CN112494521A - 一种菌铁复合物的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种菌铁复合物的制备方法，包括如下步骤：(1)对菌体进行活化、离心，将离心后的菌体与铁离子溶液进行混合、富集；(2)将富集后的菌体溶液离心、清洗、烘干、消化，得到所述的菌铁复合物。本发明所述的一种菌铁复合物的制备方法通过制备富铁益生菌，对DSS诱导的结肠炎小鼠进行干预，富铁益生菌结合了铁与益生菌的双重优点，既能达到补铁的效果，又能起到缓解结肠炎的作用。

Description

一种菌铁复合物的制备方法及应用
技术领域
本发明属于食源性益生菌的技术领域，尤其是涉及一种菌铁复合物的制备方法及应用。
背景技术
炎性肠病(IBD)已成为一个影响人民健康的全球性问题，其中欧洲和北美的患病率最高，这两地区以及大洋洲的许多国家患病率超过0.3％，自1990年以来，非洲、亚洲和南美的新兴工业国家及地区的IBD发病率逐年上升，而中国的发病率是亚洲增长最快的国家，且发病率呈现逐年上升的趋势。在25％的IBD患者中有不同类型的肠外并发症，如贫血、结节性红斑、斑秃等。这些并发症对IBD患者的生活质量有严重影响，但是人们往往只重视疾病的突出外在表现，对并发症症状没有足够重视，事实上并发症也会加重患者的疾病症状，延长治愈时间。
IBD贫血是最常见的并发症，其发病机制是多因素的，主要原因是发炎的黏膜肠道失血和膳食铁吸收受损导致的。在炎症状态下，炎性细胞因子通过诱导肝脏表达铁调素(hepcidin)而损害机体对铁的吸收，铁调素是维持机体铁含量在相对稳定状态的一种关键性的负性调控因子，铁调素主要通过调节十二指肠对铁的吸收、巨噬细胞铁释放和肝脏存储铁的释放这三方面抑制铁离子进入循环。铁转运蛋白(FPN)主要存在于肠上皮、巨噬细胞和肝细胞中，铁转运蛋白能够将铁从细胞转运至循环中，以维持全身铁需求。铁调素的作用靶点正是铁转运蛋白。在炎症状态下，肝脏分泌的铁调素靶向铁转运蛋白导致铁转运蛋白内化并降解，从而阻断了细胞铁排出到血清，导致铁的可用性降低甚至贫血。贫血的一些症状如呼吸困难和心跳过快对患者的生活质量有着重大的影响。目前常采用补充铁制剂来平衡铁摄入和损失，硫酸亚铁是口服铁制剂中最常用的治疗和预防缺铁性贫血的药物，而服用硫酸亚铁对肠胃会产生一定刺激，常伴有恶心，呕吐，腹泻等反应。因此，开发新型铁补充剂一直是研究人员的关注热点，酵母铁，多糖铁，真菌铁等多种新形式的铁为解决临床上的问题提供了多种选择。
益生菌是指当摄入足够数量时，能够对机体产生健康效应的一类活的微生物。益生菌发挥健康效应的作用机制是多种因素的共同作用结果，可能是与宿主菌群相互作用，产生抗微生物产物，也可能是与宿主细胞相互作用，刺激产生影响系统的小分子物质。日前，大量文献报道了益生菌对肠道性疾病的积极作用，如乳酸杆菌和双歧杆菌能通过抑制炎症因子表达，促进紧密连接蛋白表达，调节肠道菌群等，达到缓解结肠炎症状的作用。
目前，微生物富集铁研究主要集中在富铁真菌上，如米曲霉铁，酵母铁等，但还未见富铁益生菌的功能特性报道。因此，理想状态希望通过益生菌富集铁元素，达到既可以缓解炎症，又可以补铁的作用。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种菌铁复合物的制备方法及应用。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种菌铁复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)对菌体进行活化、离心，将离心后的菌体与铁离子溶液进行混合、富集；
(2)将富集后的菌体溶液离心、清洗、烘干、消化，得到所述的菌铁复合物。
进一步，所述的步骤(1)中的菌体采用益生菌；优选的，所述的菌体采用消化乳杆菌；所述的菌体的密度为5-10g/L；优选的，所述的菌体的密度为10g/L。
进一步，所述的步骤(1)中的离心步骤的时间为5-15min；优选的，所述的离心步骤的时间为10min；所述的铁离子溶液为FeSO4·7H2O水溶液；所述的FeSO4·7H2O水溶液的浓度为0.1-2mg/mL；优选的，所述的FeSO4·7H2O水溶液的浓度为0.2mg/mL。
进一步，所述的步骤(1)中的富集步骤的温度为10-37℃，转速为150-200rpm，时间为15-240min；优选的，所述的富集步骤的温度为37℃，转速为200rpm，时间为120min。
进一步，所述的步骤(2)中的消化步骤的消化液为高氯酸和硝酸的混合液；所述的高氯酸和硝酸的体积比为1:15-20；优选的，所述的高氯酸和硝酸的体积比为1:20。
进一步，所述的步骤(2)中的离心步骤的时间为5-15min；优选的，所述的离心步骤的时间为10min；所述的烘干步骤的温度为50-60℃；优选的，所述的烘干步骤的温度为60℃。
一种菌铁复合物的制备方法在炎症性贫血中的应用。
传统的补铁方式常常会对肠胃会产生一定刺激，并伴有恶心，呕吐，腹泻等反应。本发明所述的菌铁复合物通过制备富铁益生菌，通过灌胃结肠炎小鼠富铁益生菌，借助生物成像探索益生菌在小鼠体内的作用机制，对结肠炎小鼠既起到补铁又能缓解结肠炎症的作用。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的菌铁复合物的制备方法通过制备富铁益生菌，对DSS诱导的结肠炎小鼠进行干预，富铁益生菌结合了铁与益生菌的双重优点，既能达到补铁的效果，又能起到缓解结肠炎的作用。
附图说明
图1为本发明实施例所述的16srDNA测序结果；
图2为本发明实施例所述的富铁条件优化图：A为FeSO4·7H2O水溶液的浓度，B为Fe2+含量，C为温度，D为时间，E为菌铁复合物在胃液中的稳定性，F为菌铁复合物在肠液中的稳定性；
图3为本发明实施例所述的富铁菌株体内成像示踪图：A为消化乳杆菌NKU556和消化乳杆菌NKU556Fe在小鼠全身发光亮度信号，B为小鼠粪便发光亮度信号；
图4本发明实施例所述的富铁菌株对DSS诱导小鼠结肠炎症状的影响：A为小鼠疾病活动指数变化(DAI)，B为小鼠体重变化，C为小鼠结肠长度变化，D为小鼠结肠组织评分，E为健康小鼠结肠组织切片，F为模型小鼠结肠切片，G为消化乳杆菌NKU556菌干预小鼠结肠切片，H为FeSO4干预的小鼠结肠切，J为消化乳杆菌NKU干预的小鼠结肠切片；
图5本发明实施例所述的富铁菌株对DSS诱导小鼠结肠炎症因子表达的影响图：A为结肠IL-6相对表达量，B为结肠IL-17相对表达量，C为结肠IL-1β相对表达量，D为结肠TNF-α相对表达量，E为结肠lipocalin2相对表达量，F为结肠紧密连接蛋白相对表达量，G为结肠hepcidin相对表达量；
图6本发明实施例所述的富铁菌株对DSS诱导小鼠铁吸收的影响图：A为小鼠肝脏铁含量，B为小鼠脾脏铁含量，C为小鼠血清铁含量，D为肝脏hepcidin相对表达量，E为肝脏FPN1相对表达量，F为十二指肠FPN1相对表达量。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种菌铁复合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株来自于南开大学医学院食品科学与健康实验室保存。通过16SrDNA测序鉴定该菌株，取富铁菌株基因组DNA，利用PCR扩增16s片段，测序目的片段并进行BLAST比对，16srDNA测序结果用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，该菌株与消化乳杆菌亲缘关系最近，相似性达100％，因此，鉴定为消化乳杆菌，命名为消化乳杆菌(Lactobacillusalimentarius)NKU556；
(2)将消化乳杆菌NKU556培养过夜，菌体密度为10g/L，取8000g培养好的消化乳杆菌NKU556离心10min，将离心后的菌体与0.2mg/mL、100mL FeSO4·7H2O水溶液(铁含量为6mg)进行混合、富集，孵育条件为37℃，200rpm孵育2h；
(3)将富集后的菌体溶液离心、蒸馏水清洗2遍、60℃烘干、消化，消化液中高氯酸和硝酸混合的比例为1:20，得到所述的菌铁复合物，用蒸馏水稀释消化液并用原子吸收分光光度计测定铁含量；
(4)体内成像示踪益生菌和富铁益生菌在小鼠体内的转移定植：将含有纳米荧光素酶基因的重组质粒导入5×109CFU消化乳杆菌中，连续7天灌胃标记的消化乳杆菌，第7天和第8天解剖小鼠，肠道成像；
(5)富铁消化乳杆菌NKU556对DSS诱导的结肠炎小鼠进行干预：第1天到第7天小鼠饮用含4％DSS的水，第4天到第10天每天灌胃5×109CFU富铁消化乳杆菌NKU556，第10天解剖小鼠，测定测定炎症指标有结肠长度、小鼠体重、结肠炎症因子表达量、结肠切片，贫血指标有血清铁，肝脏铁，脾脏铁含量，以及铁吸收相关基因表达。
通过炎症指标可知，菌铁复合物能明显缓解小鼠炎症症状，且通过贫血指标了解该复合物还起到补铁的作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种菌铁复合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)对菌体进行活化、离心，将离心后的菌体与铁离子溶液进行混合、富集；
(2)将富集后的菌体溶液离心、清洗、烘干、消化，得到所述的菌铁复合物。
2.根据权利要求1所述的菌铁复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的菌体采用益生菌；优选的，所述的菌体采用消化乳杆菌；所述的菌体的密度为5-10g/L；优选的，所述的菌体的密度为10g/L。
3.根据权利要求1所述的菌铁复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的离心步骤的时间为5-15min；优选的，所述的离心步骤的时间为10min；所述的铁离子溶液为FeSO4·7H2O水溶液；所述的FeSO4·7H2O水溶液的浓度为0.1-2mg/mL；优选的，所述的FeSO4·7H2O水溶液的浓度为0.2mg/mL。
4.根据权利要求1所述的菌铁复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的富集步骤的温度为10-37℃，转速为150-200rpm，时间为15-240min；优选的，所述的富集步骤的温度为37℃，转速为200rpm，时间为120min。
5.根据权利要求1所述的菌铁复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的消化步骤的消化液为高氯酸和硝酸的混合液；所述的高氯酸和硝酸的体积比为1:15-20；优选的，所述的高氯酸和硝酸的体积比为1:20。
6.根据权利要求1所述的菌铁复合物的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中的离心步骤的时间为5-15min；优选的，所述的离心步骤的时间为10min；所述的烘干步骤的温度为50-60℃；优选的，所述的烘干步骤的温度为60℃。
7.一种菌铁复合物的制备方法在炎症性贫血中的应用。
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