CN107574214A - 一种抗衰老的乳清蛋白肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗衰老的乳清蛋白肽的制备方法，属于属于生物活性肽的技术领域。该制备方法包括以下步骤：利用碱性蛋白酶水解浓缩乳清蛋白(WPC80)，以水解度和DPPH自由基清除率为考察指标，以水解度和DPPH自由基清除率为指标，调节加酶量4000‑10000U/g、pH 8.0、8.5、9.0，温度55、60、65℃，底物浓度3‑7％，水解时间1‑6h对水解效果的影响，得到最佳的水解工艺，根据最佳工艺进行酶解制备；在最佳工艺条件下水解浓缩乳清蛋白(WPC80)，用DA201‑C大孔树脂对乳清蛋白酶解物进行脱盐，考察去离子水、40‑70％乙醇为解吸剂，上样流速为0.5‑2.5mL/min，上样浓度为10‑50mg/mL，在此条件下进行动态脱盐实验，收集脱盐的肽液进行超滤分离，用Tricine‑SDS–PAGE电泳鉴定乳清蛋白肽的分子量。

Description

一种抗衰老的乳清蛋白肽的制备方法

技术领域

本发明涉及了一种抗衰老的乳清蛋白的制备方法，属于生物活性肽的技术领域。

背景技术

随着现代化的发展，人口老龄化已经成为人们普遍关注的问题之一。人类随着年龄的增长，机体的新陈代谢减慢，细胞逐渐衰老，器官功能减退，大脑的老化也日益加剧，最明显的表现就是学习记忆能力下降及认知功能衰退，甚至诱发中枢神经系统退行性疾病，如老年痴呆症(阿尔茨海默Alzheimer's disease，AD)、帕金森症(Parkinson's disease,PD)等。老年人的学习记忆能力下降，不仅给其个人生活带来诸多不便，严重影响其生活质量，而且给国家、社会、家庭带来了沉重负担。

目前临床用来改善学习记忆能力的药物，疗效不肯定，毒副作用明显，且大多需要进口，价格昂贵，它们不适合中国国情。因此，研究开发具有缓解精神压力、改善老年人学习记忆能力、延缓记忆功能衰退的天然活性物质，是我们要解决的重大问题之一。乳清蛋白肽是利用酶解技术水解牛奶中的乳清蛋白而得到的一类低分子量肽，目前已发现某些肽段具有抗氧化，降血压，降胆固醇，增强免疫力，抗毒抗病菌等多种生理功能，但关于乳清蛋白肽改善老龄学习记忆能力方面的研究并不多见，针对于抗衰老的乳清蛋白肽的制备方法更是不完善。

乳清蛋白具有很高的营养价值，其中含有丰富的支链蛋白、必需氨基酸和钙质，是全价蛋白质，生物利用价值高，胆固醇、脂肪、乳糖含量低，易消化吸收，利用率高。目前研究已经发现，乳清蛋白具有多种功能性质，如持水性，吸水性，成胶性，弹性，起泡性，乳化性等，还有多种生物学活性，如降血糖，降胆固醇，抗氧化，降低癌症发病，增强免疫力，促进细胞生长，促进双歧杆菌生长等^[1-5]。因此，乳清蛋白已经被应用到食品、医药、化妆品等多个领域中，具有良好的开发前景。

本发明利用碱性蛋白酶制备乳清蛋白肽，分离出抗氧化活性较高的组分，该组分能够清除自由基，抵抗抗氧化，具有抗衰老的功能性质，应用前景广阔。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗衰老的乳清蛋白肽的制备方法，本发明制备方法利用碱性蛋白酶水解浓缩乳清蛋白(WPC80)，以水解度和DPPH自由基清除率为考察指标，对水解条件进行优化，确定最佳的酶解工艺，在最佳工艺条件下水解浓缩乳清蛋白(WPC80)，用DA201-C大孔树脂对乳清蛋白酶解物进行脱盐，收集脱盐的肽液进行超滤分离，用Tricine-SDS–PAGE电泳鉴定乳清蛋白肽的分子量。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种抗衰老的乳清蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：

1、蛋白酶的筛选

蛋白酶的筛选：选择木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶五中蛋白酶，比较酶活和水解效果，根据酶解物上清液的水解度和DPPH自由基清除率选择合适的酶。

2、乳清蛋白的酶解

工艺流程：浓缩乳清蛋白→加水溶解→沸水变性10min→冷却→调节温度，pH→加酶水解→沸水灭酶10min→冷却→4000r/min离心20min→上清液→测定水解度和DPPH自由基清除率。以水解度和DPPH自由基清除率为指标，调节加酶量4000-10000U/g、pH 8.0、8.5、9.0，温度55、60、65℃，底物浓度3-7％，水解时间1-6h对水解效果的影响，得到最佳的水解工艺，根据最佳工艺进行酶解制备。

3、乳清蛋白肽的脱盐

用DA201-C大孔树脂进行脱盐实验，考察去离子水、40-70％乙醇为解吸剂，上样流速为 0.5-2.5mL/min，上样浓度为10-50mg/mL，在此条件下进行动态脱盐实验，脱盐后，测定乳清蛋白肽的的DPPH自由基清除率，抗氧化活性，回收率，脱盐率，进而判断脱盐效果。吸附量、吸附率、解吸率，回收率及脱盐率分别按以下公式计算。

4、双缩脲法测定多肽含量

5、超滤法分离乳清蛋白肽

利用超滤法将乳清蛋白肽分离成分子量不同的三个组分，并用聚丙烯酰氨凝胶电泳测定三个组分的分子量。

步骤1、2、3所述的水解度和DPPH自由基清除率的两个指标测定方法如下：

(1)水解度(DH)的测定

采用茚三酮显色法^[73]测定水解蛋白质的水解度。

1)绘制标准曲线

水解蛋白液中-NH₂基的测定：称取0.1干燥过的甘氨酸溶解后定容至100mL，取出2mL 定容至l00mL得20ug/mL的溶液。取此液再分别稀释成含量为2，6，10，14，18，20ug/mL的溶液用于标准曲线绘制。取2mL测定用稀释液于试管中加入1mL显色剂，混匀后沸水浴中加热15min，同时作空白试验，然后冷水冷却，加入40％乙醇溶液5mL混匀，放置15min 后(搅拌均匀)，以空白管调零，于分光光度计570nm处测定A值。

2)水解蛋白液中-NH₂基的测定

取水解蛋白液0.5rnL定容至50mL，取0.4mL稀释液于试管中并加入1.6mL蒸馏水、1mL 显色剂，混匀后置沸水浴中加热15min，同时作空白试验，然后冷水冷却，加入40％乙醇溶液5.0mL混匀，放置15min后，以空白管调零，于分光光度计570nm处测定A值。利用标准曲线计算水解蛋白液中-NH2的含量(mmol/mL)。

式中：h_tot-每g蛋白质的肽键毫摩尔数，查得乳清蛋白htot＝8.8(mmol/g)

6.25·N-水解底物蛋白质质量(g/L),测得为11.66

(2)乳清蛋白水解物DPPH自由基清除能力的测定

通过测定乳清蛋白酶解物的DPPH自由基清除率来评价其抗氧化能力。配制浓度为2× 10^-4mol/L的DPPH无水乙醇溶液，并且避光保存。取2mL乳清蛋白酶解物与2mLDPPH无水乙醇溶液混合，在室温下避光反应30min，然后在517nm处测定样品的吸光度Ai。空白组以等体积无水乙醇溶液替代DPPH无水乙醇溶液，对照组以等体积蒸馏水替代酶解物样品。乳清蛋白酶解物DPPH自由基清除率以下公式计算。

式中：A₀-对照组吸光度；A_i-样品组吸光度；A_j-空白组吸光度。

附图说明

图1DA201-C大孔树脂对乳清蛋白肽的去离子水洗脱曲线；

图2DA201-C大孔树脂对乳清蛋白肽70％乙醇洗脱曲线；

图3Tricine-SDS–PAGE电泳图

注：1，WPC80原样；2，分子量＞10KDa的肽；3，分子量3.0-10.0KDa的肽；4，分子量＜3.0KDa的肽；M：超低分子量蛋白质Marker；5，脱盐后未超滤分离的乳清蛋白肽；

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

一、蛋白酶的筛选

根据常规测定酶活的方法进行酶活测定，结果如表1。

表1不同蛋白酶的底物特异性、最适宜作用条件及其实测酶活力

再对五中蛋白酶进行水解效果的比较，分别调节各种酶的最适pH、温度，酶的用量为5000U/g，水解时间3h，按照酶解工艺流程操作，根据酶解物上清液的水解度和DPPH自由基清除率选择合适的酶。

表2乳清蛋白不同酶解产物的DH和DPPH自由基清除率

由表1和表2可以看出，碱性蛋白酶的酶活力最高；五种酶在最适温度、pH和相同反应条件下水解乳清蛋白，碱性蛋白酶的DH略小于胰蛋白酶，但DPPH自由基清除率显著高于其他四种酶。碱性蛋白酶是一种非特异性肽键内切酶，主要作用于含疏水性羧基的肽键，由选育出的地衣芽抱杆菌生产而得，其主要有效成分枯草杆菌蛋白酶A，它是一种高效的细菌蛋白酶，属内切蛋白酶类，水解生成的肽苦味较小，来源广泛，成本较低，适合工业化生产，并且操作安全，符合食品级酶制剂标准。因此，选择碱性蛋白酶为实验酶，用以水解乳清蛋白制备抗氧化活性肽。

二、乳清蛋白的酶解工艺条件优化

利用碱性蛋白酶水解浓缩乳清蛋白，在酶解过程中比较反应加酶量、pH值、底物浓度、温度、和反应时间对水解度和DPPH自由基清除率的影响，确定最佳的酶解条件。

1、加酶量和pH对水解度和清除DPPH自由基清除率的影响

取7只250mL烧杯，分别加入体积分数为5％的乳清蛋白溶液100mL，调节pH 8.5，分别按照4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000U/g([E]/[S])的加酶量加入碱性蛋白酶，将烧杯置于60℃水浴中酶解3h；取3只250mL烧杯，分别加入体积分数为5％的乳清蛋白溶液100mL，分别调节pH 8.0、8.5、9.0，加入7000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，将烧杯置于60℃水浴中酶解3h；优化选择最佳加酶量5000(U/g)，最佳pH＝8.5，此时水解度为20.07％，DPPH自由基清除率为53.69％。

2、底物浓度和温度对乳清蛋白水解度的影响

取5只250mL烧杯，分别加入体积分数为3％、4％、5％、6％、7％的乳清蛋白溶液100mL，调节pH为8.5,加入5000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，将烧杯置于60℃水浴中酶解 3h；取3只250mL烧杯，分别加入体积分数为5％的乳清蛋白溶液100mL，调节pH为8.5，加入5000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，将烧杯分别置于55、60、65℃的水浴锅中酶解3h；优化选择最佳底物浓度5％，最佳温度60℃，此时，水解度为22.88％，DPPH自由基清除率为52.68％。

3、时间对水解度和清除DPPH自由基的影响

取6只250mL烧杯，分别加入体积分数为5％的乳清蛋白溶液100mL，调节pH8.5，加入5000U/g([E]/[S])的碱性蛋白酶，60℃下水解时间分别为：1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0h。优化选择2h为最佳水解时间，DH达到23.05％，DPPH自由基清除率达到53.57％。

三、乳清蛋白肽的脱盐

1、DA201-C大孔树脂的预处理

用无水乙醇浸泡树脂24h，使其充分溶胀，并用无水乙醇洗至流出液加水不浑浊为止，再用去离子水充分洗净乙醇。用5％HCl溶液浸泡树脂3h，去离子水洗至水洗液呈中性，再用2％NaOH溶液浸泡树脂3h，去离子水洗至水洗液呈中性备用。

2、DA201-C大孔树脂对乳清蛋白肽的脱盐

利用DA201-C大孔树脂，对乳清蛋白肽进行静态吸附及解吸实验，根据解吸率确定最佳解吸剂为70％乙醇；然后进行动态吸附及解吸实验，将DA201-C大孔树脂装入2.6cm×120cm 层析柱，距柱口5cm即可，室温条件下，使乳清蛋白水解液流过层析柱，首先需确定最佳上样浓度和上样速度，根据穿透体积和吸附量确定乳清蛋白肽的最佳上样流速为1.5mL/min，最佳上样浓度为30mg/mL；上样结束后，先用去离子水洗涤层析住(如图1)，随着洗脱体积的增加，会出现一个大峰和一个小的峰，大的是电导率洗脱峰，表示此时大量的盐被洗脱出来，小的是蛋白质吸收的洗脱峰，表示有少量肽被洗脱出来；当洗脱体积达到90mL之后，洗脱液的电导率及在220nm处的吸光度值趋近于0，表示此时盐分几乎全部被洗脱出来了，而肽也基本不被洗脱出来了。去离子水洗脱之后，用70％乙醇洗涤层析住(如图2)，随着洗脱体积的增加，会出现一个蛋白质吸收的洗脱峰，此时洗脱出来的肽含量最多，而在洗脱体积达到130mL之后，会有少量难溶于解吸剂的物质被洗脱出来，收集洗脱峰，旋转蒸发除去乙醇，冷冻干燥得脱盐的乳清蛋白肽。

四、多肽含量的测定

取5mL样品溶液，加入5mL 10％的三氯乙酸水溶液与之混合，静置30min，在4000r/min 下离心20min，取上清液用双缩脲法测定多肽含量。由表3可以看出，与脱盐前相比，脱盐后的乳清蛋白肽灰分含量明显降低，水分含量稍有降低，脱盐率为96.81％，说明脱盐效果良好；脱盐后的多肽含量明显增加，DPPH自由基清除率明显提高，说明脱盐之后乳清蛋白肽的抗氧化活性增强，肽回收率为90.37％，说明经过脱盐，乳清蛋白肽的损失比较少。

表3脱盐前后乳清蛋白肽的成分和DPPH自由基清除率比较

五、超滤法分离乳清蛋白肽

利用超滤将脱盐的乳清蛋白肽进行分离，取一定量冻干的乳清蛋白酶解物溶解在去离子水中，选用截留分子量(10、3KDa)的超滤膜对乳清蛋白酶解产物进行分离，先后得到不同截留分子量的超滤液，得到三个组分，组分Ⅰ：Mw<3kDa、组分Ⅱ:3kDa＜Mw＜10kDa和组分Ⅲ：Mw>10kDa，由表4可以看出超滤前后乳清蛋白肽的DPPH自由基清除率，结果显示，组分Ⅰ：Mw<3kDa的DPPH自由基清除率最高，抗氧化活性最强。

表4超滤前后乳清蛋白肽的DPPH自由基清除率比较

由图3可以看出，用Tricine-SDS–PAGE电泳分离鉴定乳清蛋白肽的各个组分，条带比较清晰，可以分辨出分子量3.0KDa以下的小分子肽。根据泳道1的条带可以看出，WPC80主要是分子量大于20.1KDa的大分子蛋白组成的，经过酶解脱盐后，从条带5可以看出，得到的多肽分子量均大于5.8KDa而小于20.1KDa，将其进行超滤分离，三个组分多肽分子量差异非常明显，尤其分子量小于3.3KDa的多肽条带清晰，分离效果较好。

Claims (8)

1.一种抗衰老的乳清蛋白肽的制备方法，其特征在于所述方法步骤如下：

步骤一：蛋白酶的筛选：选择木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和胰蛋白酶五中蛋白酶，比较酶活和水解效果，根据酶解物上清液的水解度和DPPH自由基清除率选择合适的酶；

步骤二：乳清蛋白的酶解工艺条件优化，以水解度和DPPH自由基清除率为指标，调节加酶量4000-10000U/g、pH 8.0、8.5、9.0，温度55、60、65℃，底物浓度3-7％，水解时间1-6h对水解效果的影响，得到最佳的水解工艺，根据最佳工艺进行酶解制备；

步骤三：乳清蛋白肽的脱盐，用DA201-C大孔树脂进行脱盐实验，考察去离子水、40-70％乙醇为解吸剂，上样流速为0.5-2.5mL/min，上样浓度为10-50mg/mL，在此条件下进行动态脱盐实验，脱盐后，测定乳清蛋白肽的的DPPH自由基清除率，抗氧化活性，脱盐率，肽回收率，进而判断脱盐效果；

步骤四：超滤法分离乳清蛋白肽，利用超滤法将乳清蛋白肽分离成分子量不同的三个组分，并用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行验证。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤一中所述的选择碱性蛋白酶为实验酶。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤二中所述的最佳加酶量5000(U/g)，最佳pH＝8.5，此时水解度为20.07％，DPPH自由基清除率为53.69％。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤二中所述的最佳底物浓度5％，最佳温度60℃，此时，水解度为22.88％，DPPH自由基清除率为52.68％。

5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤二中所述的最佳水解时间为2h，DH达到23.05％，DPPH自由基清除率达到53.57％。

6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤三中所述的解吸剂为70％乙醇；最佳上样流速为1.5mL/min；最佳上样浓度为30mg/mL。

7.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤三中所述的脱盐率为96.81％，肽回收率为90.37％。

8.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤四中所述的乳清蛋白肽分离得到三个组分，组分Ⅰ：Mw<3kDa、组分Ⅱ:3kDa＜Mw＜10kDa和组分Ⅲ：Mw>10kDa。