CN114480146B

CN114480146B - 一种米曲霉菌株在富集铜铁锰锌中的应用

Info

Publication number: CN114480146B
Application number: CN202210396267.1A
Authority: CN
Inventors: 吴信; 高乐
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2022-04-15
Filing date: 2022-04-15
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2042-04-15
Also published as: CN114480146A

Abstract

本发明公开一种米曲霉菌株A02在富集铜铁锰锌方面的应用，包括在培养阶段在培养基中添加无机铜铁锰锌等离子溶液，使铜铁锰锌离子在米曲霉菌体内高效地有机转化富集。本发明的米曲霉菌体产品可以用于人的铜铁锰锌补剂也可以广泛应用于畜禽及水产饲料产品中，提高铜铁锰锌的生物利用率。

Description

一种米曲霉菌株在富集铜铁锰锌中的应用

技术领域

本发明属于微生物和食品技术领域，涉及一种米曲霉菌株富集铜铁锰锌微量元素的应用。

背景技术

铜铁锰锌元素的缺乏会引起人和动物，特别是儿童及幼畜营养的不良。目前国内使用的铜铁锰锌补剂主要是以硫酸亚铁、硫酸锌等无机形态存在，动物体利用率较差。硫酸亚铁难以解决仔猪缺铁性贫血症状，其局限性已经在养殖业证实。国内之前报道的，在奶牛日粮中添加600ppm蛋白锌，产奶量比添加同样剂量的无机锌提高25.4%。

采用微生物为载体，富集金属元素实现高效地有机转化，具有明显的优势。第一：一般用于金属元素的微生物属于人畜无毒安全的菌种，属于食品及饲料目录菌株；第二：微生物载体不仅可以提供人及动物体所需的微量元素，同时菌体本身又含有丰富的营养。其在食品及饲料中添加，可以提升产品的品质与功能；第三：微生物体可以高效地将无机金属离子有机转化，采用菌体有机金属形式在食品及饲料中添加，可以明显提升动物体对金属离子的利用效率。

本发明是保护一种米曲霉菌株，使用同一种培养基和同一种发酵条件下，可以同时富集铜铁锰锌四种金属微量元素的方法，形成菌体蛋白金属元素产品，在饲料或者食品中添加，满足人及动物对铜铁锰锌的需要。该方法解决了不同微量元素富集采用多种培养菌种及多种培养方式，避免生产成本过高，生产周期长，后续添加操作繁琐的弊端。

发明内容

本发明提出了一种米曲霉菌株A02在富集铜铁锰锌方面的应用，本发明选用米曲霉为富集铜铁锰锌载体通过微生物转化法将不容易被人体吸收利用的无机金属元素同时转化成容易被人体吸收利用的有机金属元素，从而使有机金属微量元素富含在米曲霉菌体来开发富集金属元素饲用产品。

本发明提供一种米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株A02在富集铜、铁、锰和/或锌中的应用，其特征在于，所述米曲霉菌株A02的保藏号为：CGMCC No.40043。

同时，本发明提供一种微生物法富集富集铜、铁、锰和/或锌的方法，其特征在于，添加无机铜、铁、锰和/或锌离子的培养基培养保藏号为：CGMCC No.40043的米曲霉菌株A02。

其中，培养基中添加铜、铁、锰和锌离子分别为硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸锌和硫酸锰的形式添加，添加的重量为每升培养基5-10g。

具体实施方式中，其培养温度为26℃~32℃，转速180~200 rpm，培养60-180h。

进一步，还包括收集培养后得到的菌体。

本发明因而也提供所述的方法获得的米曲霉菌株A02菌体。

本发明进一步提供一种富集金属元素的单细胞蛋白产品的方法，其是以米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株A02和黑曲霉(Aspergillus niger) 60B-3DW混和菌在添加有硫酸铁，硫酸铜，硫酸锌和/或硫酸锰作为初始金属元素的木质素原材料培养基上发酵，得到富集金属元素的单细胞蛋白及分离所述单细胞蛋白的步骤，其中所述米曲霉菌株A02的保藏号为：CGMCC No.40043；所述黑曲霉60B-3DW保藏号为：CGMCC No.22465，其是由中国科学院微生物研究所普通菌种保藏中心提供的黑曲霉3.316诱变得到。

具体地，所述木质素原材料是秸秆类原材料，粕类原材料，或其混合物。

更进一步地，所述秸秆类原材料是玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣及其混合物。

优选地，玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣的料水比为1:2-3，添加2-8%硫酸铁（w/w），2-8%硫酸铜（w/w），2-8%硫酸锌（w/w）或2-8%硫酸锰（w/w）作为初始金属元素。

本发明提供的富集金属元素的米曲霉的培养方法，使金属元素的有机转化和米曲霉菌体培养同时进行，两者相辅相成，发酵周期短，合成效率高，使生产获得的富集金属元素的米曲霉菌体更加安全易于人体的吸收；实验表明本发明的米曲霉菌体同时富集铜铁锰锌四种金属离子后，菌体蛋白中氨基酸含量43.07%，菌体铁含量高达68840ppb，菌体锌含量高达11572ppb，菌体铜含量高达21610 ppb ，菌体锰含量16125 ppb。此外，利用本发明的米曲霉与黑曲霉协同固态发酵低值原料，开发新型高蛋白含量、富集四种金属元素的单细胞蛋白产品，具有明显技术优势，能够广泛的运用于饲料行业、食品以及营养品产业中。

附图说明

图1富集金属离子后米曲霉菌体蛋白氨基酸组成分析色谱图。

相关的生物材料保藏信息如下：

本发明涉及的米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株A02，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏单位简称CGMCC），保藏号为：CGMCC No.40043，分类命名为：米曲霉Aspergillus oryzae：保藏时间为：2022年1月17日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

涉及的黑曲霉菌株60B-3DW，其分类命名：黑曲霉Aspergillus niger，菌株黑曲霉Aspergillus niger 60B-3DW被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏单位简称CGMCC），保藏号为：CGMCC No.22465，保藏时间为：2021年07月05日，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的阐述，以便更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。

实施例1：米曲霉菌株A02的获得

1、原始菌株的获得

2021年05月在河北省唐山市采集腐木微生物中分离获得。

分离过程：刮取腐木微生物，放入盛有95mL无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于30℃、180rpm振荡30min。取菌悬液1mL进行10^-1-10^-7系列浓度梯度稀释，然后取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度涂布至以木质素为唯一碳源的培养基平板上，于28℃倒置培养5d。

纯化：菌落在以木质素为唯一碳源的培养基平板形成后，选取生长最快的一株菌，挑取单菌落边缘处的菌丝于PDA培养基平板上，继续28℃恒温培养。最终获得一株米曲霉纯菌落，将获得菌落4℃保存。

对该菌株进行鉴定，其中ITS测序序列结果如下： GACGCTCGTAAGATCTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAATCTTCCTGTG。

结果显示，该菌的ITS序列与米曲霉RP-1 菌株相似度达到100%，说明该菌株是米曲霉菌株。

2、突变菌株A02的获得

对上述获得的米曲霉菌株进行ARTP诱变及分选：

a. 诱变时间确定：采用100µl新鲜的米曲霉孢子悬液，孢子浓度为10⁵,诱变不同时间。当诱变设置0s，60 s，90 s，120 s，150 s的诱变时间，分别凃板统计每个诱变时间的致死率，以70%致死率为理想诱变时间(0s情况作为对照)；

b.诱变后菌落孔板法评价：诱变后菌落挑入24孔板内，24孔板内使用高金属浓度的基础培养基（2%葡萄糖+5g/L硫酸铁，5g/L硫酸铜，5g/L硫酸锌，5g/L硫酸锰），30℃、130rpm培养1d，测定其OD600判断诱变后菌落在高金属浓度条件下的生长速度。其中生长速度最快的菌株是编号为A02菌株, 将获得的菌落4℃保存。

实施例2：米曲霉菌株A02的富集铜铁锰锌金属元素

米曲霉金属元素富集培养基针对铜铁锰锌四种金属元素进行成分优化，除了基础培养基以外（1%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉），铁离子选择硫酸亚铁或者氯化亚铁，铜离子选择硫酸铜或者氯化铜，锌离子选择硫酸锌或者氯化锌，锰离子选择硫酸锰或者氯化锰；四种金属离子的浓度均选择5g/L。

从米曲霉菌株A02的平板上洗下孢子悬液浓度10⁷个/mL，加入不同金属元素组合的富集培养基中，培养温度为28℃，转速200 rpm，培养120h。

培养120h后，12000rpm离心10min, 收集菌体；菌体用蒸馏水洗涤3次，收集的菌体用真空冷冻干燥至绝干。采用电感耦合等离子体-质谱法测定米曲霉菌体中铜铁锰锌元素的含量，从表1结果可以看出，金属元素富集培养基最优的金属离子选择为硫酸铜，硫酸亚铁，硫酸锰，和硫酸锌；金属离子浓度均为5g/L，在这个富集培养条件下，铜铁锰锌金属元素有机转化效率最高。米曲霉菌体蛋白中铁含量高达68840ppb，锌含量高达11572ppb，铜含量高达21610 ppb ，锰含量16125 ppb。

在上述最优的金属元素富集培养基条件下，富集铜铁锰锌金属元素后米曲霉菌体测定氨基酸含量，菌体氨基酸含量采用A200型amino Nova氨基酸分析仪进行测定。测定结果如下表和图1所示，结果表明菌体总氨基酸含量为43.07%，八种必需氨基酸（标*）在总氨基酸中占比为40.4%，从菌体氨基酸组成的角度也说明富集金属元素后米曲霉菌体蛋白为优质蛋白。

实施例3：低值原料开发新型富集金属元素的单细胞蛋白产品

分别取低值原料（玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣），按照料水比1:2.5加入水，添加5%硫酸铁（w/w），5%硫酸铜（w/w），5%硫酸锌（w/w），5%硫酸锰（w/w）作为初始金属元素，形成低值原料固态发酵的培养基。米曲霉A02和黑曲霉60B-3DW种子液均按照10%接种量(即1：1配比)添加至低值原料固态发酵的培养基表面，30℃下培养96小时。培养后水洗固体部分3次，烘干至绝干，测定其总氮含量、粗蛋白含量、氨基酸含量、金属元素含量如下表所示。

由此可知，混和固态发酵针对三种低值原料（玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣），单细胞蛋白中粗蛋白含量均超过29%，氨基酸含量均超过24%，实现农业废弃物资源变废为宝。同时低值原料来源的饲用蛋白中铁含量均超过30000ppb，铜含量均超过10000ppb，锰含量均超过8000ppb，锌含量均超过6000ppb，饲料蛋白中有机铜铁锰锌含量均大幅度增加，大幅度提高了饲料的品质。

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种米曲霉菌株在富集铜铁锰锌中的应用

<160> 1

<210> 1

<211> 623

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus oryzae）

<400> 1

GACGCTCGTAAGATCTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAATCTTCCTGTG 623

Claims

1.一种米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株A02在富集铜、铁、锰和/或锌中的应用，其特征在于，所述米曲霉菌株A02的保藏号为：CGMCC No.40043。

2.一种微生物法富集铜、铁、锰和/或锌的方法，其特征在于，添加无机铜、铁、锰和/或锌离子的培养基培养保藏号为：CGMCC No.40043的米曲霉菌株A02。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，培养基中添加铜、铁、锰和锌离子分别为硫酸铜，硫酸亚铁，硫酸锰和硫酸锌的形式添加，添加的重量均为每升培养基5-10g。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，其培养温度为26℃~32℃，转速180~200rpm，培养60-180h。

5.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，还包括收集培养后得到的菌体。

6.如权利要求2至5任一项所述的方法获得的米曲霉菌株A02菌体。

7.一种富集金属元素的单细胞蛋白产品的方法，其是以米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株A02和黑曲霉(Aspergillus niger) 60B-3DW混和菌在添加有硫酸铁，硫酸铜，硫酸锌和/或硫酸锰作为初始金属元素的木质素原材料培养基上发酵，得到富集金属元素的单细胞蛋白及分离所述单细胞蛋白的步骤，其中所述米曲霉菌株A02的保藏号为：CGMCCNo.40043；所述黑曲霉60B-3DW保藏号为：CGMCC No.22465。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述木质素原材料是秸秆类原材料，粕类原材料，或其混合物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述秸秆类原材料是玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣及其混合物。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣按照料水比1:2-3加入水，添加2-8%硫酸铁（w/w），2-8%硫酸铜（w/w），2-8%硫酸锌（w/w）或2-8%硫酸锰（w/w）作为初始金属元素。