CZ200619A3 - Zpusob fermentacní výroby etanolu a/nebo kvasnicné biomasy - Google Patents

Abstract

Resení se týká zpusobu fermentacní výroby etanolua/nebo kvasnicné biomasy z kompletní nebo deproteinované syrovátky, neupravené nebo zahustené, doplnené nezbytnými dusíkatými a minerálními látkami, za prítomnosti kvasnicných kmenu asimilujících laktózu. V 1. stupni se anaerobní fermentace provádí zejména kmenem Fabospora fragilis a vzniklý etanolse oddelí jako samostatný produkt nebo se fermentacní médium s obsahem etanolu pouzije ve 2. stupnifermentace za aerobních podmínek v prítomnosti zejména kmene Torulopsis ethanolitolerans. Získaná kvasnicná biomasa se po oddelení ususí a muze slouzit jako zdroj cenných látek pro prípravu napr. potravinových doplnku.

Description

Způsob fermentační výroby etanolu a/nebo kvasničné biomasy

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu fermentační výroby etanolu a/nebo kvasničné biomasy z médií obsahujících laktózu, zejména ze syrovátky nebo permeátu po oddělení bílkovin ze syrovátky.

Dosavadní stav techniky

Pro výrobu etanolu nebo kvasničné biomasy je využívána celá řada různých uhlíkatých substrátů, nejčastěji různých sacharidů. Také mléčný cukr laktóza je často využívaným substrátem pro výrobu těchto produktů. Obvyklým zdrojem laktózy pro průmyslové využití je syrovátka.

Syrovátka dlouhodobě představovala pro mlékárenský průmysl obtížně zpracovatelný odpad. Část syrovátky byla zkrmována, podstatný podíl však byl často bez užitku likvidován mikrobiální degradací a představoval významný ekologický problém.

Díky vývoji moderních ultrafiltračních technologií slouží v dnešní době syrovátka často jako surovina pro separaci syrovátkových bílkovin, ve formě různých izolátů a koncentrátů. Syrovátkové bílkoviny jsou nutričně velmi hodnotné a mají velmi široké spektrum využití v potravinářském průmyslu, včetně potravinových doplňků pro sportovní výživu. Po ultrafiltraění separaci bílkovin vzniká deproteinovaná syrovátka obsahující zejména laktózu a minerální látky. Deproteinovaná představuje stále obtížný odpad s vysokou biologickou spotřebou kyslíku. Může být využita pro izolaci laktózy krystalizací ze zahuštěného roztoku. Tento proces je vzhledem k nízkému obsahu laktózy však dosti nákladný. Proto byla patentována celá řada fermentačních postupů zpracování syrovátky, deproteinované nebo kompletní, eventuálně dalších mléčných produktů, na různé metabolické produkty vznikající asimilací laktózy.

Některé patentované fermentační postupy zpracování syrovátky nebo jiných médií obsahujících laktózu zahrnují mikrobiální výrobu butanolu a acetonu (US 2166047), aminokyselin (JP 58020194, JP 59034894), potravinářských zahušťovacích a emulgačních činidel (US 4444793, NZ 201321, US 4851235), kyseliny propionové (AU 3490884, IE 8510361, CA 1256738), xantanové gumy (US 5434078), bioplynu (EP 1553059), octa (JP 2002335944), kyseliny mléčné a

mléčnanů (EP 0265409, RU 2112391, US 5952207) a v nedávné době také probiotických přípravků (např. EU 1502947, BG 108769U) nebo laktulózy (např. CN 1324956, RU 2203959).

Řada patentů se týká fermentační výroby etanolu (GB 477863, GB 1491405, GB 801274, GB 1524618, US 4617861, RU 2105060, EP 1041153 a NZ 514253). Mléčný cukr laktóza patří mezi obtížně asimilovatelné cukry pro kvasinky. Pouze několik kvasničných kmenů disponuje enzymem β-galaktosidázou, který je nezbytný pro štěpení laktózy na jednoduché zkvasitelné cukry glukózu a galaktózu. Mezi tyto kmeny patří Saccharomyces fragílis, kmeny rodu Kluyveromyces, zejména K. marxianus a K. lactis, některé kmeny rodu Candida, zejména C. pseudotropicalis, nebo Fabospora fragilis.

Produkci mikrobiální biomasy jako bílkovinného zdroje popisují např. následující patenty:

GB 835544 popisuje aerobní fermentační postup přípravy biomasy několika kvasničných kmenů rodů Saccharomyces a Candida asimilujících laktózu v syrovátkovém médiu nebo podmáslí. US 3818109 popisuje aerobní fermentační postup výroby potravinářské mikrobiální biomasy s použitím směsné kultury různých kmenů bakterií mléčného kvašení a několika různých kvasničných kmenů schopných zkvašovat laktózu nebo kyselinu mléčnou. US 3968257 popisuje fermentační postup přípravy biomasy mléčných kvasinek pro lidskou nebo zvířecí výživu v syrovátkovém médiu zahrnující separaci pevného podílu ultrafiltrací. CS 180421 popisuje fermentační postup výroby bakteriální biomasy ze syrovátky. US 4235933 popisuje fermentační postup produkce kvasničné biomasy Candida curvata obsahující vysoký obsah triglyceridového oleje z deproteinované syrovátky. FR 2581998 popisuje přípravu biomasy mléčných kvasinek obohacené galaktózou pro lidskou nebo zvířecí výživu fermentací laktózy v syrovátkovém nebo jiném médiu. ES 2050066 popisuje semikontinuální nebo kontinuální fermentační proces pro výrobu kvasničné biomasy Kluyveromyces marxianus z deproteinované syrovátky. RU 2154386 popisuje fermentací syrovátky bakteriálními kmeny Lactobacillus casei a Propionibacterium freudanreichii na mikrobiální biomasu pro potravinářské využití. RU 2213462 popisuje fermentační metodu obohacení syrovátkového nebo mléčného média biomasou kefírových kvasinek. CS 182171 popisuje způsob výroby bílkovinného koncentrátu ze syrovátky, permeátu po ultrafiltrací syrovátky, nebo odstředěného mléka dvoustupňovým fermentačním procesem. V prvním stupni se syrovátka či

J odstředěné mléko podrobí anaerobní fermentaci bakteriemi rodu Lactobacillus nebo kvasninkami rodu Saccharomyces, v jejímž průběhu se přítomná laktóza rozštěpí na asimilovatelnější monosacharidy glukózu a galaktózu, případně přemění na kyselinu mléčnou nebo etanol. Po oddělení frakce bílkovin odstředěním se získaný fugát doplní dalšími živinami a podrobí aerobní fermentaci kvasnicemi rodu Candida nebo Saccharomyces. Zdrožděný produkt se po případném smíchání s oddělenými frakcemi bílkovin zahustí a usuší.

Vzhledem k malému obsahu sušiny syrovátky a špatné asímilovatelnosti laktózy většinou kvasničných kmenů jsou postupy výroby etanolu a kvasničné biomasy ze syrovátky a dalších médií obsahujících laktózu obvykle na hranici ekonomické rentability. Většinou jsou také využívány kvasničné kmeny nevhodné pro potravinářské využití.

Podstata vynálezu

Výše uvedené nedostatky odstraňuje způsob fermentační výroby etanolu a/nebo kvasničné biomasy z kompletní nebo deproteinované syrovátky, neupravené nebo zahuštěné, doplněné nezbytnými dusíkatými a minerálními látkami, podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že se syrovátkové médium podrobí v1. stupni v nevětraném fermentoru řízené anaerobní fermentaci kvasničnými kmeny asimilujícími laktózu, zejména kvasničným kmenem Fabospora fragilis, případně též Saccharomyces fragilis či lactis nebo některým z kmenů rodu Kluyveromyces či Candida, případně kombinaci těchto kmenů. Anaerobní fermentace se provádí při teplotě 20 až 45 °C a hodnotě pH 4 až 6, v jejímž průběhu se převážná většina ze 4 až 12 % hmot. přítomné laktózy přemění na etanol. Tento etanol, po oddělení destilací nebo nanofiltrací, se použije buď jako konečný produkt, např. jako bioetanol nebo potravinářský etanol, nebo se dál zpracovává ve 2. stupni ve větraném fermentoru při řízené aerobní fermentaci tohoto prokvašeného media s obsahem etanolu v kompletní formě nebo po oddělení pevného podílu, dáie po doplnění potřebných dusíkatých a anorganických živin a po případném přídavku inokula kvasničného kmene zejména Torulopsis ethanolitolerans, případně též Saccharomyces či Kluyveromyces, případně kombinaci těchto kmenů. Výhodou použití kvasničného kmene Torulopsis ethanolitolerans je mimořádně vysoká růstová rychlost a produktivita růstu na etanolu jako uhlíkatém substrátu. Aerobní fermentace probíhá při teplotě 20 až 40 °C a hodnotě pH 3,5 až 6, po níž se získaná • « kvasničná biomasa zahustí nebo odstředí a následně usuší jako konečný produkt pro krmivářské či potravinářské účely.

Způsob podle vynálezu se výhodně vyznačuje tím, že se celá fermentace provádí semíkontinuálním nebo kontinuálním způsobem, kdy odtah z nevětraného fermentoru v 1. stupni, ve kterém probíhá anaerobní fermentace, slouží jako přítok do větraného fermentoru ve 2. stupni a jeden nebo oba dva fermentory se nacházejí v dynamické rovnováze s plynulým přítokem a odtahem. Odtah z druhého aerobního stupně se opět zahustí nebo odstředí a následně usuší jako konečný produkt.

Kvasničná biomasa z prvního stupně a případně také mléčné bílkoviny po jejich vysrážení denaturací mohou být separovány centrifugací z prokvašeného média odtahovaného z fermentoru I. stupně po anaerobní fermentaci a usušeny zvlášť nebo mohou přecházet do fermentoru II. stupně a separovány a usušeny po aerobní fermentaci jako součást finálního produktu - proteinového koncentrátu. Část kvasničné biomasy oddělené po prvním anaerobním fermentačním stupni může být také vracena zpět do fermentoru I. stupně.

Způsob podle vynálezu umožňuje anaerobní fermentační výrobu etanolu z kompletní nebo deproteinované syrovátky, neupravené či zahuštěné, s vyšším výtěžkem a produktivitou než dříve popsané postupy, s použitím produkčního kvasničného kmene Fabospora fragilis, jehož využití pro produkci etanolu nebylo dosud popsáno.

Navržený dvoustupňový fermentační postup výroby etanolu a/nebo kvasničné biomasy z médií obsahujících laktózu poskytuje také vyšší výtěžnost a produktivitu než dříve navržené a používané technologie. Dále se způsobem podle vynálezu zpracuje zejména velké množství syrovátky, která je jinak obtížnou odpadní surovinou, ale s cennými látkami.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoliv omezovaly.

Příklady provedení

Příklad 1

A) Anaerobní fáze:

Ověřování produkce etanolu bylo provedeno s kmenem Fabospora fragillis ve 150 litrovém fermentoru s počátečním plněním 30 litrů 10% syrovátkového média

v podmínkách mírného míchání a absence větrání. Fermentor byl sterilován parou a živné médium záhřevem na 90 °C po dobu 30 minut. Kultivace probíhala 48 hodin při teplotě 30 °C. V průběhu celé fermentace bylo spotřebováno celkově 6 kg sušené sladké syrovátky, která byla do fermentoru postupně dávkována. V průběhu fermentace byly odebírány vzorky prokvašeného média pro stanovení sušiny, počtu buněk, laktózy a etanolu.

Inokulace:

Vzniklé médium bylo inokulováno 4 x 400 ml 10% syrovátkového média zaočkovaného ze šikmého agaru kulturou Fabospora fragilis CCY 51-1-5, S 2423333 ze sbírky Výzkumného ústavu potravinářského v Praze, CZ.

Dávkování solí:

Do připravené směsi bylo na 1 kg vložené laktózy dávkováno 250 ml koncentrovaného roztoku živných solí I, dále 25 ml roztoku živných solí II a 8,3 g (NH₄)₂SO₄.

Složení koncentrátu živných solí I v 1 litru: 35 mi 85% H₃PO₄ g KOH 32 g MgSO₄.7H₂O 12,2 g NaCI 0,5 g ZnSO₄.7H₂O 0,02 g CuSO₄.5H₂O 0,05 g MnCI₂.4H₂O

Koncentrát živných solí ll obsahuje v 1 litru: 156 g CaCI₂. 2H₂O 10,56 g FeCI₃.6H₂O

Hodnocení růstu kultury:

Růst kvasničné kultury byl sledován kontinuálním měřením změn O₂ a CO₂ pomocí přístrojů na stanovení kyslíku v plynech (Permolyt) a stanovení CO₂ (Infralyt) ve výdechu fermentoru a hlavně stanovováním počtu vitálních kvasinek obsažených ve fermentačním mediu (výsev na Petriho misky s pevnou agarovou půdou Sabouraudův agar, 30 °C, 48 h).

Velké množství nerozpustného podílu v médiu a nízká rozpustnost laktózy, která je postupně z média odbourávána, znemožňuje sledování nárůstu kvasničné biomasy stanovováním celkové sušiny.

B) Aerobní fáze:

Fermentace probíhala ve skleněném laboratorním fermentoru s celkovým objemem 30 I s počátečním plněním 12 I, obsahujícím 15 g (NH₄)₂SO4 a 300 ml živných solí I (složení výše). Médium bylo inokulováno 300 g kvasničné pasty Torulopsis ethanolitolerans (sušina 22 % hmot.). Celková doba fermentace byla 6 hodin za podmínek intenzivního míchání (přestup kyslíku 5,5 g.l'¹.h'¹) a teplotě 30 °C. Hodnota pH byla udržována na hodnotě 5,1 průběžným dávkováním čpavkové vody (1:1) regulačním ventilem. V průběhu fermentačního procesu bylo do média průběžně nadávkováno 9 kg prokvašeného média z prvního anaerobního stupně, obsahujícího 4,3 % (w/w) etanolu, pomocí regulačního zařízení (např. Metrex), které udržuje konstantně nízkou hladinu etanolu v médiu postupným dávkováním jeho roztoku do fermentoru. Po ukončení fermentace byla biomasa oddělena ve formě kvasničné pasty odstředěním na laboratorní odstředivce (např. Westfalia).

Výsledky:

V průběhu anaerobní fáze fermentace (A) byla veškerá laktóza přítomná ve sladké syrovátce, nadávkované do média, přeměněna na etanol. Po ukončení fermentace byla celková hmotnost média 40,9 kg. Obsah etanolu v médiu byl 43 g.kg’¹. Celková sušina v médiu byla 52,9 g.kg'¹.

V průběhu aerobní fáze fermentace (B) bylo po postupném nadávkování 9 kg tohoto prokvašeného média do fermentoru získáno po separaci odstředěním celkově 2 320 g kvasničné pasty se sušinou 220 g.kg¹. Celkový přírůstek sušiny v průběhu fermentace byl 444 g.

Vypočtené parametry fermentačního procesu:

Anaerobní fáze:

Přibližná výtěžnost kvasničné biomasy Fabospora fragilis z laktózy: Y_X/s = 0,13. Výtěžnost etanolu z laktózy: Υχ/s = 0,39.

Produktivita tvorby etanolu: 0,9 g.l¹.h'¹

Dvoufázová fermentace:

Výtěžnost kvasničné biomasy Torulopsis ethanolitolerans z vložené laktózy: Y_x/s = 0,32.

Ί

Celkový výtěžek bílkovinného koncentrátu (směs kvasničné biomasy Torulopsis ethanolitolerans a Fabospora fragilis a syrovátkových bílkovin po jejich denaturačním vysrážení, oddělení a usušení společně s kvasničnou biomasou): 0,48 kg z 1 kg sušiny sladké syrovátky.

Příklad 2

Anaerobní fáze (A) byla provedena stejným způsobem jako u příkladu 1.

I kompletního prokvašeného média obsahujícího 44 g.kg'¹ etanolu a 49,4 g.kg'¹ sušiny bylo po ukončení anerobního fermentačního pokusu s použitím kvasničného kmene Fabospora fragilis převedeno do skleněného laboratorního fermentoru a kultivováno po dobu 7 hodin za podmínek intenzivního míchání (přestup kyslíku 5,5 g.l¹.h'¹). Teplota byla udržována na 30 °C, hodnota pH na 5,1 průběžným dávkováním čpavkové vody (1:1) regulačním ventilem na základě signálu regulačního pH metru. Nárůst kvasničné hmoty byl sledován stanovením sušiny v médiu na počátku a na konci kultivace. Byla také stanovena počáteční a konečná koncentrace etanolu v médiu.

Výsledky:

Po ukončení fermentace obsahovalo medium 16 g.kg'¹ etanolu a 60,6 g.kg'¹ sušiny. Kvasničné biomasa byla oddělena odstředěním ve formě kvasničné pasty. Celkový přírůstek sušiny v průběhu aerobní fermentace byl 168 g.

Vypočtené parametry fermentačního procesu:

Dvoufázová fermentace:

Výtěžnost kvasničné biomasy Fabospora fragillis z vnesené laktózy: Yx,_s = 0,24. Celkový výtěžek bílkovinného koncentrátu (směs kvasničné biomasy Fabospora fragilis a syrovátkových bílkovin po jejich denaturačním vysrážení, oddělení a usušení společně s kvasničnou biomasou): 0,3 kg z 1 kg sušiny sladké syrovátky.

Průmyslová využitelnost

Etanol vyrobený anaerobní fermentací podle vynálezu může být využit jako kvalitní potravinářský etanol, případně jako palivový bioetanol.

Kvasničná biomasa získaná ve 2. stupni aerobní fermentací anaerobně prokvašeného média s etanolem, čistá nebo s přídavkem syrovátkových bílkovin, může sloužit jako bílkovinný koncentrát, s obsahem bílkovin 45 až 65 % hmot., pro potravinářské či krmivářské účely. Kvasničná biomasa je vhodná pro přípravu různých kvasničných extraktů a autolyzátů pro potravinářský průmysl podle známých postupů.

Pokud by ve 2. stupni aerobního fermentačního procesu byl použit kvasničný kmen akceptovaný pro potravinářské využití, Torulopsis nebo Sacchoromyces sp., mohla by být tato kvasničná biomasa fortifikována v průběhu kultivace různými esenciálními stopovými prvky a biologicky aktivními sloučeninami s cílem produkce potravinových doplňků podle dříve publikovaných postupů. Vzhledem k přítomnosti vysoce kvalitních syrovátkových bílkovin, v případě zpracování kompletní syrovátky, se jeví jako zvláště vhodná oblast jejího využití u potravinových doplňků pro sportovní výživu.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob fermentační výroby etanolu a/nebo kvasničné biomasy z kompletní nebo deproteinované syrovátky, neupravené nebo zahuštěné, doplněné nezbytnými dusíkatými a minerálními látkami, vyznačující se tím, že se syrovátkové médium podrobí v 1. stupni v nevětraném fermentoru řízené anaerobní fermentaci kvasničnými kmeny asimilujícími laktózu, zejména kvasničným kmenem Fabospora fragilis, případně též Saccharomyces fragilis či lactis nebo některým z kmenů rodu Kluyveromyces či Candida, případně kombinaci těchto kmenů, při teplotě 20 až 45 °C a hodnotě pH 4 až 6, v jejímž průběhu se převážná většina ze 4 až 12 % hmot. přítomné laktózy přemění na etanol, který se z prokvašeného media oddělí nebo použije ve 2. stupni ve větraném fermentoru při řízené aerobní fermentaci tohoto prokvašeného media s obsahem etanolu v kompletní formě nebo po oddělení pevného podílu, dále po doplnění potřebných dusíkatých a anorganických živin a po případném přídavku inokuia kvasničného kmene zejména Torulopsis ethanolitolerans, případně též Saccharomyces či Kluyveromyces, případně kombinaci těchto kmenů, při teplotě 20 až 40 °C a hodnotě pH 3,5 až 6, po níž se získaná kvasničná biomasa zahustí nebo odstředí a následně usuší jako konečný produkt.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že etanol z prokvašeného média je po

   1. stupni fermentace oddělen destilací nebo nanofiltrací jako konečný produkt.
3. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se celá fermentace provádí semikontinuálním nebo kontinuálním způsobem, kdy odtah z nevětraného fermentoru v 1. stupni, ve kterém probíhá anaerobní fermentace, slouží jako přítok do větraného fermentoru ve 2. stupni a jeden nebo oba dva fermentory se nacházejí v dynamické rovnováze s plynulým přítokem a odtahem,