CN114456990B

CN114456990B - 一种ddgs的制备方法及其发酵菌种和培养基

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Publication number: CN114456990B
Application number: CN202210299875.0A
Authority: CN
Inventors: 吴亮亮; 朱卫华; 付丽霞; 铁勇; 张永佳; 王吉玮; 齐小琴; 彭逸博; 马文有; 李巧亮; 高晓航; 王宁; 孟刚; 赵春光
Original assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Current assignee: Ningxia Eppen Biotech Co ltd
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2042-03-25
Also published as: CN114456990A

Abstract

本发明公开了一种DDGS的制备方法及其发酵菌种和培养基。本发明具体地公开了在培养基中发酵培养复合菌剂制备DDGS的方法，其中所述复合菌剂包括乳杆菌(乳杆菌YPLL01)、酵母菌(酿酒酵母YPSC01)和枯草芽孢杆菌。本发明通过筛选得到高产乙酸、乳酸、高产蛋白酶的乳杆菌具有替代抗生素的作用，并能提高产酶量，增大酶活性，与筛选得到的产酒精能力好、耐酸性强的酿酒酵母作为复合菌剂组成成分，通过进一步优化固态发酵培养基，制备得到优质的DDGS，进一步可作为高蛋白、低纤维、富含氨基酸、小肽、甘露聚糖等营养价值丰富且具有降低肠道有害菌、提高有益菌，改善肠道内环境的功能性饲料。

Description

一种DDGS的制备方法及其发酵菌种和培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种DDGS的制备方法及其发酵菌种和培养基。

背景技术

玉米DDGS(Distillers Dried Grains with Solubles)，也叫玉米干酒糟及其可溶物，由DDG(Distillers Dried Grains，干酒精糟)及DDS(Distillers Dried Souble，可溶性酒精糟滤液)组成，是以玉米为主要原料发酵制取乙醇的过程中对糟液进行加工处理后而获得的玉米酒精糟及残液干燥物，其蛋白质、脂肪含量较高，富含必需脂肪酸，特别是亚油酸，较高的脂肪使得DDGS的能量相对较高；同时，DDGS的氨基酸、维生素和矿物质元素丰富，还有未知的促生长因子，有利于动物的生长，此外，DDGS中的粗纤维含量也较高，对反刍动物非常有利。由于DDGS的蛋白质含量在26％以上，已成为国内外饲料生产企业广泛应用的一种新型蛋白饲料原料，在畜禽及水产配合饲料中通常用来替代豆粕、鱼粉，并且可以直接饲喂反刍动物。

近年来，我国的工业用燃料乙醇生产量大幅度增加，来自玉米乙醇生产的DDGS饲料量也在扩大。传统的DDGS生产工艺是将玉米生产酒精剩余的固形物进行过滤分离，烘干后得到的产品，仅作为蛋白饲料进行出售。随着饲料中长期大量地添加抗生素及化学合成药物，在养殖生产中，动物体内病原微生物产生耐药性，动物体内有益菌被抑制，菌群失调，形成内源性感染。因此，有必要开发安全无污染无药物残留的优质DDGS饲料，提高DDGS作为饲料的利用价值，实现低附加值DDGS向高附加值产品的转化和DDGS蛋白饲料资源的综合利用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何使用玉米深加工副产物制备优质DDGS，实现低值饲料资源的高附加值转化。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种制备DDGS的方法，所述方法包括在培养基中发酵培养复合菌剂，所述复合菌剂包括乳杆菌和酵母菌，所述乳杆菌可为乳杆菌(Lactobacillus sp.)YPLL01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24328。

上述方法中，所述酵母菌可为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPSC01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24325。

上述方法中，所述复合菌剂还可包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌可为枯草芽孢杆菌菌粉，如购买自山东蔚蓝生物的成品菌粉。

上述方法中，所述复合菌剂的活性成分可为所述酵母菌、所述乳杆菌和所述枯草芽孢杆菌。

上述方法中，所述复合菌剂可为酵母菌YPSC01菌液、乳杆菌YPLL01菌液和枯草芽孢杆菌菌液按照比例混合得到的复合菌液，所述复合菌液中酵母菌YPSC01菌液、乳杆菌YPLL01菌液和枯草芽孢杆菌菌液的体积比可为(2-5):(1-4):(1-4)。

进一步地，所述(2-5):(1-4):(1-4)可为(2-5):(1-4):3、(2-5):3:3、4:3:3、5:3:3、3:3:3、2:3:3、5:3:2或5:4:2但不限于此。

进一步地，所述酵母菌YPSC01菌液可为酵母菌YPSC01的种子发酵液；所述乳杆菌YPLL01菌液可为乳杆菌YPLL01的种子发酵液；所述枯草芽孢杆菌菌液可为枯草芽孢杆菌成品菌粉的溶液。

进一步地，所述酵母菌YPSC01菌液的制备方法可为：将酵母菌YPSC01接种于液体发酵培养基(种子发酵培养基)中，30℃、180r/min振荡培养20小时，收集发酵液，该发酵液即为酵母菌YPSC01液体菌种(即酵母菌液)。该酵母菌YPSC01液体菌种中酵母菌YPSC01含量为3×10⁸cfu/ml。其中酵母菌YPSC01的种子发酵培养基的组成为葡萄糖40g/L、酵母抽提物10g/L、硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，其余为水，pH为5.0。

进一步地，所述乳杆菌YPLL01菌液的制备方法可为：将乳杆菌YPLL01接种于液体发酵培养基(种子发酵培养基)中，37℃、180r/min振荡培养18小时，收集发酵液，该发酵液即为乳杆菌YPLL01液体菌种(即乳杆菌液)。该乳杆菌YPLL01液体菌种中乳杆菌YPLL01含量为3×10⁹cfu/ml。其中乳杆菌YPLL01的种子发酵培养基为MRS液体培养基。

进一步地，枯草芽孢杆菌液的制备方法可为：将枯草芽孢杆菌菌粉按照1:30的比例加入到含有2％糖蜜的温水(30-35℃)中活化1h，得到枯草芽孢杆菌液。制备的枯草芽孢杆菌液中枯草芽孢杆菌含量为2×10¹⁰cfu/ml。

进一步地，所述枯草芽孢杆菌菌粉可为购买的成品菌粉，如购自山东蔚蓝生物的成品菌粉。

上述方法中，所述复合菌剂中所述酵母菌、所述乳杆菌和所述枯草芽孢杆菌的菌落形成单位(cfu)比可为3:30:200。

所述复合菌液中，酵母菌YPSC01的含量可为3×10⁸cfu/ml；乳杆菌YPLL01的含量可为3×10⁹cfu/ml；枯草芽孢杆菌的含量可为2×10¹⁰cfu/ml。

上述方法中，所述培养基可为固态培养基，所述固态培养基包括玉米喷浆纤维和玉米糖渣。

上述方法中，所述固态培养基可为下述A1)、A2)或A3)：

A1)包括下述质量百分比的组分的固态培养基：玉米喷浆纤维21％-36％、玉米糖渣50％；玉米芯粉0-15％；

A2)包括下述质量百分比的组分的固态培养基：玉米喷浆纤维21％、玉米糖渣50％和玉米芯粉15％；

A3)包括下述质量百分比的组分的固态培养基：玉米喷浆纤维36％和玉米糖渣50％。

进一步地，上述方法中，所述复合菌剂中所述酵母菌、所述乳杆菌、所述枯草芽孢杆菌菌液的接种量可分别为酵母菌40ml、乳杆菌30ml、枯草芽孢杆菌30ml，所述的菌液可为种子发酵液。

根据本文中任一所述的制备DDGS的方法制备得到的DDGS或含有所述DDGS的饲料也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了根据本文中任一所述的制备DDGS的方法制备得到的DDGS在制备功能性饲料中的应用。

本文中任一所述的复合菌剂也在本发明的保护范围内。

所述乳杆菌(Lactobacillus sp.)YPLL01或所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YPSC01也在本发明的保护范围内。

在本发明的一个实施方案中，所述制备DDGS的方法包括如下步骤：

玉米糖渣经双轴绞龙打散输送至高速混合器中，同时将玉米喷浆纤维及玉米芯粉投入到高速混合器中，充分混合均匀，经万能粉碎机粉碎后与复合菌液进行混合，混合后的物料进入自控连续发酵床进行发酵，发酵后的物料进行低温快速烘干，再经流化床冷却后进行粉碎包装。

其中复合菌液(酵母菌液、乳杆菌液、枯草芽孢杆菌液)的制备方法如下：

(1)乳杆菌液的制备：将乳杆菌YPLL01接种于装有500ml的液体发酵培养基(种子发酵培养基)的三角瓶中，37℃、180r/min振荡培养18小时，收集发酵液，该发酵液即为乳杆菌YPLL01液体菌种(即乳杆菌液)。该乳杆菌YPLL01液体菌种中乳杆菌YPLL01含量为3×10⁹cfu/ml。

其中乳杆菌YPLL01的种子发酵培养基为MRS液体培养基。

(2)酵母菌液的制备：将酵母菌YPSC01接种于装有500ml的液体发酵培养基(种子发酵培养基)的三角瓶中，30℃、180r/min振荡培养20小时，收集发酵液，该发酵液即为酵母菌YPSC01液体菌种(即酵母菌液)。该酵母菌YPSC01液体菌种中酵母菌YPSC01含量为3×10⁸cfu/ml。

其中酵母菌YPSC01的种子发酵培养基为葡萄糖40g/L、酵母抽提物10g/L、硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾1g/L，调节pH到5.0，121℃灭菌30min。

(3)枯草芽孢杆菌液的制备：将购置的枯草芽孢杆菌菌粉按照1:30的比例加入到含有2％糖蜜的温水(30-35℃)中活化1h，制备的枯草芽孢杆菌液中枯草芽孢杆菌含量为2×10¹⁰cfu/ml。

(4)复合菌液的制备

复合菌液是将步骤(1)、(2)、(3)中制备的乳杆菌液、酵母菌液和枯草芽孢杆菌液按照比例混合后得到的混合物。其中复合菌液中酵母菌液、乳杆菌液和枯草芽孢杆菌液的添加体积比可为4:3:3。

实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：

(1)传统DDGS生产工艺是将玉米生产酒精剩余的固形物进行过滤分离，烘干后得到的产品，仅作为蛋白饲料进行出售；而本专利所述的DDGS的制备是将玉米加工副产物(玉米喷浆纤维、玉米芯粉和玉米糖渣)进行废物利用，同时加入有益菌最终得到高蛋白、低纤维、富含氨基酸、小肽、甘露聚糖等营养价值丰富且具有降低肠道有害菌、提高有益菌，改善肠道内环境的功能性饲料。

(2)本发明通过代谢原理和基因工程对发酵菌种进行筛选，得到的高产乙酸、乳酸、高产蛋白酶的益生菌，从而具有替代抗生素的作用，并能提高产酶量，增大酶活性，加强抗菌肽类物质对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌抑制作用。

(3)酵母菌的耐酸性能是酵母菌益生性的重要衡量指标。酸性环境可抑制有害菌生长，益生性菌株在被动物摄入后若要发挥其益生性作用，就要耐受动物胃液的强酸。本发明筛选出的酿酒酵母YPSC01产酒精能力好、耐酸性强，可在低酸环境正常生长，用于发酵饲料时可有效规避杂菌污染，有益于饲料发酵。

(4)通过优化固态发酵培养基，对最优发酵条件下饲料的营养价值进行分析表明，本发明制备的DDGS中，粗蛋白质≥28％，粗脂肪>8％，氨基酸≥26％，小肽≥17％，酵母菌量≥2.0×10⁸，粗纤维≤6％，粗灰分≤4％，甘露聚糖≥0.5％。

(5)本发明使用玉米深加工副产物生产优质DDGS，可实现低值饲料资源的高附加值转化。

保藏说明

菌种名称：乳杆菌

拉丁名：Lactobacillus sp.

分类命名：乳杆菌(Lactobacillus sp.)

菌株编号：YPLL01

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年01月17日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.24328

菌种名称：酿酒酵母

拉丁名：Saccharomyces cerevisiae

分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

菌株编号：YPSC01

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2022年01月17日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.24325

附图说明

图1为菌株H5 ARTP诱变致死率曲线图。

图2为诱变株(H5-1、H5-2、H5-3、H5-4、H5-5、H5-6和H5-7)和对照菌株H5产酸复筛结果图。

图3为菌株H5-6连续传代7代稳定性情况。

图4为实施例1中菌株H5-6牛津杯抑菌试验结果图。

图5为菌株H5-6的形态鉴定结果图。其中图5中A为菌株H5-6的菌体形态图，图5中B为菌株H5-6的菌落形态图。

图6为酿酒酵母TTC初筛平板示意图。

图7为酵母菌株LW4 16srDNA PCR产物琼脂糖电泳图。

图8为基于16srDNA测序构建酵母菌株系统发育树。

图9为DDGS的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的乳杆菌(Lactobacillus sp.)YPLL01 CGMCC No.24328已于2022年01月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNo.24328。乳杆菌(Lactobacillus sp.)YPLL01，简称为乳杆菌YPLL01。

下述实施例中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPSC01 CGMCC No.24325已于2022年01月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCCNo.24325。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPSC01，简称为酿酒酵母YPSC01。

实施例1、菌种的筛选

一、乳杆菌的筛选鉴定及生物学特性

乳杆菌从反刍动物断奶仔牛的瘤胃液中培养筛选。

1、乳杆菌的筛选及高产酸菌株的诱变选育

1-1、培养基

MRS液体培养基和MRS琼脂培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

酪蛋白固体培养基的配制：酪蛋白10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，Na₂HPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，琼脂18g，加蒸馏水定容至1000mL，pH 7.3±0.2，121℃、0.1MPa灭菌15min。

MRS-CaCO₃培养基的配制：MRS琼脂培养基溶解后加入2％的碳酸钙，121℃、0.1MPa灭菌15min。

1-2、菌株的分离纯化

稀释平板法分离纯化乳杆菌步骤：取瘤胃液25mL于225mL无菌水中，振荡摇匀，依次稀释至10^-6。分别取各浓度稀释液100μL，均匀涂布于含2％CaCO₃的MRS琼脂培养基平板上，37℃培养48h。挑取有溶钙圈的单菌落，进行分离纯化。菌株经重复纯化3次后转接至MRS琼脂培养基斜面，于4℃保藏备用。

1-3、菌株形态及代谢活性分析

菌株的形态特征鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)操作。

过氧化氢酶试验：滴加3％H₂O₂于细菌培养物的试管中，产生气泡为阳性，否则为阴性。产蛋白酶试验：将菌株接种于酪蛋白固体培养基上，观察有无透明圈及透明圈的大小。

通过在含有2％CaCO₃的MRS琼脂培养基上进行溶钙圈和形态观察，从2种样品中共分离出潜在乳杆菌12株，经革兰氏染色和过氧化氢酶检测，所得菌株均为革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性，初步鉴定为疑似乳杆菌。

1-4、菌株产酸量的测定

采用滴定法测定分离得到的12株菌株的产酸能力。菌株产酸能力测定结果表明，12株乳酸菌的产酸量在13～30g/L之间，其中菌株D2的产酸量最高，达28.56g/L；菌株H1、H2、H3、F1、F3、F4、F5等7株菌的产酸量在18～26g/L之间；其余菌株产酸量则较低，在13.7g/L左右。

1-5、菌株蛋白酶活力的测定

采用Folin-酚法测定菌株的蛋白酶活性。

通过酪蛋白培养基从12株乳杆菌中筛选出透明圈直径较大的5株菌：H1、H3、F1、F3、D1，通过测定其蛋白酶活性可知，菌株H5的蛋白酶活力最高，达38.37U/mL；其次为F1，为33.12U/mL；而F5蛋白酶活力最低，仅为6.12U/mL。因此，试验选取高产蛋白酶且产酸能力较弱的菌株H5，进行诱变选育。

1-6、ARTP诱变选育乳杆菌

利用常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)诱变对菌株H5进一步改造，从而筛选出高产酸的突变菌株。步骤如下：无菌条件下，取10μL稀释好的菌悬液，均匀涂于无菌金属载片表面，以氦气为工作气体，设置电源功率120W、射频功率13W、间距2mm、气流量10L/min，处理时间分别为0、20、40、60、80、100s。处理完的载片置于装有MRS液体培养基的EP管中，进行振荡洗脱，形成新的菌悬液。对新的菌悬液进行适当稀释，取100μL涂布于MRS固体培养基(即MRS琼脂培养基)上，37℃培养2～3天，每个处理设置3个平行组，计算致死率(图1)。

结果如图1所示，随着处理时间递增，诱变20s后致死率大幅度上升，至处理60s时致死率已经达91.09％，处理80s时，菌株存活率几乎为零。一般而言，当致死率在90％以上时，菌株产生高产突变的概率较高，且在此突变率下回复性更小。因此，考虑到突变稳定性，最终选择ARTP诱变处理的时间为60s。

1-7、诱变菌株的筛选和遗传稳定性试验

从诱变菌中随机挑选单菌落，点接到含2％CaCO₃的MRS琼脂培养基(MRS-CaCO₃培养基)上，并以原始菌作对照，37℃培养24～48h。通过测定并统计每个菌落的HC值(HC值＝溶钙圈直径/菌落直径)及该菌株的产酸量，筛选高产酸的突变菌株。

将筛选出的突变乳杆菌株以2％(v/v)接种于发酵培养基(即MRS液体培养基)，37℃、150r/min振荡培养3天，以此作为1次传代培养，并以每代的发酵液作为下一次传代的种子液，连续传代7次，测定其每一代的产酸能力，每代设置3个重复，从而验证菌株的突变性能是否能够稳定遗传。

以菌株H5作对照，其菌落的平均HC值为3.231，根据MRS-CaCO₃培养基的溶钙圈大小初步挑选出较对照菌株H5明显变大及变小的菌株62株，同时将菌株重新点接于MRS-CaCO₃培养基上测定其溶钙圈直径，进一步得到溶钙圈直径较对照株有差异的突变株，并重新编号，结果见表1。将超出对照HC值40％的菌株定义为正突变菌株，否则为负突变菌株，最终得到一株HC值为5.023的高产酸突变菌株H5-6。

表1代表菌株的平板初筛结果

菌株	溶钙圈直径/mm	菌落直径/mm	HC
				H5(CK)	7.12±0.54	2.10±0.32	3.231
H5-1(60S)	8.52±0.42	2.04±0.21	4.176
				H5-6(60S)	15.17±0.32	3.02±0.11	5.023
H5-5(60S)	9.24±0.53	2.22±0.32	4.162
				H5-7(60S)	12.02±0.45	2.88±0.22	4.174
H5-2(60S)	6.74±0.53	2.04±0.21	3.304
				H5-4(60S)	4.02±0.60	2.82±0.23	1.425
H5-3(60S)	3.04±0.63	2.02±0.23	1.505

摇瓶复筛：将诱变株(H5-1、H5-2、H5-3、H5-4、H5-5、H5-6和H5-7)以及对照菌株H5分别通过液体发酵培养，测定其平均产酸量，结果如图2所示。由图2可知，菌株H5-6的产酸量最高，为23.41g/L，与初筛结果一致。

将突变乳杆菌菌株H5-6连续传代7次，测定其每一代的产酸能力，结果见图3。由图3可知，正向突变株H5-6经7次传代培养后，其平均产酸量依次为22.76、23.12、22.34、23.45、22.56、24.12、23.33g/L，平均值为23.09g/L。由此可见，突变株的酸产量稳定。

1-8、抑菌试验

参照SN/T 1005-2001中的牛津杯抑菌试验方法进行相关实验。通过牛津杯琼脂扩散法测定目的菌株的抑菌作用，结果显示，乳杆菌菌株H5-6对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌都有一定的抑制作用(图4)。

2、菌种保藏

筛选鉴定出的高产蛋白酶、高产酸、稳定性好的乳杆菌菌株H5-6，命名为乳杆菌(Lactobacillus sp.)YPLL01，已于2022年01月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.24328。

3、菌株鉴定

筛选获得的1株优良乳杆菌经MRS平板培养，其菌落特征和显微镜下菌体形态特征如图5所示，为菌株H5-6的菌体形态镜检照片和菌落形态照片。具体菌体形态、菌落特征及革兰氏染色和触媒试验的结果见表2。

表2菌株鉴定

由表2可知，H5-6株菌的触媒试验为阴性，符合乳杆菌的特征。

二、酿酒酵母的筛选鉴定及生物学特性研究

酿酒酵母从反刍动物断奶仔牛的瘤胃液中培养筛选。

1、酿酒酵母的筛选

1-1、培养基的配制

分离培养基的配制：采用YEPD培养基，115℃灭菌20min。YEPD培养基的组成为葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L，pH 5.0。

形态鉴定培养基的配制：采用WL培养基，121℃灭菌20min。WL培养基的配制方法为：酵母浸粉4.0g、葡萄糖50.0g、氯化钾0.425g、氯化钙0.125g、硫酸镁0.125g、磷酸二氢钾0.55g、氯化铁0.0025g、硫酸锰0.0025g、溴甲酚绿0.022g、琼脂20.0g、酸水解酪蛋白5.0g、4mg放线菌酮，加入蒸馏水定容至1000ml，pH值5.5±0.2。

高粱汁培养基的配制：麦芽汁40g、蛋白胨3.5g、酵母粉3g、磷酸氢二钾2g、硫酸铵1g、硫酸镁1g、pH 5.0。

TTC培养基的配制：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂7.5g，水500ml，121℃灭菌20min，无菌环境加入0.25g TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)。

1-2、菌株的分离与初筛

稀释平板法分离纯化酿酒酵母步骤：取瘤胃液25mL于225mL无菌水中，振荡摇匀，依次稀释至10^-6。分别取各浓度稀释液100μL，均匀涂布于YEPD培养基上，28℃培养48h。挑选符合酵母形态的单菌落菌株进行平板划线3次，获得纯种菌株。采用TTC培养基筛选，菌株颜色越深其产酒精能力越好，通过观察菌落颜色筛选产酒精能力较强的纯化菌株。将纯化菌株接种于WL培养基中，观察菌落形态，通过显微镜观察确定细胞结构，并对其进行初步分类。将纯化的菌株转移到YEPD斜面培养基上培养，待菌株菌落生成后，置于4℃冰箱保藏(图6)。

YEPD富集培养基上挑取68株菌种作进一步分离纯化，分别编号为LW 1～LW68，根据酵母菌的生长情况挑选出6株活性较强的酵母菌LW 1、LW4、LW6、LW11、LW21、LW34。

1-3、耐酸性酵母菌的复筛

将步骤1-2分离纯化的菌株LW 1、LW4、LW6、LW11、LW21、LW34接种于YEPD液体培养基中，28℃恒温培养1天，调整种子活化液浓度为1×10⁷CFU/ml，采用富含有机酸的黄水调节YEPD液体培养基的pH，设置差异酸度梯度为pH 3.0、3.5、4.0、4.5。以体积分数2％的接种量将活化液接种至差异酸度YEPD培养基中，同时空白对照，28℃恒温培养3天，利用紫外分光光度计测定560nm下菌液的OD值，OD值越大，酵母菌的生长活性越强，酵母菌的耐酸性越强。

同时以体积分数2％的接种量将活化液接种至差异酸度高粱汁培养基中，28℃恒温发酵9天，蒸馏后检测酒精度，每组进行3次重复。选取酸性环境下产酒精能力较高的酵母菌进行进一步研究。

通过耐酸性的实验，最终确定耐酸性最强的两株菌分别为LW4及LW11。

进一步对两株菌进行产酒精能力筛选，最终确定LW4为目标菌株。

1-4、耐酸性酿酒酵母的发酵小试分析

以玉米喷浆纤维、玉米糖渣为发酵原料，对发酵前后固体培养基的淀粉及还原糖质量分数进行检测分析，同时对空白组、试验组及对照组的糟醅进行蒸馏测其酒精度，相关结果如表3所示。

表3优良酵母菌发酵饲料的理化指标

注：小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

由表3可知，小试发酵后饲料中的淀粉及还原糖质量分数显著降低(P<0.05)，主要是依靠酵母菌及试验组添加的耐酸性酿酒酵母LW4的发酵作用。同时，酿酒酵母LW4试验组的饲料中淀粉和还原糖质量分数显著低于空白组及安琪酵母对照组(P<0.05)，而酿酒酵母LW4试验组中酒精含量显著高于空白组及安琪酵母对照组的(P<0.05)，其中淀粉质量分数较空白组降低了1％，残糖质量分数(即还原糖质量分数)较空白组降低了1.3％，主要是因为饲料pH在4左右，而酿酒酵母LW4能耐酸性为pH4，且在较低pH环境中能一定程度上进行发酵。综上，酵母菌LW4在发酵中能够加强残糖利用率，有效提高饲料中酒香味。

2、菌种保藏

筛选鉴定出的产酒精能力好、耐酸性强的酿酒酵母菌株LW4，命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPSC01，已于2022年01月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.24325。

3、菌株鉴定

如图7所示，菌株LW4的基因组18srDNA扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检验条带清晰。将测序结果与Genbank中酵母菌的18srDNA序列比对，构建系统发育树，如图8所示，菌株LW4与酿酒酵母(Saccharo-mycescerevisiae)同源性为100％，可确定该菌株为酿酒酵母。对该菌株进行菌落和细胞形态观察，菌落呈大小不一的乳白色凸起，边缘较整齐，挑起粘连，细胞形态呈卵圆形，一端或两端出芽。

实施例2、DDGS的制备

本实施例以实施例1中筛选出的乳杆菌(Lactobacillus sp.)YPLL01和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YPSC01为出发菌株，同时加入枯草芽孢杆菌作为发酵复合菌剂，三种菌种种子液添加体积比为(2-5):(1-4):(1-4)，以玉米芯粉、玉米喷浆纤维、玉米糖渣、玉米秸秆等为主料，添加少量的蛋白粉，优化发酵培养基和发酵条件，并进行验证试验，以期提高发酵水平，获得活菌含量较高的发酵饲料产品。

1、制备DDGS的方法

DDGS的工艺流程如图9所示，具体制备方法如下：

其中乳杆菌YPLL01的种子发酵培养基为MRS液体培养基。

(3)枯草芽孢杆菌液的制备：将枯草芽孢杆菌菌粉(购买自山东蔚蓝生物的成品菌粉)按照1:30的比例加入到含有2％糖蜜的温水(30-35℃)中活化1h，得到枯草芽孢杆菌液。该枯草芽孢杆菌液中枯草芽孢杆菌含量为2×10¹⁰cfu/ml。

(4)复合菌液的制备

复合菌液是将步骤(1)、(2)、(3)中制备的乳杆菌液、酵母菌液和枯草芽孢杆菌液按照比例混合后得到的混合物。其中复合菌液中酵母菌液、乳杆菌液和枯草芽孢杆菌液的添加体积比可为(2-5):(1-4):(1-4)。

进一步地，复合菌液中酵母菌液、乳杆菌液和枯草芽孢杆菌液的添加体积比可为(2-5):(1-4):3、(2-5):3:3、4:3:3、5:3:3、3:3:3、2:3:3、5:3:2或5:4:2但不限于此。

具体地，复合菌液中酵母菌液、乳杆菌液和枯草芽孢杆菌液的添加体积比可为4:3:3。

2、体外消化率的测定

干物质的体外消化率(DM-Dig)和粗蛋白体外消化率(CP-Dig)的测定步骤如下：

准确称取1.000g饲料样品于100ml具塞三角烧瓶中，加入10ml、3.0mg/ml、pH 2.0的胃蛋白酶(1:3000)溶液，37℃恒温振荡(180r/min)水解6h。取出后立即滴加少许10mol/1的NaOH溶液调节pH至中性，再加入50ml、0.5mg/ml、pH 7.6的胰蛋白酶(1:250)溶液，37℃恒温振荡(180r/min)水解8h。取出后用5％(w/v)TCA溶液分三次，每次5ml清洗三角瓶转入100ml离心管中，以沉淀未消化的大分子蛋白，空离心管事先编号并称重。在4℃8000g条件下离心20min，小心去除上清液，连同离心管一起置于60℃烘箱中烘干至恒重，记录离心管重，两次重量差即为残渔重量。将发酵原料与残渣一起利用凯氏定氮仪进行粗蛋白的测定。

干物质的体外消化率(DM-Dig)＝(M0-M1)/M0×100％

粗蛋白体外消化率(CP-Dig)＝(CP0×M0-M1×CP1)/(CP0×M0)×100％

M0—为初始样品称重，M0＝1.000g；

M1—为残渣重量，g；

CP0—为初始样品粗蛋白含量，％；

CP1—为残渣中粗蛋白含量，％。

3、粗蛋白含量的测定

参照国标GB/T 6432-2018《饲料中粗蛋白的测定》凯氏定氮法进行检测。

4、酵母活菌数的测定

参照国标GB/T 22547-2008《饲料添加剂饲用活性干酵母(酿酒酵母)》检测方法进行检测。

5、不同配比固体培养基对发酵的影响

采用不同配比的固体培养基按照步骤1的方法制备DDGS,按照步骤2、3、4的方法分别测定粗蛋白含量、酵母活菌数、DM-Dig和CP-Dig。

不同配比的固体培养基如下所示：

配方一：称取玉米喷浆纤维460g、玉米糖渣300g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水140ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

配方二：称取玉米喷浆纤维360g、玉米糖渣500g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

配方三：称取玉米喷浆纤维210g、玉米芯粉150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

配方四：称取玉米喷浆纤维210g、玉米秸秆150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

配方五：称取玉米喷浆纤维210g、玉米芯粉150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水50ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

配方六：称取玉米喷浆纤维250g、玉米芯粉250g，玉米糖渣等混合物300g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水100ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

配方七：称取玉米喷浆纤维250g、玉米秸秆250g，玉米糖渣等混合物300g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水100ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

配方八：称取玉米喷浆纤维250g、玉米芯粉250g，玉米糖渣等混合物300g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水110ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

选取不同菌种的组合作为对比例：

对比例1：称取玉米喷浆纤维210g、玉米芯粉150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)100ml，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

对比例2：称取玉米喷浆纤维210g、玉米芯粉150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)60ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)40ml，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

对比例3：称取玉米喷浆纤维210g、玉米芯粉150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)60ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)40ml，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

对比例4：称取玉米喷浆纤维210g、玉米芯粉150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的枯草芽孢杆菌液(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)100ml，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

对比例5：称取玉米喷浆纤维210g、玉米芯粉150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)100ml，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，进行样品检测。

6、结果分析

不同配比固体培养基对发酵效果的影响结果见表4。

表4采用不同配比固体培养基得到的DDGS中粗蛋白、酵母活菌数、DM-Dig和CP-Dig的含量

从表4看出，配方四和配方七无论是蛋白的含量还是酵母的活菌数，尤其是体外蛋白的消化率方面在其他几种配方中的指标最差，可能是因为玉米秸秆中含有大量的纤维素、半纤维素以及木质素，仅靠以上三种菌产生的酶是无法将其分解的，发酵结束后很难转化成蛋白，同时造成了消化率的偏低。

从对比例可以看出，不同菌种添加方式的实验中可以发现，未添加枯草杆菌的体外消化率及粗蛋白偏低，同时仅添加酵母菌的菌落总数偏低，说明粗纤维的降解与枯草有关，且酵母菌的生长与其他两种菌具有协同作用。

同时可以发现，配方二及配方三的指标差异不大但都高于其他几个配方，考虑到成本方面的问题，优先选择配方三。

实施例3、最优发酵条件下饲料的营养价值分析

采用实施例2中的配方三进一步分析最优发酵条件下饲料(DDGS)的营养价值，步骤如下：称取玉米喷浆纤维210g、玉米芯粉150g，玉米糖渣等混合物500g，步骤1中的酵母菌液(酵母菌YPSC01的含量为3×10⁸cfu/ml)40ml、步骤1中的乳杆菌液(乳杆菌YPLL01的含量为3×10⁹cfu/ml)30ml、步骤1中的枯草芽孢杆菌液30ml(枯草芽孢杆菌的含量为2×10¹⁰cfu/ml)，水40ml，混合搅拌均匀，装入发酵袋中密封，于37℃条件下培养发酵，培养72h结束发酵，取出后50℃烘干，粉碎，得到DDGS，分别检测粗蛋白、粗脂肪、氨基酸、小肽、酵母菌数。

1、粗蛋白含量的测定

2、粗脂肪含量的检测

参照国标GB/T 6433-2006《饲料中粗脂肪的测定》方法进行测定。

3、游离氨基酸的测定

参照国标GB/T 18246-2000《饲料中氨基酸的测定》方法进行测定。

4、小肽的测定

通过测酸溶蛋白及游离氨基酸的测定，利用酸溶蛋白减去游离氨基酸即为小肽含量；酸溶蛋白的检测：NY/T 3801-2020《饲料原料中酸溶蛋白的测定》；游离氨基酸GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》。

5、酵母活菌数的测定

6、呕吐毒素的检测

参照T/SDAA 0049-2021《饲料中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素快速测定》中的方法进行检测。市售DDGS产品营养价值对。

表5最优发酵条件下饲料(DDGS)的营养价值对比

结果表明(如表5所示)，最优发酵条件下的粗蛋白质≥28％，粗脂肪≥8％，氨基酸≥26％，小肽≥17％，酵母菌量≥2.0×10⁸，粗纤维≤6％，粗灰分≤4％，甘露聚糖≥0.5％，有机酸≥9％，且富含钙磷等微量元素，相比于市场上的DDGS，本发明制备的DDGS中总氮、氨基酸及小肽的含量高于市场上的DDGS,粗纤维及粗灰分的含量低于市售DDGS，更有利于动物的消化吸收利用，提供更多的营养成分，同时毒素的含量远低于市售产品的毒素，产品更具备竞争力。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.一种制备DDGS的方法，其特征在于，所述方法包括在培养基中发酵培养复合菌剂，所述复合菌剂包括乳杆菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌，所述乳杆菌为乳杆菌（Lactobacillus sp.）YPLL01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.24328，所述酵母菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）YPSC01，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.24325。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合菌剂为酵母菌YPSC01菌液、乳杆菌YPLL01菌液和枯草芽孢杆菌菌液按照比例混合得到的复合菌液，所述复合菌液中酵母菌YPSC01菌液、乳杆菌YPLL01菌液和枯草芽孢杆菌菌液的体积比为4:3:3。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养基为固态培养基，所述固态培养基由玉米喷浆纤维和玉米糖渣组成，或由玉米喷浆纤维、玉米糖渣和玉米芯粉组成。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固态培养基为下述A1）、A2）或A3）：

A1）如下质量配比的固态培养基：玉米喷浆纤维：玉米糖渣：玉米芯粉为(21-36)：50：(0-15)；

A2）如下质量配比的固态培养基：玉米喷浆纤维：玉米糖渣：玉米芯粉为21：50：15；

A3）如下质量配比的固态培养基：玉米喷浆纤维：玉米糖渣为36：50。

5.权利要求1或2中任一项所述的复合菌剂。

6.权利要求1中所述的乳杆菌或酵母菌。