CZ299782B6

CZ299782B6 - Zpusob fermentacní výroby etanolu a/nebo kvasnicné biomasy

Info

Publication number: CZ299782B6
Application number: CZ20060019A
Authority: CZ
Inventors: Beran@Miloš; Adámek@Lubomír; Rutová@Eva
Original assignee: Výzkumný ústav potravinárský Praha, v.v.i.
Priority date: 2006-01-11
Filing date: 2006-01-11
Publication date: 2008-11-19
Also published as: CZ200619A3

Abstract

Rešení se týká zpusobu fermentacní výroby etanolua/nebo kvasnicné biomasy z kompletní nebo deproteinované syrovátky, neupravené nebo zahuštené, doplnené nezbytnými dusíkatými a minerálními látkami, za prítomnosti kvasnicných kmenu asimilujících laktózu. V 1. stupni se anaerobní fermentace provádí zejména kmenem Fabospora fragilis a vzniklý etanolse oddelí jako samostatný produkt nebo se fermentacní médium s obsahem etanolu použije ve 2. stupnifermentace za aerobních podmínek v prítomnosti zejména kmene Torulopsis ethanolitolerans. Získaná kvasnicná biomasa se po oddelení usuší a muže sloužit jako zdroj cenných látek pro prípravu napr. potravinových doplnku.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu fermentační výroby etanolu a/nebo kvasničné biomasy z médií obsahujících laktózu. zejména ze syrovátky nebo permeátu po oddělení bílkovin ze syrovátky, io Dosavadní stav techniky

Pro výrobu etanolu nebo kvasničné biomasy je využívána celá řada různých uhlíkatých substrátů, nejčaslěji různých sacharidů. Také mléčný cukr laktóza je často využívaným substrátem pro výrobu těchto produktů. Obvyklým zdrojem laktózy pro průmyslové využití je syrovátka.

Syrovátka dlouhodobě představovala pro mlékárenský průmysl obtížné zpracovatelný odpad. Část syrovátky byla zkrrnována, podstatný podíl však byl často bez užitku likvidován mikrobiální degradací a představoval významný ekologický problém.

2o Díky vývoji moderních ultra filtračních technologií slouží v dnešní době syrovátka často jako surovina pro separaci syrovátkových bílkovin, ve formě různých izolátů a koncentrátů. Syrovátkové bílkoviny jsou nutričně velmi hodnotné a mají velmi široké spektrum využití v potravinářském průmyslu, včetně potravinových doplňků pro sportovní výživu. Po ultrafiltrační separaci bílkovin vzniká deproteinovaná syrovátka obsahující zejména laktózu a minerální látky. Depro25 teinovaná syrovátka představuje stále obtížný odpad s vysokou biologickou spotřebou kyslíku. Může být využita pro izolaci laktózy krystalizaei ze zahuštěného roztoku. Tento proces je vzhledem k nízkému obsahu laktózy však dosti nákladný. Proto byla patentována celá řada fermentační ch postupů zpracování syrovátky, deproteinované nebo kompletní, eventuálně dalších mléčných produktů, na různé melabolické produkty vznikající asimilací laktózy.

Některé patentované fermentační postupy zpracování syrovátky nebo jiných médií obsahujících laktózu zahrnují mikrobiální výrobu butanolu a acetonu (US 2 166 047), aminokyselin (JP 58020194, JP 59034894), potravinářských zahušťovacích a eniulgačních činidel (US 4 444 793. NZ 201321, US 4 851 235). kyseliny propionové (AU 3490884, IE 85I036L,

CA 1256738). xantanové gumy (US 5 434 078). bioplynu (EP 1553059), octa (JP 2002335944), kyseliny mléčně a mléčnanů (EP 0265409, RU 2112391, US 5 952 207) a v nedávné době také probiotických přípravků (např. EU 1502947, BG 108769U) nebo laktulózy (např. CN 1324956, RU 2203959).

io Rada patentů se týká fermentační výroby etanolu (GB 477863. GB 1491405, GB 801274, GB 1524618. US 4 617 861, RU 2105060, EP 1041 153 a NZ 514253). Mléčný cukr laktóza patří mezi obtížně asimilovateíné cukry pro kvasinky. Pouze několik kvasuičných kmenů disponuje enzymem β galaktosidázou, který' je nezbytný pro štěpení laktózy na jednoduché zkvasilelné cukry glukózu a galaktózu. Mezi tyto kmeny patří Saeeharomyces íragilis. kmeny rodu Kluyve45 romyces. zejména K, marxíanus a K. lactis, některé kmeny rodu Candida, zejména C. pseudotropiealis, nebo Eabospora fragilis.

Produkcí mikrobiální biomasy jako bílkovinného zdroje popisuji např. následující patenty:

GB 835544 popisuje aerobní fermentační postup přípravy biomasy několika kvasn ičných kmenů rodů Saeeharomyces a Candida asimilujícícli laktózu v syrovátkovém médiu nebo podmáslí. US 3 818 109 popisuje aerobní fermentační postup výroby potravinářské mikrobiální biomasy s použitím směsné kultury různých kmenů bakterií mléčného kvašení a několika různých kvasničných kmenů schopných zkvašovat laktózu nebo kyselinu mléčnou. US 3 968 257 popisuje fermentační postup přípravy biomasy mléčných kvasinek pro lidskou nebo zvířecí výživu v syroCZ 299782 Bó vátkovém médiu zahrnující separaci pevného podílu ultrafiltrací. CS 180421 popisuje fermentační postup výroby bakteriální biomasy ze syrovátky, US 4 235 933 popisuje fermentační postup produkce kvasnic né biomasy Candida eurvata obsahující vysoký obsah triglyceridového oleje z deproteinované syrovátky. FR 2581998 popisuje přípravu biomasy mléčných kvasinek oboha5 cené galaktózou pro lidskou nebo zvířecí výživu fermentaci laktózy v syrovátkovém nebo jiném médiu, ES 2050066 popisuje semikontinuální nebo kontinuální fermentační proces pro výrobu kvasničné biomasy Kluyveromyces marxianus z deproteinované syrovátky, RU 2154386 popisuje fermentaci syrovátky bakteriálními kmeny Laelobacillus casei a Propionibacterium freudanreichii na mikrobiální biornasu pro potravinářské využití, RU 2213462 popisuje fermentační ío metodu obohaceni syrovátkového nebo mléčného média biomasou kefírových kvasinek, CS 182171 popisuje způsob výroby bílkovinného koncentrátu ze syrovátky, permeátu po ultrafiltrací syrovátky, nebo odstředěného mléka dvoustupňovým fermentačním procesem, V prvním stupni se syrovátka či odstředěné mléko podrobí anaerobní fermentaci bakteriemi rodu Lactobacillus nebo kvasinkami rodu Saccharomyces, v jejímž průběhu se přítomná laktóza rozštěpí na asimilovatclnější monosacharidy glukózu a galaktózu. případně přemění na kyselinu mléčnou nebo etanol. Po oddělení frakce bílkovin odstředěním se získaný fugát doplní dalšími živinami a podrobí aerobní fermentaci kvasnicemi rodu Candida nebo Saccharomyces. Zdrožděný produkt se po případném smíchání s oddělenými frakcemi bílkovin zahustí a usuší.

2o Vzhledem k malému obsahu sušiny syrovátky a špatné asimilovatelnosti laktózy většinou kvasničných kmenů jsou postupy výroby etanolu a kvasničné biomasy ze syrovátky a dalších médií obsahujících laktózu obvykle na hranici ekonomické rentability. Většinou jsou také využívány kvasničné kmeny nevhodné pro potravinářské využití.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky odstraňuje způsob fermentační výroby etanolu a/nebo kvasničné biomasy z kompletní nebo deproteinované syrovátky; neupravené nebo zahuštěné, doplněné nezbytno nýini dusíkatými a minerálními látkami, podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se syrovátkové médium podrobí v 1. stupni v nevětraném fermentoru řízené anaerobní fermentaci kvasničnými kmeny asimilujícími laktózu, zejména kvasničným kmenem Fabospora ťragilis, případně též. Saccharomyces fragilis či lactis nebo některým z kmenů rodu Kluyveromyces či

Candida. případně kombinaci těchto kmenů. Anaerobní fermeniace se provádí při teplotě 20 až

45 °C a hodnotě pH 4 až 6. v jejímž průběhu se převážná většina ze 4 až 12 % hmot. přítomné laktózy přemění na etanol. Tento etanol, po oddělení destilací nebo nanofíhrací, se použije buď jako konečný produkt, např. jako bioctanol nebo potravinářský etanol. nebo sc dál zpracovává ve 2. stupni ve větraném fermentoru při řízené aerobní fermentaci tohoto prokvašeného média s obsahem etanolu v kompletní formě nebo po oddělení pevného podílu, dále po doplnění potřeb4(i ných dusíkatých a anorganických živin a po případném přídavku inokula kvasničného kmene zejména Torulopsis cthaiiolitolerans, případně též Saccharomyces či Kluyveromyces, případně kombinaci těchto kmenů. Výhodou použití kvasničného kmene Torulopsis ethanol i to lerans je mimořádně vysoká růstová rychlost a produktivita růstu na etanolu jako uhlíkatém substrátu. Aerobní fermeniace probíhá při teplotě 20 až 40 °C a hodnotě pH 3.5 až 6, po níž se získaná kvasničná biomasa zahustí nebo odstředí a následně usuší jako konečný produkt pro krmivářské či potravinářské účely.

Způsob podle vynálezu se výhodně vyznačuje tím, že se celá fermeniace provádí sem ikon linuálním nebo kontinuálním způsobem, kdy odtah z nevětraného fermentoru v 1. stupni, ve kterém

5<i probíhá anaerobní fermeniace, slouží jako přítok do větraného fermentoru ve 2. stupni a jeden nebo oba dva fermentory se nacházejí v dynamické rovnováze s plynulým přítokem a odtahem. Odtah z druhého aerobního stupně se opět zahustí nebo odstředí a následně usuší jako konečný produkt.

o

Kvasniená biomasa z prvního stupně a případně také mléčné bílkoviny po jejich vysrážení denaturací mohou býl separovány centrifugací z prokvašeného média odtahovaného z fermentoru

I. stupně po anaerobní fcrmcnlaci a usušeny zvlášť nebo mohou přecházet do fermentoru II. stupně a separovány a usušeny po aerobní fermentaci jako součást finálního produktu - proteinového koncentrátu. Část kvasničné biomasy oddělené po prvním anaerobním fermentačním stupni může být také vrácena zpět do fermenloru I. stupně.

Způsob podle vynálezu umožňuje anaerobní fermentační výrobu etanolu z kompletní nebo deproteinované syrovátky, neupravené či zahuštěné, s vyšším výtěžkem a produktivitou než drive popsané postupy, s použitím produkčního kvasničného kmene Fabospora fragilis, jehož, využití pro produkci etanolu nebylo dosud popsáno.

Navržený dvoustupňový fermentační postup výroby etanolu a/nebo kvasničné biomasy z médií obsahujících laktózu poskytuje také vyšší výtěžnosti a produktivitu než dříve navržené a používala né technologie. Dále se způsobem podle vynálezu zpracuje zejména velké množství syrovátky, která je jinak obtížnou odpadní surovinou, ale s cennými látkami.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení

Příklad 1

A) Anaerobní táze:

Ověřování produkce etanolu bylo provedeno s kmenem Fabospora fragilis ve 150 litrovém ferw mentoru s počátečním plněním 30 litrů 10% syrovátkového média v podmínkách mírného míchání a absence větrání. Fcrmentor byl sterilován parou a živné médium záh řevem na 90 ^UC po dobu minut. Kultivace probíhala 48 hodin při teplotě 30 °C. V průběhu celé fermentacc bylo spotřebováno celkově 6 kg sušené sladké syrovátky, která byla do fermentoru postupně dávkována, V průběhu fermentace byly odebírány vzorky prokvašeného média pro stanovení sušiny, počtu buněk, laktózy a etanolu.

Inokulace:

Vzniklé medium bylo inokulováno 4 x 400 ml 10% syrovátkového média zaočkovaného ze •ta šikmého agaru kulturou Fabospora fragilis CCY 51-1-5. S - 2423333 ze sbírky Výzkumného ústavu potravinářského v Praze, CZ.

Dávkován] solí:

Do připravené směsi bylo na 1 kg vložené laktózy dávkováno 250 ml koncentrovaného roztoku živných solí!. dále 25 ml roztoku živných solí H a 8,3 g (NH JjSOj.

Složení koncentrátu Živných solí I v 1 litru: 35 ml 85% IFPO₄

30gK()H

32 g MgSO₄.7lFO

12,2gNaCI 0,5 g ZnSOj.711-Ό 0,02gCuS0₄.5H₂G 0.05 gMnCMFFO

Koncentrát živných solí II obsahuje v I litru: 156 g CaCk2H₂O 10,56 g FeCh.6H₂O

Hodnocení růstu kultury:

Růst kvasničnc kultury byl sledován kontinuálním měřením změn O₂ a CO₂ pomocí přístrojů na stanovení kyslíku v plynech (Permolyt) a stanovení CO₂ (Infralyt) ve výdechu fermentoru a hlavně stanovováním počtu vitálních kvasinek obsažených ve fermentačním médiu (výsev na Petriho io misky s pevnou agarovou půdou - Sabouraudův agar. 30 °C, 48 h).

Velké množství nerozpustného podílu v médiu a nízká rozpustnost laktózy, která je postupně z média odbourávána, znemožňuje sledování nárůstu kvasničné biomasy stanovováním celkové sušiny.

B) Aerobní fáze:

Fermentace probíhala ve skleněném laboratorním fermentoru s celkovým objemem 30 1 s počátečním plněním 12 1. obsahujícím 15 g (NH₄)₂$O.i a 300 ml živných solí i (složení výše). Médium

2d bylo inokulováno 300 g kvasničné pasty Torulopsis ethanolitolcrans (sušina 22 % hmotn.). Celková doba fermentace byla 6 hodin za podmínek intenzivního míchání (přestup kyslíku 5,5 g.l '.h ’) a teplotě 30 °C. Hodnota pH byla udržována na hodnotě 5,1 průběžným dávkováním čpavkové vody (l: t) regulačním ventilem. V průběhu fermentačnílio procesu bylo do média průběžně nadávkováno 9 kg prokvašeného média z prvního anaerobního postupně, obsahujícího

4.3 % (w/w) etanolu, pomocí regulačního zařízení (např. Metrex), které udržuje konstantně nízkou hladinu etanolu v médiu postupným dávkováním jeho roztoku do fermentoru. Po ukončení termentáce byla biomasa oddělena ve formč kvasničné pasty odstředěním na laboratorní odstředivce (např. Westfalia).

?o Výsledky:

V průběhu anaerobní fáze fermentace (A) byla veškerá laktóza přítomná ve sladké syrovátce, nadávkované do média, přeměněna na etanol. Po ukončení fermentace byla celková hmotnost média 40,9 kg. Obsah etanolu v médiu byl 43 g.kg“¹. Celková sušina v médiu byla 52,9 g.kg’¹.

V průběhu aerobní fáze fermentace (B) bylo po postupném nadávkování 9 kg tohoto prokvašeného média do fermentoru získáno po separaci odstředěním celkově 2320 g kvasničné pasty se sušinou 220 g.kg¹. Celkový přírůstek sušiny v průběhu fermentace byl 444 g.

Vypočtené parametry fermentačnílio procesu:

Anaerobní fáze:

Přibližná výtěžnost kvasničné biomasy Fabospora fragilis z laktózy: Y_{x s} = 0,13.

Výtěžnost etanolu z laktózy: Y_x/S - 0,39.

Produktivita tvorby etanolu: 0,9 g.l'¹ .h'¹

D v o u f á zo v á fe r ni e n t ae e:

Výtěžnost kvasničné biomasy Torulopsis ethanolitolerans z vložené laktózy: Y_{x s} -= 0.32.

Celkový výtěžek bílkovinného koncentrátu (směs kvasničné biomasy Torulopsis ethanolitolerans a Fabospora fragilis a syrovátkových bílkovin po jejich denaturačním vysrážení, oddělení a usušení společně s kvasu ičnou biomasou): 0,48 kg z 1 kg sušiny sladké syrovátky.

-4 C'Z 299782 Bó

Příklad 2

Anaerobní fáze (A) byla provedena stejným způsobem jako u příkladu 1.

I kompletního prokvašeného média obsahujícího 44 g.kg'¹ etanolu a 49,4 g.kg'¹ sušiny bylo po ukončení anaerobního fermentačního pokusu s použitím kvasničného kmene Fabospora fragilis převedeno do skleněného laboratorního fermentoru a kultivováno po dobu 7 hodin za podmínek intenzivního míchání (přestup kyslíku 5,5 g.l'¹ Jí¹). Teplota byla udržována na 30 °C, hodnota pil ío na 5,1 průběžným dávkováním čpavkové vody (1:1) regulačním ventilem na základě signálu regulačního pH metru. Nárůst kvasničné hmoty byl sledován stanovením sušiny v médiu na počátku a na konci kultivace. Byla také stanovena počáteční a konečná koncentrace etanolu v médiu.

l? Výsledky:

Po ukončení fermentace obsahovalo médium 16 g.kg'¹ etanolu a 60,6 g.kg'¹ sušiny. Kvasničná biomasa byla oddělena odstředěním ve formě kvasničné pasty. Celkový přírůstek sušiny v průběhu aerobní fermentace byl 168 g.

Vypočtené parametry' fermentačního procesu:

Dvoufázová fermentace:

Výtěžnost kvasničné biomasy Fabospora fragilis z vnesené laktózy: Y\,._s ~ 0,24.

Celkový výtěžek bílkovinného koncentrátu (směs kvasničné biomasy Fabospora fragilis a syrovátkových bílkovin po jejich denaturačním vysrážení, oddělení a usušení společně s kvasměnou biomasou): 0.3 kg z 1 kg sušiny sladké syrovátky.

3n

Průmyslová využité 1 nost

Ftanol vyrobený anaerobní femientací podle vynálezu může být využit jako kvalitní potravinář35 ský etanol. případně jako palivový bioetanol.

Kvasničná biomasa získaná vc 2. stupni aerobní fermcntaeí anaerobně prokvašeného média s etanolem, čistá nebo s přídavkem syrovátkových bílkovin, může sloužit jako bílkovinný koncentrát, s obsahem bílkovin 45 až 65 % hmotn.. pro potravinářské ěi krmivářskc účely. Kvasničné bioma4() sa je vhodná pro přípravu různých kvasničných extraktů a autolyzátů pro potravinářský průmysl podle známých postupů.

Pokud by ve 2. stupni aerobního fermentačního procesu byl použit kvasničný kmen akceptovaný pro potravinářské využití, Torulopsis nebo Saccharomyces sp.. mohla by být lato kvasu ičná bio45 masa fortifikována v průběhu kultivace různými esenciálními stopovými prvky a biologicky aktivními sloučeninami s cílem produkce potravinových doplňků podle dříve publikovaných postupů. Vzhledem k přítomnosti vysoce kvalitních syrovátkových bílkovin, v případě zpracování kompletní syrovátky, se jeví jako zvláště vhodná oblast jejího využití u potravinových doplňků pro sportovní výživu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Způsob fermentační výroby etanolu a/ncbo kvasničnč biomasy z kompletní nebo deproteinované syrovátky, neupravené nebo zahuštěné, doplněné nezbytnými dusíkatými a minerálními látkami, vyznačující se t í m , že se syrovátkové médium podrobí v l. stupni v nevětraném fermentoru řízené anaerobní íermentaei kvasniěnými kmeny asimilujícími laktózu, zejména kvasničným kmenem Fabospora fragilis, případně též Saccharomyces fragilis ěi laelis. nebo ld některým z kmenů rodu Kluyveromyces či Candida, případně kombinaci těchto kmenů, při teplotě 20 až 45 °C a hodnotě pH 4 až 6, v jejímž průběhu se převážná většina ze 4 až 12 % hmotn. přítomné laktózy přemění na etanol, který se z prokvašeného média oddělí nebo použije ve
2. stupni ve vél raném fermentoru při řízené aerobní fermentací tohoto prokvašeného média s obsahem etanolu v kompletní formě nebo po oddělení pevného podílu, dále po doplnění potřeb15 ných dusíkatých a anorganických živin a po případném přídavku inokula kvasu iěného kmene zejména Torulopsís ethanolitolerans, případně též Saccharomyces ci Kluyveromyces, případně kombinaci těchto kmenů, při teplotě 20 až 40 °C a hodnolě pH 3,5 až 6, po níž se získaná kvasničná biomasa zahustí nebo odstředí, a následně usuší jako konečný produkt.

2(i 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že etanol z prokvašeného média je po 1. stupni fcrmcntace oddělen destilací nebo nanofiftrací jako konečný produkt.
3. Způsob podle nároku I. v y z n a č u j í c í se tím, že se celá fcrmcntace provádí semikontinuálním nebo kontinuálním způsobem, kdy odtah z nevětraného fermentoru v 1. stupni, ve

25 kterém probíhá anaerobní fermentace, slouží jako přítok do větraného fermentoru ve 2. stupni, a jeden nebo oba dva fermentory se nacházejí v dynamické rovnováze splynulým přítokem a odtahem.