CN112063674B - 一种基于电荷性及疏水性的锌离子配合肽的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电荷性及疏水性的锌离子配合肽的制备方法及其应用。本发明通过制备特定电荷及疏水性的多肽与锌离子溶液反应，得到转运吸收好和生物利用度高的锌配合肽。本发明解决了现有技术中含锌产品吸收度差的问题，推进锌肽配合物替代无机锌在营养食品等产品，实现提高锌离子生物利用度的整体目标，另一方面还推动了大豆粕的高值化利用和相关技术研发，对提升大豆粕等低值食物蛋白质的高值化应用有着重大的意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及一种基于电荷性及疏水性的锌离子配合肽的制备方法及其应用。
背景技术
锌是人体必不可少的一种微量元素，对于维持人体健康有不可替代的作用，在人体生长发育、生殖遗传、免疫、内分泌等重要生理过程中是必不可少的。人体在缺乏锌和锌过量的情况下都会对机体有一定的影响。当下社会中，人群对于缺锌现象比较普遍，在未成年人容易缺乏的必需微量元素中，缺锌的占比是最大的，据调查，缺锌在必需微量元素缺乏情况中的占比率超过58％，并且持续呈上升趋势。
人体在缺乏锌的情况下会出现多个系统综合反应。首先，锌缺乏会引起生长发育迟缓，严重时还会导致侏儒症。此外，锌不足还会诱发神经系统疾病，导致机体免疫力降低，引起各类伴随性疾病。因此，促进锌在人体内的吸收并提高其生物利用度是现有技术中一直期望解决的首要问题。
目前，补锌的主要产品包括无机锌和有机酸锌。无机锌的生物利用率低，而且在胃肠道内溶解度很低而使治疗效果微弱。有机酸锌虽然相较于无机锌，在胃肠道内更加稳定且生物利用度高，但其合成复杂，从而导致成本高等原因难以被广泛投入使用。
目前，市场上补锌产品多为生物利用度低的无机锌，很少出现锌肽配合物的相关产品，而现有的锌肽配合物产品还主要受制于抗氧化性以及生物利用度的问题，从而不能发挥出其应有的效果。本发明以分离纯化出一种锌离子配合率高的特性多肽为目标，并以此特性肽制备出其锌肽配合物产品，从而可以大大提高锌在人体中的转运吸收和生物利用度，具有极高的市场经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供锌离子配合肽的制备方法；
本发明的另一目的在于提供上述锌离子配合肽的制备方法制备的锌离子配合肽在制备含锌食品中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
锌离子配合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用碱溶酸沉法提取大豆粕中的大豆分离蛋白；
(2)蛋白酶酶解，超滤分离，得到大豆多肽水解液；
(3)用DEAE阴离子交换柱步骤(2)所得大豆多肽水解液，得到负电荷多肽；或
用DA201-C大孔树脂和乙醇洗脱步骤(2)所得大豆多肽水解液，得到疏水强度大于250的多肽；
(4)将步骤(3)得到的负电荷多肽或疏水强度大于250的多肽与锌离子溶液混合，得到锌离子配合肽。
DEAE阴离子交换柱的电荷基团带正电，在装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中的负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，并结合到离子交换剂上。而分离溶液中的正电基团则不能结合，随流动相流出而被去除(即最先出来的为正电多肽，且越先出来的正电越强)。利用乙醇洗脱液与结合在离子交换剂上的各种负电基团交换，而将负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与其结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来。
当然，可以根据实际需要，将大豆粕替换为其他蛋白原料，或采用其他本领域常规的提取方法提取原料中的蛋白。
进一步地，上述碱溶酸沉法包括以下步骤：
(a)大豆粕与水混合，加入NaOH调节pH值，分离得到上清；
(b)加入HCl调节pH，分离得到沉淀；
(c)用水溶解，调节pH值，透析得到大豆分离蛋白；
其中，所述碱溶酸沉法还包括在步骤(c)后干燥。
按体积比计，大豆粕与水的混合比例为1:10。
上述步骤(a)中，加入NaOH调节pH值后室温搅拌2h，以保证大豆粕溶液充分反应。
上述步骤(b)中，加入HCl调节pH后4℃静置30min，以保证大豆粕上清充分反应，得到沉淀物。
进一步地，上述步骤(a)中NaOH调节pH值至7.0-8.0。
进一步地，上述步骤(b)中HCl调节pH值至4.0-4.5。
进一步地，上述蛋白酶包括Alcalase酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶。
进一步地，上述胰蛋白酶的酶解条件为pH 7.5-8.5，温度50-60℃；所述胃蛋白酶条件为pH 2.0-2.5，温度35-40℃；所述Alcalase酶的酶解条件为pH7.5-8.5，温度50-60℃。
进一步地，上述步骤(4)中锌离子溶液包括氯化锌溶液、硫酸锌溶液或乙酸锌溶液中的任一种。
进一步地，上述步骤(4)中多肽与锌离子溶液混合条件为：pH为4.5-6.5，温度为65-75℃。
进一步地，上述步骤(4)中多肽与锌离子溶液的质量比为(5-10)：1。
本发明的第二个方面，提供：
上述锌离子配合肽的制备方法制备的锌离子配合肽在制备含锌食品中的应用。
锌肽配合物的锌吸收显著高于无机锌和有机酸锌。本发明的锌配合物可作为促进锌摄入的强化剂，有助于促进机体细胞对锌的转运吸收。
本发明的有益效果是：
(1)本发明方案可制备得到锌离子配合率高的特性多肽，通过分离纯化后的多肽选取得到和锌离子有更高的配合能力的特性多肽，推进锌肽配合物替代无机锌在营养食品等产品，实现提高锌离子生物利用度的目标；
(2)本发明以大豆粕为原料，并对大豆粕进行高值化利用研发，对农产品加工副产业的加工以有效的提高农产品利用率，对提升大豆粕等低值食物蛋白质的高值化应用有着重大的意义。
附图说明
图1为肽组分F1(分子量为0-5K Da的大豆多肽)分离出不同电荷性的两组分F11(正电荷)、F12(负电荷)；
图2为不同大孔树脂对肽组分F1的吸附率；
图3为大孔树脂DA201-C以30％、60％乙醇浓度洗脱得到的F13、F14的疏水强度；
图4为实例1中F1、F11、F12、F13、F14组分的锌配合率对比图；
图5为实例2中F1、F11、F12、F13、F14组分的锌配合率对比图；
图6为实例3中F1、F11、F12、F13、F14组分的锌配合率对比图。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
实施例1
一种锌离子配合肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取大豆粕与蒸馏水按1:10比例混合，加入2M NaOH，调节pH值至8.0，室温搅拌2h后在8000rpm条件下离心20min。过滤得到上清，用2M HCl调节pH值至4.5，4℃静置30min后在6000rpm条件下离心15min。过滤，取出沉淀加入7倍湿重的蒸馏水，调节pH值至7.5缓慢搅拌至完全溶解，透析48h后冻干即可得到大豆分离蛋白；
(2)称取步骤(1)所得的大豆分离蛋白，并加入10倍量的蒸馏水混合，55℃温度下预热5min后用NaOH调节pH至8.0，加入Alcalase酶进行酶解，8000rpm离心15min后去沉淀即得大豆多肽水解液；
(3)取步骤(2)所得的大豆多肽水解液进行超滤分离，留取人体内较容易吸收的分子量为0-5K Da的小分子肽组分(F1)；
(4)取步骤(3)所得的大豆多肽组分进行DEAE阴离子交换柱分离，分别得到正电荷多肽(F11)和负电荷多肽(F12)两个组分(如图1)；
(5)取步骤(3)所得的大豆多肽组分进行大孔树脂分离，选取多肽吸附率最高的DA201-C大孔树脂，继续分别用30％乙醇和60％乙醇洗脱得到疏水性不同的两个组分(分别为F13、F14)(如图2和3)；
(6)将步骤(4)、步骤(5)所得的四个组分分别和氯化锌溶液配合。配合条件为：多肽浓度为10mg/mL，肽与锌离子质量比为6：1，反应温度为60℃，pH＝5.0，分别测定其配合率并得出配合率更高的特性多肽(如图4)。
如图1-4所示，上述步骤得到的四种不同特性多肽F11、F12、F13、F14的锌配合率分别是肽组分F1的0.51、1.09、1.78和0.25倍。得出肽组分F12、F13的锌配合率高于肽组分F1。
实施例2
(1)取大豆粕与蒸馏水按1:10比例混合，加入2M NaOH，调节pH值至8.0，室温搅拌2h后在8000rpm条件下离心20min。过滤得到上清，用2M HCl调节pH值至4.5，4℃静置30min后在6000rpm条件下离心15min。过滤，取出沉淀加入7倍湿重的蒸馏水，调节pH值至7.5缓慢搅拌至完全溶解，透析48h后冻干即可得到大豆分离蛋白；
(2)称取步骤(1)所得的大豆分离蛋白，并加入10倍量的蒸馏水混合，50℃温度下预热5min后用NaOH调节pH至8.0，加入胰蛋白酶进行酶解。随后在37℃温度下预热5min，用HCl调节pH至2.0，加入胃蛋白酶酶解，8000rpm离心15min后去沉淀即得大豆多肽水解液；
(3)取步骤(2)所得的大豆多肽水解液进行超滤分离，留取人体内较容易吸收的分子量为0-5K Da的小分子肽组分(F1)；
(4)取步骤(3)所得的大豆多肽组分进行DEAE阴离子交换柱分离，分别得到正电荷多肽(F11)和负电荷多肽(F12)两个组分；
(5)取步骤(3)所得的大豆多肽组分进行大孔树脂分离，选取多肽吸附率最高的DA201-C大孔树脂，继续分别用30％乙醇和60％乙醇洗脱得到疏水性不同的两个组分(分别为F13、F14)；
(6)将步骤(4)、步骤(5)所得的四个组分分别和氯化锌溶液配合。配合条件为：多肽浓度为10mg/mL，肽与锌离子质量比为6:1，反应温度为60℃，pH＝5.0，分别测定其配合率并得出配合率更高的特性多肽(如图5)。
如图5所示，上述步骤得到的四种不同特性多肽F11、F12、F13、F14的锌配合率分别是肽组分F1的0.65、1.13、1.49和0.46倍。得出肽组分F12、F13的锌配合率高于肽组分F1。此外，发明人发现，经分离纯化后肽组分的锌配合率与酶解时用酶种类有相关关系。
实施例3
(1)取大豆粕与蒸馏水按1:10比例混合，用2M NaOH调节pH值至8.0，室温搅拌2h后在8000rpm条件下离心20min。留上清用2M HCl调节pH值至4.5,4℃静置30min后在6000rpm条件下离心15min。取出沉淀加入7倍湿重的蒸馏水，调节pH值至7.5缓慢搅拌至完全溶解，透析48h后冻干即可得到大豆分离蛋白；
(2)称取一定量步骤(1)所得的大豆分离蛋白，并加入10倍量的蒸馏水混合，50℃温度下预热5min后用NaOH调节pH至8.0，加入胰蛋白酶进行初步酶解。随后在37℃温度下预热5min后用HCl调节pH至2.0，加入胃蛋白酶酶解，8000rpm离心15min后去沉淀即得大豆多肽水解液；
(3)取步骤(2)所得的大豆多肽水解液进行超滤分离，留取人体内较容易吸收的分子量为0-5K Da的小分子肽组分(F1)；
(4)取步骤(3)所得的大豆多肽组分进行DEAE阴离子交换柱分离，分别得到正电荷多肽(F11)和负电荷多肽(F12)两个组分；
(5)取步骤(3)所得的大豆多肽组分进行大孔树脂分离，选取多肽吸附率最高的DA201-C大孔树脂，继续分别用30％乙醇和60％乙醇洗脱得到疏水性不同的两个组分(分别为F13、F14)；
(6)将步骤(4)、步骤(5)所得的四个组分分别和氯化锌溶液配合。配合条件为：多肽浓度为10mg/mL，肽与锌离子质量比为6:1，反应温度为70℃，pH＝5.0，分别测定其配合率并得出配合率更高的特性多肽(如图6)。
如图6所示，上述步骤得到的四种不同特性多肽F11、F12、F13、F14的锌配合率分别是肽组分F1的0.18、1.99、1.80和0.32倍。得出肽组分F12、F13的锌配合率明显高于肽组分F1。此外，发明人还发现，多肽与锌配合时，其配合温度对其配合率有着重要影响。
疏水强度测定
取实施例1-3中的F1、F13、F14进行疏水强度检测。
具体步骤为：
将F1、F13、F14样品用0.01mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲溶液稀释到不同浓度(0.2mg/mL-1mg/mL之间)。取40μL 8.0mmol/L ANS溶液(0.01mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲溶液配制)与3mL稀释后的样品溶液混合，用荧光光谱仪测定荧光强度。以荧光强度对蛋白质浓度作曲线，斜率即为多肽的疏水强度。其中，检测参数为：水解液F1的激发波长为352，发射波长为515；30％乙醇洗脱F13的激发波长为290，发射波长为355；60％乙醇洗脱F14的激发波长为350，发射波长为355。
检测得到，实施例1-3中的水解液F1疏水强度为6.86±1.56；30％乙醇洗脱F13的疏水强度为259.8±4.40；60％乙醇洗脱F14的疏水强度为921.9±8.03。
综上所述，本发明制备得到的疏水强度大于250或负电荷多肽具有高锌配合率，能够克服现有技术中含锌产品抗氧化性以及生物利用度的问题缺陷，从而可用于制备各类含锌食品，具有极高的市场价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.锌离子配合肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）采用碱溶酸沉法提取大豆粕中的大豆分离蛋白；
（2）大豆分离蛋加入胰蛋白酶进行酶解，随后加入胃蛋白酶酶解，超滤分离，得到分子量为0-5K Da的小分子肽组分；
（3）用DEAE阴离子交换柱步骤（2）所得小分子肽组分，得到负电荷多肽；或
用DA201-C大孔树脂和乙醇洗脱步骤（2）所得小分子肽组分，得到疏水强度大于250的多肽；
（4）将步骤（3）得到的负电荷多肽或疏水强度大于250的多肽与锌离子溶液混合，得到锌离子配合肽；
所述步骤（4）中多肽与锌离子溶液的质量比为（5-10）：1；
所述步骤（3）中的乙醇洗脱为用30%乙醇洗脱；
所述碱溶酸沉法包括以下步骤：
（a）大豆粕与水混合，加入NaOH调节pH值，分离得到上清；
（b）加入HCl调节pH，分离得到沉淀；
（c）加水溶解，调节pH值，透析得到大豆分离蛋白；
其中，所述碱溶酸沉法还包括在步骤（c）后干燥；
所述步骤（b）中，加入HCl调节pH后4℃静置30min，以保证大豆粕上清充分反应。
2.根据权利要求1所述的锌离子配合肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中NaOH调节pH值至7.0-8.0。
3.根据权利要求1所述的锌离子配合肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（b）中HCl调节pH值至4.0-4.5。
4.根据权利要求3所述的锌离子配合肽的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶的酶解条件为pH 7.5-8.5，温度50-60℃；所述胃蛋白酶条件为pH 2.0-2.5，温度35-40℃。
5.根据权利要求1所述的锌离子配合肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中锌离子溶液包括氯化锌溶液、硫酸锌溶液或乙酸锌溶液中的任一种。
6.根据权利要求1所述的锌离子配合肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中多肽与锌离子溶液混合条件为：pH为4.5-6.5，温度为65-75℃。
7.权利要求1-6任一所述的锌离子配合肽的制备方法制备的锌离子配合肽在制备含锌食品中的应用。
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