆分离蛋白，混合后物料的固含物含量为12％-15％；pH值控制在6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解时间为14h；
4)过滤阶段：将酶解后的物料采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的超滤多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：测定多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，使螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合液中多肽含有的氨基酸和锌离子摩尔比为2：1，螯合液的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合反应，螯合时间为3h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为160℃，出风温度为80℃，得多肽锌螯合物。
实施例6：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：将大豆浓缩蛋白、超微粉的豆粕和葡萄糖按重量比为85：10：5混合均匀，配制成培养基，采用蒸汽灭菌，灭菌温度为105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中，乳酸菌：酵母菌的重量比为1：3，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，按料水重量比为1：1.2-1：2.5与水混合，配制成三级扩培菌种；将配制的三级扩培菌种加入培养基中，混合均匀，控制发酵温度为37-42℃，发酵时间为38h进行发酵；
3)酶解阶段：将中性蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：1-1：2.5总加入量为350U/g大豆分离蛋白，以及木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex的按重量比为1：2.5总加入量为600U/g大豆分离蛋白，分别与水混合后，加入到已发酵好的物料中，混合后物料的固含物含量为12％-15％；pH值控制在6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解时间为8h；
4)过滤阶段：将酶解后的物料采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的超滤多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：测定多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，螯合液中多肽含有的氨基酸和锌离子摩尔比为3：1，使螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合液的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合反应，螯合时间为3h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为75℃，得多肽锌螯合物。
实施例7：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：将大豆浓缩蛋白、超微粉的豆粕和葡萄糖按重量比为85：10：5混合均匀，配制成培养基，采用蒸汽灭菌，灭菌温度为105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中，乳酸菌：酵母菌的重量比为1：2，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，按料水重量比为1：1.2-1：2.5与水混合，配制成三级扩培菌种；将配制的三级扩培菌种加入培养基中，混合均匀，控制发酵温度为37-42℃，发酵时间为38h进行发酵；
3)酶解阶段：将中性蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：1-1：2.5总加入量为350U/g大豆分离蛋白，以及木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex的按重量比为1：2.5总加入量为600U/g大豆分离蛋白，分别与水混合后，加入到已发酵好的物料中，混合后物料的固含物含量为12％-15％；pH值控制在6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解时间为6h；
4)过滤阶段：将酶解后的物料采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的超滤多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：测定多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，螯合液中多肽含有的氨基酸和锌离子摩尔比为3：1，使螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合液的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合反应，螯合时间为3h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为170℃，出风温度为75℃，得多肽锌螯合物。
实施例8：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：将大豆浓缩蛋白、超微粉的豆粕和葡萄糖按重量比为85：8：7混合均匀，配制成培养基，采用蒸汽灭菌，灭菌温度为105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中，乳酸菌：酵母菌的重量比为1：4，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，按料水重量比为1：1.2-1：2.5与水混合，配制成三级扩培菌种；将配制的三级扩培菌种加入培养基中，混合均匀，控制发酵温度为37-42℃，发酵时间为45h进行发酵；
3)酶解阶段：将中性蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：1.5总加入量为350U/g大豆分离蛋白，以及木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex的按重量比为1：2.5总加入量为600U/g大豆分离蛋白，分别与水混合后，加入到已发酵好的物料中，混合后物料的固含物含量为12％-15％；pH值控制在6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解时间为6h；
4)过滤阶段：将酶解后的物料采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的超滤多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：测定多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，螯合液中多肽含有的氨基酸和锌离子摩尔比为3：1，使螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合液的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合反应，螯合时间为3h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为70℃，得多肽锌螯合物。
实施例9：制备以大豆分离蛋白为基底物的多肽锌螯合物，包括以下步骤：
1)配制培养基：将大豆浓缩蛋白、超微粉的豆粕和葡萄糖按重量比为85：8：7混合均匀，配制成培养基，采用蒸汽灭菌，灭菌温度为105℃；
2)发酵阶段：配制三级扩培菌种，其中，乳酸菌：酵母菌的重量比为1：4，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，按料水重量比为1：1.2-1：2.5与水混合，配制成三级扩培菌种；将配制的三级扩培菌种加入培养基中，混合均匀，控制发酵温度为37-42℃，发酵时间为45h进行发酵；
3)酶解阶段：将中性蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：2总加入量为350U/g大豆分离蛋白，以及木瓜蛋白酶和蛋白酶protamex的按重量比为1：2.5总加入量为600U/g大豆分离蛋白，分别与水混合后，加入到已发酵好的物料中，混合后物料的固含物含量为12％-15％；pH值控制在6.0-8.5，升温至42-45℃后进行酶解，酶解时间为6h；
4)过滤阶段：将酶解后的物料采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，得到分子量≤2000Da的超滤多肽液，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)螯合强化反应：测定多肽液的多肽含量，加入硫酸锌盐溶液，混合均匀，螯合液中多肽含有的氨基酸和锌离子摩尔比为3：1，使螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合液的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合反应，螯合时间为3h；
6)干燥阶段：将反应产物进行喷雾干燥，喷雾干燥进风温度为180℃，出风温度为70℃，得多肽锌螯合物。
对上述实施例1-9制备的多肽锌螯合物，分别进行蛋白质、多肽、锌离子Zn2+含量和螯合率检测，具体检测结果如表一所示：
表一
从以上本发明制备的多肽锌螯合物的蛋白质、多肽、金属锌离子含量和螯合率的检测数据可知，本发明制备的多肽锌螯合物含水量≤5％，多肽含量≥60％，锌离子≥16％，螯合率≥85％；针对不同的物料配比，采用不同的工艺条件，制得的多肽锌螯合物产物含水量低、多肽分子量低，且多肽含量最高可达75.63％，螯合率最高可达99.34％，本发明产品性能稳定，并且含有大量的多功能多肽物质，用作饲料添加剂营养更加全面，补充日粮的微量元素，能够有效提高动物体的免疫机能。
以上实施例的用于以大豆分离蛋白为基料生产的多肽螯合物的螯合率检测方法，是使用凝胶过滤、甲醇纯化提取并结合EDTA-Na2滴定的方法检测。多肽锌螯合物的蛋白质、多肽、微量元素含量检测均为常规检测，蛋白质采用凯氏定氮法进行检测；多肽使用三氯乙酸法进行检测；微量元素含量使用原子吸收或者是使用EDTA-Na2滴定法进行检测。螯合率的检测也为常规检测，先使用凝胶柱过滤、甲醇纯化提取并结合EDTA-Na2滴定的方法进行检测。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.以大豆分离蛋白为基底物制备多肽锌螯合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将大豆分离蛋白、超微粉的豆粕和葡萄糖按重量比为85：(5-10)：(5-10)混合均匀，配制成培养基，灭菌；
2)将乳酸菌与酵母菌按重量比1：2-1：4，接种浓度为4×107-9×107cfu/ml，料水重量比1：1.2-1：2.5配制成三级扩培菌种，加入到步骤1)灭菌后的培养基中，混合均匀，于37-42℃发酵36-48h；
3)将复合蛋白酶与风味蛋白酶按重量比1：1-1：2.5混合，复合蛋白酶和风味蛋白酶的总加入量为300-500U/g大豆分离蛋白，再与水混合后加入到步骤2)已发酵好的物料中，混合后物料的固含物含量为12％-15％，pH值控制在6.0-8.5，升温至42-45℃酶解12-16h；
4)将步骤3)酶解后的物料采用截留分子量为2000Da的超滤膜进行超滤，然后使用纳滤膜进行纳滤，纳滤除去一些盐类和游离氨基酸，得到多肽液；
5)测定步骤4)多肽液中的多肽含量，加入无机锌盐溶液，混合均匀，使螯合液中的固含物含量控制在15％-18％，螯合液的pH调至6.0-6.5，升温至70-75℃后进行螯合反应，螯合时间为2-4h；
6)将步骤5)获得的反应产物干燥，得多肽锌螯合物。
2.根据权利要求1所述的制备多肽锌螯合物的方法，其特征在于，所述步骤1)中，大豆浓缩蛋白、豆粕和葡萄糖的重量配比为85：8：7。
3.根据权利要求1所述的制备多肽锌螯合物的方法，其特征在于，所述步骤2)中，乳酸菌为植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌和嗜热链球菌中的一种或几种；所述酵母菌为面包酵母菌、酿酒酵母菌中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的制备多肽锌螯合物的方法，其特征在于，所述步骤2)中，乳酸菌：酵母菌＝1：3，发酵温度40℃，发酵时间40h。
5.根据权利要求1所述的制备多肽锌螯合物的方法，其特征在于，所述步骤3)中，复合蛋白酶为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的制备多肽锌螯合物的方法，其特征在于，所述步骤3)中，复合蛋白酶和风味蛋白酶的总加入量为400U/g大豆分离蛋白。
7.根据权利要求1所述的制备多肽锌螯合物的方法，其特征在于，所述步骤5)中，加入无机锌盐溶液后螯合液中多肽物质含有的氨基酸和锌离子摩尔比为1：1-3：1。
8.根据权利要求1所述的制备多肽锌螯合物的方法，其特征在于，所述步骤5)中，无机锌盐为硫酸锌、硝酸锌、氯化锌和醋酸锌中的一种或几种。
9.一种如权利要求1-8任一项所述方法制备的多肽锌螯合物。
10.根据权利要求9所述的多肽锌螯合物，其特征在于，所述多肽锌螯合物中含水量≤5％，多肽分子量≤2000Da，分子量300-1200Da的多肽含量≥60％，锌离子含量≥16％，螯合率≥85％。
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