CN114395602A - 一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法及应用 - Google Patents

一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种促乳酸菌生长发酵的肽‑锌配合物的制备方法，包括以下步骤：步骤1、水解：将大豆分离蛋白使用蛋白酶进行水解，得到水解后的蛋白；步骤2、超滤：将水解后的蛋白进行超滤分离处理，得到小分子大豆肽；步骤3、纯化：将小分子大豆肽采用大孔吸附树脂进行吸附和洗脱，得到疏水性的肽；步骤4、反应：将疏水性的肽与硫酸锌溶液在进行反应，得到疏水肽‑锌配合物。本发明促德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长和发酵的特性肽‑锌配合物的制备方法，通过大孔吸附树脂进行纯化得到多肽，得到促乳酸菌生长最强的肽‑锌配合物，推进肽‑锌配合物替代无机锌在乳酸菌生和发酵中的作用，实现肽‑锌配合物在乳酸菌生长发酵过程中的促生长作用。

Description

一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法及应用。
背景技术
德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌是发酵的主要菌株之一，通过细胞代谢能将乳糖转化为乳酸等有机酸，生成具有风味物质的乳酸饮品。提升乳酸菌的生长和代谢能力对工业生产具有重要意义。乳酸菌生长过程中必须营养物质含有碳源、氮源、水、微量元素等。目前已证明小分子肽是更有效氮源，利用乳酸菌的吸收以提高乳酸菌增殖和发酵性。锌是生物体必须的微量元素，是生物体多种酶的激活剂，对调控动植物生命活动具有重要意义。研究表明乳酸菌能够富集无机锌，形成更有利于人体吸收的有机锌，且一定量的锌可以提高乳酸菌的活性和增殖量。肽-锌相对无机锌具有更高的生物利用率，低毒性和抗氧化性等特点，因此以肽-锌配合物为营养物质添加在微生物培养基中，以提高乳酸菌的生长和代谢，对提高发酵工业具有重要的意义。
以肽-锌配合物为有机锌的制备研究已经比较成熟，多肽锌相对于无机锌，具有更高的生物活性，如抗氧化性，提高小鼠体内的抗氧化活性，更高的生物利用率等特点。乳酸菌不能分解大分子的蛋白质，需要通过分泌胞外蛋白酶，将大分子的蛋白质分解为小分子的多肽进而吸收到体内用于生长代谢，这样就导致乳酸菌的生长及其酶活性不足，使得乳酸菌的降糖和产酸能力下降。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法及应用。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
第一方面，本发明提供一种促乳酸菌生长与发酵的肽-锌配合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、水解：将大豆分离蛋白使用蛋白酶进行水解，得到水解后的蛋白；
步骤2、超滤：将水解后的蛋白进行超滤分离处理，得到小分子大豆肽；
步骤3、纯化：将小分子大豆肽采用大孔吸附树脂进行吸附和洗脱，得到疏水性的肽；
步骤4、反应：将疏水性的肽与硫酸锌溶液在进行反应，得到疏水肽-锌配合物。
优选地，所述步骤1中，水解过程是先将大豆分离蛋白与蒸馏水混合，再加入蛋白酶进行酶解，之后经过沸水浴与离心处理，得到澄清的多肽溶液。
优选地，所述大豆分离蛋白与所述蒸馏水的混合质量比为1：10。
优选地，所述蛋白酶的加入量为所述大豆分离蛋白质量的2％。
优选地，所述水解的反应温度为55℃，pH为8.0，酶解时间为3h。
优选地，所述沸水浴的时间为10min，离心处理的转速为8000rpm，离心处理的时间为10min。
优选地，所述步骤2中，超滤是采用5000Da的超滤膜进行超滤。
优选地，所述步骤2中，超滤结束后进行冷冻干燥。
优选地，所述步骤3中，先将小分子大豆肽按照10mg/mL的浓度进行溶解，之后再采用大孔吸附树脂进行吸附。
优选地，所述步骤3中，将采用大孔吸附树脂进行吸附后，使用质量分数为25％、50％以及75％的乙醇水溶液进行洗脱分离，分别得到三种不同疏水性的多肽组分。
优选地，所述步骤4中，使用硫酸锌溶液与疏水性的肽按照锌肽的质量比1：6混合反应，反应温度为60℃、pH为5.5、时间为40min。
优选地，所述步骤4中，吸附和洗脱后采用ICP-OES测定其锌配合率。
第二方面，本发明提供一种促乳酸菌生长与发酵的肽-锌配合物的应用，所述肽-锌配合物应用于乳酸菌的培养。
优选地，所述乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。
优选地，所述乳酸菌培养所用菌选取德氏乳杆菌保加利亚亚种进行培养，培养条件为：温度37度，菌接种量为1％-5％，锌添加量为50ug/mL-200ug/mL的肽-锌配合物。
优选地，所述肽-锌配合物应用于乳酸菌的培养过程，包括以下步骤：
将不同锌含量的疏水肽-锌配合物添加到培养基中，加入乳酸菌，37度培养箱中培养至对数后期，测定其OD600、干重和活菌数。
其中，酸度与酶活性的检测具体步骤包括：取乳酸菌的培养后所得的菌悬液，将发酵液、菌体进行分离，得到的菌体用缓冲溶液重新悬浮，对菌悬液进行细胞破碎得到无细胞提取物；取发酵液用pH计测定发酵液的pH值，用可滴定酸度法测定发酵液中的酸度；取一定量菌体采用反复冻融法提取物细胞提取物，测定细胞内磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶的细胞酶活性。
本发明的有益效果为：
为了促进乳酸菌的生长和产酸能力，本发明的首要目的在于研究多肽-锌配合对乳酸菌的生长和产酸的影响，对比不同锌对乳酸据的影响，并从酶活性上研究多肽-锌对保加利亚乳杆菌的影响，为提高保加利亚乳杆菌的生长提供一种新的方法。
本发明得出一种促德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长和发酵的特性肽-锌配合物的制备方法，通过大孔吸附树脂进行纯化得到多肽，得到促乳酸菌生长最强的肽-锌配合物，推进肽-锌配合物替代无机锌在乳酸菌生和发酵中的作用，实现肽-锌配合物在乳酸菌生长发酵过程中的促生长作用。
本发明以促进乳酸菌的生长为目的，通过蛋白水解和纯化以制备肽-锌配合物，对提升肽-锌配合物的生物应用有重大的意义。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是实施例1中大豆肽分离的三个疏水肽F1、F2和F3的含量及其疏水强度图；
图2是实施例1中疏水肽-锌配合物F11、F22和F33的锌含量图；
图3是实施例2中疏水肽-锌配合物对乳酸菌OD600的影响图；
图4是实施例2中疏水肽-锌配合物对乳酸菌干重的影响图；
图5是实施例2中疏水肽-锌配合物对乳酸菌活菌数的影响图；
图6是实施例3中疏水肽-锌配合物对乳酸菌pH的影响图；
图7是实施例3中疏水肽-锌配合物对乳酸菌酸度的影响图；
图8是实施例3中疏水肽-锌配合物对乳酸菌残糖量的影响图；
图9是实施例3中疏水肽-锌配合物对乳酸菌磷酸甘油醛脱氢酶影响图；
图10是实施例3中疏水肽-锌配合物对乳酸菌乳酸脱氢酶活性影响图。
具体实施方式
为了更清楚的说明本发明，对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
一种促乳酸菌生长与发酵的肽-锌配合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取大豆分离蛋白与蒸馏水按质量比1：10混合，蛋白酶按大豆分离蛋白2％质量比例加入，在55摄氏度下，用1mol氢氧化钠调节pH为8.0，酶解3小时后，沸水浴10分钟，8000转离心10分钟得到澄清的多肽溶液；
(2)取步骤(1)所得的澄清的多肽溶液进行超滤分离，采用5000Da的超滤膜进行超滤得到分子量小于5000Da多肽水溶液，冷冻干燥；
(3)取步骤(2)所得的多肽冻干粉，按照10mg/mL的浓度进行溶解，采用大孔吸附树脂进行分离纯化，分别采用25％、50％、75％的水-乙醇溶液进行分离得到3个不同疏水性的多肽组分(见图1)；
(4)取步骤(3)所得的疏水肽与硫酸锌溶液在60℃、pH 5.5的条件下反应40分钟，并采用ICP-OES测定其锌配合率(见图2)；
上述所得的疏水肽根据疏水强度分为F1、F2和F3，其锌配合物为F11、F22和F33。
实施例2
使用实施例1制备的肽-锌配合物在乳酸菌培养中的应用，包括以下步骤：
(1)在每毫升培养基中添加锌含量为200ug的疏水肽-锌配合物，乳酸菌添加量为5％，在37摄氏度下培养24小时；
(2)将步骤(1)所培养的乳酸菌菌悬液进行收集，在紫外分光光度计下，600nm的波长下测定菌悬液的吸光值(见图3)；
(3)将步骤(1)所培养的乳酸菌菌悬液进行收集，取10mL乳酸菌菌悬液离心，洗涤，烘干至恒重(见图4)；
(4)将步骤(1)所培养的乳酸菌菌悬液进行收集，取菌悬液连续稀释，在固体培养基上进行涂布，培养72小时，计算固体培养基中的菌落数(见图5)；
上述所得肽-锌配合物对乳酸菌的OD600，细胞干重和活菌数都有一定的促进作用，都高于空白和无机锌。
实施例3
使用实施例1制备的肽-锌配合物在乳酸菌培养中的应用，包括以下步骤：
(1)在每毫升培养基中添加锌含量为200ug的疏水肽-锌配合物，乳酸菌添加量为5％，在37摄氏度下培养24小时；
(2)将所得的菌悬液进行收集，在10000rpm的离心力中离心10分钟，得到澄清上清液并收集作为发酵液，将菌体用缓冲溶液清洗3次，得到菌体沉淀；
(3)将步骤(2)所得到的发酵液，采用pH计测定发酵液中的pH值(见图6)；
(4)将步骤(2)所得到的发酵液，取10mL发酵液于烧杯中，加入10mL蒸馏水，用0.1M氢氧化钠溶液进行滴定至pH为8.2，记录消耗的氢氧化钠溶液的消耗量，根据公式计算得酸度值(见图7)；
(4)将步骤(2)所得到的发酵液，取0.5mL发酵液，加入0.5mLDNS试剂0.5mL混匀，沸水浴5min，冷却后加入4mL蒸馏水混匀，测OD540下得吸光值。用不同浓度的葡萄糖溶液的制备标准曲线(见图8)；
(5)将步骤(2)所得到菌体在-80度下冷冻，在37℃下解冻，反复冻融4次，10000转离心得到菌体的粗酶液，采用微生物酶联免疫试剂盒测定乳酸菌的磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶活性(见图9，10)。
经过检测能够证明，使用本发明得到的肽-锌配合物能够提高乳酸菌的降糖量和酸度，提高乳酸菌的磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶的细胞酶活性。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、水解：将大豆分离蛋白使用蛋白酶进行水解，得到水解后的蛋白；
步骤2、超滤：将水解后的蛋白进行超滤分离处理，得到小分子大豆肽；
步骤3、纯化：将小分子大豆肽采用大孔吸附树脂进行吸附和洗脱，得到疏水性的肽；
步骤4、反应：将疏水性的肽与硫酸锌溶液在进行反应，得到疏水肽-锌配合物。
2.根据权利要求1所述的一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，水解过程是先将大豆分离蛋白与蒸馏水混合，再加入蛋白酶进行酶解，之后经过沸水浴与离心处理，得到澄清的多肽溶液。
3.根据权利要求1所述的一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法，其特征在于，所述水解的反应温度为55℃，pH为8.0，酶解时间为3h。
4.根据权利要求2所述的一种促乳酸菌生长与发酵的肽-锌配合物的制备方法，其特征在于，所述大豆分离蛋白与所述蒸馏水的混合质量比为1：10；所述蛋白酶的加入量为所述大豆分离蛋白质量的2％。
5.根据权利要求2所述的一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法，其特征在于，所述沸水浴的时间为10min，离心处理的转速为8000rpm，离心处理的时间为10min。
6.根据权利要求1所述的一种促乳酸菌生长与发酵的肽-锌配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，超滤是采用5000Da的超滤膜进行超滤；超滤结束后进行冷冻干燥。
7.根据权利要求1所述的一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，先将小分子大豆肽按照10mg/mL的浓度使用蒸馏水进行溶解，之后再采用大孔吸附树脂进行吸附；然后分别使用质量分数为25％、50％以及75％的乙醇水溶液进行洗脱分离，得到三种不同疏水性的多肽组分。
8.根据权利要求1所述的一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，使用硫酸锌溶液与疏水性的肽按照锌肽的质量比1：6混合反应，反应温度为60℃、pH为5.5、时间为40min。
9.一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的应用，其特征在于，所述应用是使用权利要求1～7任意之一所述的制备方法制备得到的肽-锌配合物用于乳酸菌的培养。
10.根据权利要求8所述的一种促乳酸菌生长发酵的肽-锌配合物的应用，其特征在于，所述乳酸菌为嗜热链球菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种。
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