CN110272935A - 一种高压辅助酶解制备的花生抗氧化肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种采用高压辅助酶解方法从花生粕制备抗氧化肽的方法，包括花生粕中热变性蛋白的提取，高压预处理，酶促水解，超滤，大孔吸附树脂分离，凝胶过滤色谱分离，抗氧化活性鉴定和质谱分析，得到抗氧化活性肽。本发明具有可操作性强，成本低，原料易获取等优点。同时，对花生榨油后的副产物变性花生粕进行了综合利用，变废为宝，对企业创收，节约资源及解决环境污染具有一定贡献。

Description

一种高压辅助酶解制备的花生抗氧化肽及其制备方法
技术领域
本发明所属技术领域为蛋白质改性、蛋白质高压处理、蛋白质酶解，特别涉及一种高压辅助酶解制备的花生抗氧化肽及其制备方法。
背景技术
自从1956年Harman提出自由基理论以来，人们逐渐认识到人的衰老和许多疾病与体内物质氧化产生的自由基有关。而高活性的抗氧化剂的摄入是清除体内过量自由基的有效方法。目前生产量最大的是化学抗氧化剂，但由于化学抗氧化添加剂的不安全性,导致其使用受到限制。随着人们对食品安全和抗氧化剂安全的需求的提高，人们开始关注天然抗氧化剂的的研究利用。
抗氧化性是近年来国内外学者对多肽生物学活性研究中的新的研究课题，来源于食物蛋白的抗氧化肽，不但具有良好的抗氧化活性，且具有较高的安全性，研究发现,肌肽、谷胱甘肽以及大豆肽具有抗氧化作用,并逐渐显示出它们在医药、食品、饲料等领域应用的优势。随着生物活性肽的不断发现，其制备开发逐渐成为一大热点。
食物蛋白质经蛋白酶温和水解后产生的抗氧化活性肽，不仅比蛋白质本身更容易被人体消化吸收，减轻自由基对机体的损伤，还可以改善食品品质，延长食品保质期，因此抗氧化肽在食品及生物医药领域的应用前景将非常广阔。目前国外采用酶解制备抗氧化肽含量比较高，达50％以上，肽分子量很小；而国内制备的水解肽含量比较低，肽分子量比较大。可能是现有的酶解改性方法对蛋白质的酶解不够充分，有待进一步改进或完善蛋白质的酶促改性技术。
发明内容
本发明的目的是提出一种热榨花生粕抗氧化肽及其制备方法，通过高压辅助酶解改性技术处理热榨花生粕，对花生粕中变性蛋白进行改性处理，可以制备新型且具有抗氧化活性的花生抗氧化肽，不仅可提高花生粕这一副产物的综合利用价值，而且为花生产业的深加工提供一条新途径，具有较好的社会和经济效益。
本发明具体步骤如下：
(1)从花生粕中提取花生分离蛋白：称取一定量的花生粕，按照料液比为1:8，用1mol/L的NaOH调pH为10，浸提温度为60℃，浸提时间为60min，在磁力搅拌水浴锅中浸提。搅拌浸提后于3000g、5℃下离心10min，收集上清液，用1mol/L HCl调pH为4.5，然后在3000g、5℃下离心10min，收集沉淀后用去离子水溶解，经1mol/L NaOH调溶液pH为7.0，最后冷冻干燥即得花生分离蛋白。
(2)花生蛋白的高压处理：花生分离蛋白(SPI)用蒸馏水配成浓度为5％(w/v)的蛋白溶液，真空密封在聚乙烯包内。在200-400MPa下处理18-22min。达到目标压力的速度是250MPa/min，释放速率是300MPa/min。压力处理过程中，温度保持在25℃。压力处理后的SPI溶液，冷冻干燥后用于酶解。
(3)花生蛋白的酶促水解：高压处理后的花生蛋白，用去离子水配成浓度为4-6％的溶液，置于恒温磁力搅拌器上进行酶解，调节溶液温度52-55℃，pH值为7-9，缓慢搅拌的同时添加Alcalase(酶浓度为130-140μL/g)，酶解过程通过添加1M NaOH来维持反应体系的pH值，水解时间为110-130min。
(4)花生蛋白酶解产物的超滤分离：取酶解时间为100-130min的酶解产物，配成4-7％浓度，以100-120rpm的转速进行超滤分离。对超滤分离得到的抗氧化活性最强的F1组分进行下一步分离纯化。
(5)大孔吸附树脂分离：将预处理后的树脂采用湿法装柱(柱尺寸20×2.0cm)，将浓度为18-21mg/mL的F1组分吸取20mL上样，上样流速为0.3-0.6BV(柱床体积)/h，再以1BV(柱床体积)/h流速洗涤层析柱，收集洗脱液，每15mL收集一管，当水洗脱液A220nm的变化稳定时，分别用不同浓度的乙醇溶液以1.4-1.6BV/h流速进行阶段洗脱分离，收集各阶段分离的洗脱液，减压浓缩蒸去乙醇，再将浓缩液冷冻干燥。
(6)凝胶过滤分析：取1.0×80cm的玻璃层析柱，将处理好的葡聚糖凝胶G–25进行装柱。将步骤(5)冷冻干燥后样品制成3-6mg/mL的溶液，上样量为4mL，用蒸馏水以3mL/10min的流速洗脱，每3mL收集1管，用分光光度计在220nm处检测收集各洗脱峰，减压浓缩后冷冻干燥各洗脱组分。重复上样，合并各洗脱组分进行抗氧化活性评价，其中抗氧化活性较强的P3组分即为热榨花生粕抗氧化活性肽。
(7)采用液质联用技术对步骤(6)中分离到的抗氧化活性较强的P3组分所含抗氧化肽进行结构鉴定；
(8)ESI-MS/MS鉴定：经RP-HPLC分析后的样品流以100μL/min的速度穿过电喷雾界面进入质谱仪(Bruker Daltonik GmbH，Bremen，Germany)，采用正离子扫描模式，雾化气和干燥气为高纯氮气，扫描范围为质/核比200～2000(m/z)，
MS/MS肽序列分析借助BioTools(Version 3.0，Bruker Daltonics DataAnalysis 3.3)软件并结合手动计算，鉴定出F1组分中P3组分所含功能肽因子的氨基酸序列和分子量。
本发明制备的抗氧化肽是一种四个氨基酸序列的四肽结构，分子量为471.1Da，具有一定的抗氧化活性。抗氧化肽可以提高细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷甘胱肽过氧化物酶的活性，对羟自由基诱导的DNA损伤有保护作用，可以作为功能活性组分或抗氧化剂，用于保健品、食品、营养强化剂、动物饲料、化妆品、日化用品等领域。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案、优点更加清楚，下面结合附图对本发明做进一步的描述，其中：
图1为高压处理对花生蛋白酶解效果的影响；
图2为花生蛋白酶解产物的超滤分离结果；(其中A：不同酶解时间对膜通量的影响；B：蠕动泵转速对膜通量的影响；C：酶解产物的浓度对膜通量的影响)；
图3为不同超滤组分的抗氧化活性分析；
图4为酶解产物中PPIH<3K组分的凝胶过滤色谱分析；
图5为抗氧化活性肽的质谱鉴定。.
具体实施方式
实施例1
取一定量花生粕，采用碱溶酸沉法提取得到花生分离蛋白。将浓度为3％的花生分离蛋白，密封在聚乙烯包内，在200MPa高压处理18min后进行冷冻干燥。冷冻干燥后样品配成3％的浓度，置于恒温磁力搅拌器上，调节溶液温度为52℃，pH值为7，添加Alcalase(酶浓度为130μL/g)进行酶解110min。将浓度为3％的酶解产物进行超滤分离，控制恒流泵转速为100rpm。采用大孔吸附树脂对超滤分离后抗氧化活性强的F1组分进行分离纯化，吸取20mL样品溶液(浓度为18mg/mL)上样，控制流速为0.3BV(柱床体积)/h，再以1BV(柱床体积)/h流速洗涤层析柱，收集洗脱液，每15mL收集一管，当水洗脱液A220nm的变化稳定时，分别用不同浓度的乙醇溶液以1.4BV/h流速进行阶段洗脱分离，收集各阶段分离的洗脱液，减压浓缩蒸去乙醇，再将浓缩液冷冻干燥。然后将冷冻干燥后样品进行凝胶过滤分析，冷冻干燥后样品制成3mg/mL的溶液，上样量为4mL，用蒸馏水以3mL/10min的流速洗脱，每3mL收集1管，用分光光度计在220nm处检测收集各洗脱峰，减压浓缩后冷冻干燥各洗脱组分。重复上样，合并各洗脱组分进行抗氧化活性评价，其中抗氧化活性较强的P3组分即为热榨花生粕抗氧化活性肽。
实施例2
取一定量花生粕，采用碱溶酸沉法提取得到花生分离蛋白。将浓度为4％的花生分离蛋白，密封在聚乙烯包内，在300MPa高压处理18min后进行冷冻干燥。冷冻干燥后样品配成4％的浓度，置于恒温磁力搅拌器上，调节溶液温度为53℃，pH值为7，添加Alcalase(酶浓度为140μL/g)进行酶解100min。将浓度为4％的酶解产物进行超滤分离，控制恒流泵转速为100rpm。采用大孔吸附树脂对超滤分离后抗氧化活性强的F1组分进行分离纯化，吸取20mL样品溶液(浓度为18mg/mL)上样，控制流速为0.6BV(柱床体积)/h，再以1BV(柱床体积)/h流速洗涤层析柱，收集洗脱液，每15mL收集一管，当水洗脱液A220nm的变化稳定时，分别用不同浓度的乙醇溶液以1.6BV/h流速进行阶段洗脱分离，收集各阶段分离的洗脱液，减压浓缩蒸去乙醇，再将浓缩液冷冻干燥。然后将冷冻干燥后样品进行凝胶过滤分析，冷冻干燥后样品制成3mg/mL的溶液，上样量为4mL，用蒸馏水以3mL/10min的流速洗脱，每3mL收集1管，用分光光度计在220nm处检测收集各洗脱峰，减压浓缩后冷冻干燥各洗脱组分。重复上样，合并各洗脱组分进行抗氧化活性评价，其中抗氧化活性较强的P3组分即为热榨花生粕抗氧化活性肽。
实施例3
取一定量花生粕，采用碱溶酸沉法提取得到花生分离蛋白。将浓度为4％的花生分离蛋白，密封在聚乙烯包内，在400MPa高压处理20min后进行冷冻干燥。冷冻干燥后样品配成4％的浓度，置于恒温磁力搅拌器上，调节溶液温度为54℃，pH值为9，添加Alcalase(酶浓度为130μL/g)进行酶解120min。将浓度为4％的酶解产物进行超滤分离，控制恒流泵转速为100rpm。采用大孔吸附树脂对超滤分离后抗氧化活性强的F1组分进行分离纯化，吸取20mL样品溶液(浓度为18mg/mL)上样，控制流速为0.5BV(柱床体积)/h，再以1BV(柱床体积)/h流速洗涤层析柱，收集洗脱液，每15mL收集一管，当水洗脱液A220nm的变化稳定时，分别用不同浓度的乙醇溶液以1.4BV/h流速进行阶段洗脱分离，收集各阶段分离的洗脱液，减压浓缩蒸去乙醇，再将浓缩液冷冻干燥。然后将冷冻干燥后样品进行凝胶过滤分析，冷冻干燥后样品制成3mg/mL的溶液，上样量为4mL，用蒸馏水以3mL/10min的流速洗脱，每3mL收集1管，用分光光度计在220nm处检测收集各洗脱峰，减压浓缩后冷冻干燥各洗脱组分。重复上样，合并各洗脱组分进行抗氧化活性评价，其中抗氧化活性较强的P3组分即为热榨花生粕抗氧化活性肽。
实施例4
取一定量花生粕，采用碱溶酸沉法提取得到花生分离蛋白。将浓度为5％的花生分离蛋白，密封在聚乙烯包内，在300MPa高压处理22min后进行冷冻干燥。冷冻干燥后样品配成4％的浓度，置于恒温磁力搅拌器上，调节溶液温度为53℃，pH值为7，添加Alcalase(酶浓度为130μL/g)进行酶解120min。将浓度为5％的酶解产物进行超滤分离，控制恒流泵转速为100rpm。采用大孔吸附树脂对超滤分离后抗氧化活性强的F1组分进行分离纯化，吸取20mL样品溶液(浓度为20mg/mL)上样，控制流速为0.5BV(柱床体积)/h，再以1BV(柱床体积)/h流速洗涤层析柱，收集洗脱液，每15mL收集一管，当水洗脱液A220nm的变化稳定时，分别用不同浓度的乙醇溶液以1.5BV/h流速进行阶段洗脱分离，收集各阶段分离的洗脱液，减压浓缩蒸去乙醇，再将浓缩液冷冻干燥。然后将冷冻干燥后样品进行凝胶过滤分析，冷冻干燥后样品制成5mg/mL的溶液，上样量为4mL，用蒸馏水以3mL/10min的流速洗脱，每3mL收集1管，用分光光度计在220nm处检测收集各洗脱峰，减压浓缩后冷冻干燥各洗脱组分。重复上样，合并各洗脱组分进行抗氧化活性评价，其中抗氧化活性较强的P3组分即为热榨花生粕抗氧化活性肽。

Claims (2)

1.一种高压辅助酶解制备的花生抗氧化肽，其特征在于，所述的花生抗氧化肽是一种四个氨基酸序列的四肽结构，分子量为471.1Da，具有一定的抗氧化活性。
2.一种制备如上述所述的花生抗氧化肽的方法，其特征在于具体步骤为：
(1)称取一定量的热榨花生粕，按照料液比为1:8，用1mol/L的NaOH调pH为10，浸提温度为60℃，浸提时间为60min，在磁力搅拌水浴锅中浸提，搅拌浸提后于3000g、5℃下离心10min，收集上清液，用1mol/L HCl调pH为4.5，然后在3000g、5℃下离心10min，收集沉淀后用去离子水溶解，经1mol/L NaOH调溶液pH为7.0，最后冷冻干燥即得花生分离蛋白；
(2)将(1)所得花生分离蛋白(SPI)用蒸馏水配成浓度为3-5％(w/v)的蛋白溶液，真空密封在聚乙烯包内，在200-400MPa下处理18-22min，达到目标压力的速度是250MPa/min，释放速率是300MPa/min，压力处理过程中，温度保持在25℃，压力处理后的花生分离蛋白(SPI)溶液，冷冻干燥后用于酶解；
(3)将步骤(2)所得的花生蛋白用去离子水配成浓度为4-6％的溶液，置于恒温磁力搅拌器上进行酶解，调节溶液温度52-55℃，pH值为7-9，缓慢搅拌的同时添加Alcalase，酶浓度为130-140μL/g，酶解过程通过添加1M NaOH来维持反应体系的pH值，水解时间为110-130min；
(4)对步骤(3)所得的花生蛋白酶解产物进行超滤分离，超滤条件为酶解100-130min后的酶解产物、4-7％浓度水平，转速为100-120rpm，对超滤分离得到的抗氧化活性最强的F1组分进行下一步分离纯化；
(5)采用大孔吸附树脂法对步骤(4)超滤分离到的F1组分进行纯化，将预处理后的树脂采用湿法装柱，层析柱尺寸为20×2.0cm，将浓度为18-21mg/mL的F1组分吸取20mL上样，上样流速为0.3-0.6BV(柱床体积)/h，再以1BV(柱床体积)/h流速洗涤层析柱，收集洗脱液，每15mL收集一管，当水洗脱液A220nm的变化稳定时，分别用不同浓度的乙醇溶液以1.4-1.6BV/h流速进行阶段洗脱分离，收集各阶段分离的洗脱液，减压浓缩蒸去乙醇，再将浓缩液冷冻干燥；
(6)对步骤(5)冷冻干燥后的组分进行凝胶过滤分析，取1.0×80cm的玻璃层析柱，将处理好的葡聚糖凝胶G–25进行装柱，将步骤(4)冷冻干燥后样品制成3-6mg/mL的溶液，上样量为4mL，用蒸馏水以3mL/10min的流速洗脱，每3mL收集1管，用分光光度计在220nm处检测收集各洗脱峰，减压浓缩后冷冻干燥各洗脱组分，重复上样，合并各洗脱组分进行抗氧化活性评价，其中抗氧化活性较强的P3组分即为热榨花生粕抗氧化活性肽；
(7)采用液质联用技术对步骤(6)中分离到的抗氧化活性较强的P3组分所含抗氧化肽进行结构鉴定；
(8)ESI-MS/MS鉴定
经RP-HPLC分析后的样品流以100μL/min的速度穿过电喷雾界面进入质谱仪(BrukerDaltonik GmbH，Bremen，Germany)，采用正离子扫描模式，雾化气和干燥气为高纯氮气，扫描范围为质/核比200～2000(m/z)，
MS/MS肽序列分析借助BioTools(Version3.0，Bruker Daltonics Data Analysis3.3)软件并结合手动计算，鉴定出F1组分中P3组分所含功能肽因子的氨基酸序列和分子量。
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