CN103740797A

CN103740797A - 一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法

Info

Publication number: CN103740797A
Application number: CN201410022568.3A
Authority: CN
Inventors: 刘冬; 孙海燕; 周丽珍; 万红霞; 李艳; 唐旭蔚; 从彦丽
Original assignee: Shenzhen Polytechnic
Current assignee: Shenzhen Polytechnic
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: CN103740797B

Abstract

一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，涉及短肽。1）将高温花生粕粉碎，加入水，得花生粕粉料液，浸提后料液离心，取上清液，静置酸沉，再离心，收集沉淀，沉淀用水洗至中性，干燥后得花生蛋白粉；2）将步骤1）得到的花生蛋白粉进行亚硫酸钠前处理，得花生蛋白液；3）在步骤2）得到的前处理后的花生蛋白液中加入碱性蛋白酶，进行第一次酶解，再加入菠萝蛋白酶，进行第二次酶解，料液升温灭酶，停止酶解，得花生蛋白酶解液；4）将步骤3）所得花生蛋白酶解液离心，收取上清液，超滤，收集超滤透过液，再纳滤脱盐处理，收集纳滤截留液；5）将纳滤截留液冷冻干燥，即得高水解度功能性短肽。操作方便、条件温和、处理速度快。

Description

一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法

技术领域

本发明涉及短肽，尤其是涉及一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法。

背景技术

功能性短肽在人体内活性的高低与短肽的吸收率、生物利用度密切相关。二肽和三肽能在体内以完整形式迅速被吸收，因此在体内功能活性高。要制备以二肽、三肽为主要组分的短肽产品，要求蛋白质原料有很高的水解度，即应接近或超过30%。

功能性短肽是一类由二个到十几个氨基酸组成的短肽的统称。短肽几乎都具有特定的生物活性，它们在人体内的吸收机制与单个氨基酸的吸收机制不同。已有生物学、营养学及临床医学等领域的研究证实，人体内小肠上皮细胞中存在二肽、三肽转运载体，二肽和三肽可以完整的形式被迅速吸收并在体内发挥生理功效。三肽以上的多肽，则主要是以旁路扩散或胞饮途径被完整吸收，但这类作用会随分子质量的增加而迅速降低。由于吸收速度慢、经历过程长，这些三肽以上的短肽分子在消化道中大多被逐步降解，其特定生物活性大大降低，因此功能性短肽要顺利发挥作用，首先要能被人体大量地迅速、完整吸收。二肽、三肽的人体吸收利用度大，可以在人体内很好地发挥其原有的功能活性。而要得到大量二肽、三肽组分，其短肽生产工艺应首先能确保蛋白水解得到高水解度（二肽、三肽对应的蛋白水解度应高达30-50%），即水解度应接近或超过30%，同时氨基酸的产生应尽可能少即肽的得率高。然而多数蛋白质在常规蛋白酶的水解作用下其水解度一般都不太高，为百分之几至百分之十左右。因此，提高蛋白质的水解度可以作为衡量功能性短肽制备工艺的重要指标，得到高水解度是生产功能性短肽的工艺应达到的主要目的。

酶解蛋白制备功能性短肽，关键是要选择合适的蛋白酶，同时在酶解过程中使蛋白酶与蛋白质底物充分接触，使蛋白酶能专一、高效地发挥作用。

功能性短肽的制备方法多样，其中，酶法水解蛋白制备功能性短肽相较于酸碱水解法，具有过程温和、安全、简便可控、高效的优点，同时酶解法也比基因工程法、化学合成法简便、原料易得，因此在保健食品原料的生产研究领域得到了广泛应用。然而酶是一种专一性强的生物催化剂，不同种类、不同来源的蛋白酶其专一性水解部位即酶切位点不同，如来源于胰脏的胰蛋白酶(Trypsin)其主要酶切位点为赖氨酸残基、精氨酸残基部位，而胃蛋白酶(Pepsin)其主要酶切位点则为亮氨酸残基、苯丙氨酸残基部位。由于不同原料来源的蛋白质其氨基酸组成及比例大有差异，因此选择合适的酶及其水解工艺对得到高水度十分关键。花生蛋白中疏水性氨基酸的含量达到了35%，其中芳香族氨基酸含量为12%左右。

蛋白酶要顺利酶解还有一个关键因素是酶与底物应充分结合，这样酶才能够发挥作用。高温花生粕由于在生产过程中受到高热作用，蛋白质变性严重，蛋白质肽链间或蛋白质与其他组分间易形成非常紧密的结合而成为难溶聚合物，这对于蛋白肽链的解离、蛋白酶的进入及结合十分不利，而低度变性或中度变性的低温花生粕在这方面则显著优于高温花生粕。采用特定的理化辅助处理技术来处理从高温粕中提取的花生蛋白，使花生蛋白的肽链解离开，是使蛋白酶充分酶解的关键技术之一。

利用超滤膜的选择性分离作用，可将花生蛋白酶解生成的目的短肽与蛋白及大分子肽分离。另外，盐的存在会影响功能性短肽活性的发挥，采用纳滤技术可快速有效地进行功能性短肽脱盐、浓缩处理，该技术也适用于工业化生产。

蛋白酶解制备短肽的结果是生成含有大量短肽及少量大分子肽或蛋白的混合物，需要将短肽与其他组分分离。选择适宜截留分子量的超滤膜，可以利用膜的选择性分离作用将目的短肽与其他大分子组分分开，此外，应用超滤膜技术处理量大、可以适用于连续化生产。

在蛋白质酶解制备功能性短肽的过程中，由于要维持酶的活性，反应过程中会不断加入一定量的酸、碱、盐类物质以维持体系的pH值及离子强度。这样在功能性短肽的制备终点，必然会存在一定量的盐类物质，这些组分极可能影响功能性短肽作为保健品原料或药品原料应用的活性及适用范围。因此，需要对功能性短肽进行脱盐处理。传统的脱盐方式多为阴离子、阳离子交换结合脱盐，或是大孔树脂吸附、解析脱盐，这些往往过程繁琐，且样品处理量不多、肽回收率低，不利于工业化大生产。纳滤技术是采用孔径为纳米级的膜的膜分离技术，对相对分子质量大于200的有机物及大离子团具有高的截留效果，因此纳滤技术可以用于脱盐、同时浓缩样品，此外纳滤设备处理速度快，可以适用于工业化连续生产的情况。

目前相关的酶解花生蛋白制备功能性短肽的研究多停留在以开发具有某种功能活性的短肽为目的的酶解、纯化制备工艺研究上，而非以得到高水解度短肽为目的。如张伟等考察了几种酶在水解花生蛋白制备ACE抑制肽中的效果，结果表明碱性蛋白酶酶解产物ACE抑制率最大。黎观红采用碱性蛋白酶Alcalase水解花生，水解产物ACE抑制活性提高，再经过离子交换树脂脱盐、超滤(6kDa膜)富集浓缩、凝胶层析分离，得到活性更高的ACE抑制肽。张宇昊等探讨了花生降血压肽的超滤分离工艺条件，并用体外化学模型对花生肽的ACE抑制活性进行了评价，对花生短肽的ACE抑制活性量效关系、ACE抑制机理以及花生短肽的体内降血压活性等进行了研究。江利华等将花生蛋白酶解产物通过大孔吸附树脂、葡聚糖凝胶色谱分离纯化制得花生ACE抑制肽,并用RP-HPLC进一步分离纯化花生ACE抑制肽。王瑛瑶等采用水酶法制得的花生肽，采用体积排阻色谱、大孔吸附树脂色谱和半制备RP-HPLC进行分离，并对结构进行了鉴定，花生肽的相对分子质量在189-2000范围之内，具有抑制ACE活性。申请号为CN201010510989.2的中国专利申请公开了一种花生降血压肽及其制备方法，以冷榨花生饼为原料，碱提、酸沉提蛋白，碱性蛋白酶酶解，超滤分离得降血压肽，离子交换脱盐，后经浓缩干燥得产品。以上的研究集中在以制备具有某种功能活性（如ACE抑制活性）短肽的酶解工艺优化、短肽的活性机理（构效关系、量效关系等）的探讨上，且研究主要还处于实验室规模，离工业化生产还有一定距离。

申请号为CN200610112479.3的中国专利申请公开了一种以花生蛋白粉为原料制备花生功能性混合短肽的方法，申请号为CN201010110302.6的中国专利申请公开了一种利用低温花生粕制备花生蛋白和花生肽的方法，申请号为CN201010540547.2、CN200910017429.0的中国专利申请分别公开了一种以花生粕为原料制备制备花生蛋白活性肽的方法。这些研究以制备花生蛋白混合肽为目的，未特别关注蛋白水解度，水解度不高；并不强调产品的某种特定的生物活性，因此在肽水解度的分级分离、纯化、精制等工艺环节的要求也略不同于制备高纯度降血压活性肽的制备，这些产品主要用于作为保健食品或食品、饲料原料等。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法。

本发明包括以下步骤：

1）将高温花生粕粉碎，加入水，得花生粕粉料液，浸提后，料液离心，取上清液，静置酸沉，再离心，收集沉淀，沉淀用水洗至中性，干燥后得花生蛋白粉；

2）将步骤1）得到的花生蛋白粉进行亚硫酸钠前处理，得花生蛋白液；

3）在步骤2）得到的前处理后的花生蛋白液中，加入碱性蛋白酶，进行第一次酶解，再加入菠萝蛋白酶，进行第二次酶解，料液升温灭酶，停止酶解，得花生蛋白酶解液；

4）将步骤3）所得花生蛋白酶解液离心，收取上清液，超滤，收集超滤透过液，再纳滤脱盐处理，收集纳滤截留液；

5）将纳滤截留液进行冷冻干燥，即得高水解度功能性短肽。

在步骤1）中，所述高温花生粕最好粉碎至80目，所述高温花生粕与水的配比可为1:8～12（m/v）；所述水可采用去离子水；所述花生粕粉料液最好调节pH为9.0～11.0，所述浸提的温度可为40～60℃，浸提的时间可为2h；所述料液离心的条件可为3000rpm、15min；所述上清液最好调节pH值至4.5；所述静置酸沉的时间可为30min；所述再离心的条件可为4000rpm、10min；所述干燥可采用冷冻干燥。

在步骤2）中，所述将步骤1）得到的花生蛋白粉进行亚硫酸钠前处理可为：将花生蛋白粉溶解在去离子水中配制成浓度为3%～5%（m/v）的花生蛋白液，加热至50℃后，向花生蛋白液中加入Na₂SO₃至终浓度为0.04%～0.10%（m/v），并持续恒温搅拌1h；

在步骤3）中，所述前处理后的花生蛋白液最好调节至pH8.0～8.5、温度为50～55℃；所述加入碱性蛋白酶（Alcalase2.4，比活力138328U/g）的量可按每克花生蛋白加入5000～10000U/g酶，所述第一次酶解的时间可为180～240min；所述加入菠萝蛋白酶的温度为40～45℃、pH6.0～7.0，加入菠萝蛋白酶（比活力49395U/g的量按每克花生蛋白加入5000～10000U/g的酶，所述第二次酶解时间可为180～240min；最好在各段酶解过程中温度保持恒定，同时不断搅拌溶液，并通过加入1mol/L的NaOH来维持pH恒定；所述升温灭酶的条件可为在90℃下水浴灭酶20min。

在步骤4)中，所述离心的条件可在12000g条件下离心15min；所述超滤的条件可为：采用截留分子量为1kDa的超滤膜，调节花生蛋白酶解液pH为6.8，在超滤压力为0.086～0.193MPa、超滤温度为25～45℃的条件下超滤；所述超滤可采用恒体积超滤方式，所述恒体积超滤方式可为：先在超滤设备料槽中加入超滤原液，然后利用一台辅助泵在超滤过程中向料槽内不断泵入去离子水，使水加入的流速与从超滤膜中透过的透过液流速相等，超滤过程中加入的去离子水总体积最好为料液初体积的2～6倍；所述纳滤的操作方法可采用间歇式恒容积纳滤，纳滤的温度最好为常温（25℃），纳滤的压力最好为1.5MPa；所述间歇式恒容积纳滤的具体操作方式可为：纳滤原液体积为V₀，经纳滤膜脱盐、浓缩至Vr，Vr=1/3V₀，再加水稀释至V₀，即每次透过液的体积与加水体积相同，随着加水次数的增多，粗盐脱除率逐渐增加，加水次数最好为10～20次。

本发明在众多的单酶筛选及复配酶组合酶解花生蛋白的实验结果基础上，最后确定了以碱性蛋白酶结合菠萝蛋白酶的复配酶组合酶解方式来酶解花生蛋白。采用巯基还原剂亚硫酸钠处理花生蛋白，可破坏花生蛋白肽链上的二硫键，以提高蛋白酶进入蛋白肽链间并与之结合的机会，从而可大大提高花生蛋白的水解度。

本发明以高温花生粕为原料，提取花生蛋白，结合特定化学技术进行前处理，再应用复合酶酶解花生蛋白，高效制备高水解度的功能性短肽，最后应用膜技术进行功能性短肽的分离纯化。本发明从高温花生粕中以碱提酸沉法提取蛋白，然后采用亚硫酸钠处理技术对花生蛋白进行前处理，之后采用碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶双酶复合法水解花生蛋白；随后，应用超滤技术将蛋白酶解产物分离出来，并采用纳滤技术进行脱盐处理，得到纯化的功能性短肽浓缩液，最终经冷冻干燥处理，得功能性短肽产品。

本发明的优点在于：

1）本发明采用特定前处理技术结合复合蛋白酶酶解技术，对从高温花生粕中提取的花生蛋白进行酶解，可得到高水解度的花生蛋白短肽产品，其水解度高达30%左右。酶解产物即功能性短肽的分子量集中在284～401Da左右，主要为二肽、三肽。产品功能性短肽具有明显的血管紧张素转化酶E(AC)抑制活性、抗氧化活性。整个蛋白酶解处理工艺简便、温和、高效，蛋白水解度高。

2）酶解产物采用超滤技术分离、纳滤技术脱盐，超滤作用可以将短肽产品方便地从酶解体系中分离出来，而纳滤技术可使短肽产品脱去除少量一价离子之外的绝大多数盐类，且脱盐的同时对产品有浓缩作用；此外，超滤、纳滤作为膜技术具有操作方便、条件温和、处理速度快、可连续化的特点，适用于工业化生产。

3)本发明以在我国产量极大的高温花生粕为原料制备高水解度的功能性短肽产品，为由于过度变性而难以深开发的花生粕蛋白的应用开拓了新的途径，具有很好的经济效益和社会效益。

具体实施方式

以下实施例将对本发明作进一步的说明。

实施例1

碱溶酸沉法从高温花生粕中制备花生蛋白粉：取高温花生粕粉碎至80目得高温花生粕粉，按一定料液比1:8加入去离子水混匀，得花生粕粉料液，在60℃下浸提2h，浸提过程中维持恒定pH9.5，然后冷却至室温，料液以3000rpm、15min离心，取上清液，调节上清液pH值至4.5，静置酸沉30min后以4000rpm、10min离心，收集花生蛋白沉淀，用去离子水水洗至中性，冷冻干燥，得到花生粕蛋白粉。花生蛋白提取率达64.28%，花生蛋白粉中蛋白质纯度达到83.14%。

亚硫酸钠前处理：称取花生蛋白粉配制成5%（m/v）的花生蛋白液，加入Na₂SO₃至终浓度为0.07%（m/v），持续搅拌并在50℃保持1h。

复配酶法酶解花生蛋白制备功能性短肽：调整料液体系pH8.0、温度50℃，按酶底比7000.00U/g加入碱性蛋白酶，水解180min。随后将料液体系调至温度为45℃、pH6.8，按酶底比为8000.00U/g加入菠萝蛋白酶，水解180min。各段酶解过程中温度保持恒定，同时不断搅拌溶液，并通过加入1mol/L的NaOH来维持pH恒定。水解结束后水解液在90℃下水浴灭酶20min，停止酶解。酶解结果测得蛋白水解度为31.77%。

花生蛋白酶解液的超滤分离、纳滤脱盐：取花生蛋白酶解液，在12000g下离心15min，取上清液作为超滤原液。取超滤原液进行超滤处理。用截留分子量为1kDa的超滤膜，在超滤压力0.193MPa、料液pH6.8，超滤温度为45℃的条件下超滤。采用恒体积超滤方式，即先在超滤设备料槽中加入一定体积超滤原液，然后利用一台辅助泵在超滤过程中向料槽内不断泵入去离子水，使水加入的流速与从超滤膜中透过的透过液流速相等，超滤过程中加入的去离子水总体积为料液初体积的3倍时最佳，此时短肽透过率高、超滤速度稳定在较快的速度。此时短肽透过率为65.2%，透过液的分子量均在1kDa以内，且主要分布在284～401Da之间。

取收集的超滤透过液进行纳滤脱盐处理。在常温（25℃）、纳滤压力为1.5MPa的条件下进行间歇式恒容积纳滤脱盐。具体操作方式为：纳滤原液体积为V₀，经纳滤膜脱盐、浓缩至Vr，Vr=1/3V₀，再加水稀释至V₀，即每次透过液的体积与加水体积相同。总加水次数为15次。最后粗盐脱除率达到86.1%，短肽损失率为3.3%。

将得到的纳滤截留液进行冷冻干燥，即得到功能性短肽冻干粉，冻干粉对ACE的IC₅₀为0.78mg/mL，体外抗氧化活性为ORAC（Oxygen Radical Absorbance Capacity）值2359.50±40.43μmoL Trolox/g。对原发性高血压大鼠(SHR大鼠)的动物试验表明，灌胃剂量在1000～1500mg/kg体重时，给药4h后，大鼠收缩压能显著降低，且灌胃剂量为1500mg/kg体重时，降压效果可持续到8h，降幅在16～25mmHg，说明制得的花生降血压短肽有明显降压效果。

实施例2

碱溶酸沉法从高温花生粕中制备花生粕蛋白粉：取高温花生粕粉碎至80目得高温花生粕粉，按料液比1:10(m/v)加入去离子水混匀，得花生粕粉料液，在一定温度50℃下浸提2h，浸提过程中pH维持恒定9.5，然后冷却至室温，料液以3000rpm、15min离心，取上清液，调节上清液pH值至4.5，静置酸沉30min后以4000rpm、10min离心，收集花生蛋白沉淀，用去离子水水洗至中性，冷冻干燥，得到花生粕蛋白粉。花生蛋白提取率可达62.5%。对所得花生蛋白进行了蛋白质含量测定，其蛋白质纯度达到85.20%。

亚硫酸钠前处理：称取花生蛋白粉配制成5%（m/v）的花生蛋白液，加入Na₂SO₃至终浓度为0.1%（m/v），持续搅拌并在50℃保持1h。

复合酶法酶解花生蛋白制备功能性短肽：调整料液体系pH8.0、温度50℃，按酶底比7500.00U/g加入碱性蛋白酶，水解240min。随后将料液体系调至温度为45℃、pH6.8，按酶底比为8000.00U/g加入菠萝蛋白酶，水解240min。各段酶解过程中温度保持恒定，同时不断搅拌溶液，并通过加入1mol/L的NaOH来维持pH恒定。水解结束后水解液在90℃下水浴灭酶20min，停止酶解。酶解结果测得蛋白水解度为35.52%。

花生蛋白酶解液的超滤分离、纳滤脱盐：取花生蛋白酶解液，在12000g下离心15min，取上清液作为超滤原液。取超滤原液进行超滤处理。用截留分子量为1kDa的超滤膜，在超滤压力0.157MPa、料液pH6.8，超滤温度为40℃的条件下超滤。采用恒体积超滤方式，即先在超滤设备料槽中加入一定体积超滤原液，然后利用一台辅助泵在超滤过程中向料槽内不断泵入去离子水，使水加入的流速与从超滤膜中透过的透过液流速相等，超滤过程中加入的去离子水总体积为料液初体积的4倍，此时短肽透过率为65.5%，透过液的分子量均在1kDa以内，且主要分布在284～401Da之间。

取收集的超滤透过液进行纳滤脱盐处理。在常温（25℃）、纳滤压力为1.5Mpa的条件下进行间歇式恒容积纳滤脱盐。具体操作方式为：纳滤原液体积为V₀，经纳滤膜脱盐、浓缩至Vr，Vr=1/3V₀，再加水稀释至V₀，即每次透过液的体积与加水体积相同。总加水次数为12次。最后粗盐脱除率达到85.3%，短肽损失率为3.0%。

将得到的纳滤截留液进行冷冻干燥，得到功能性短肽冻干粉，冻干粉对ACE的IC₅₀为0.72mg/mL，体外抗氧化活性为ORAC值2623.68±15.66μmoL Trolox/g。对原发性高血压大鼠(SHR大鼠)的动物试验表明，所制的功能性短肽具有与实施例1同样的降血压功效。

功能性短肽中的二肽、三肽在人体内吸收速度快、生物利用度高，能在体内较好地发挥特定的功能活性，而大分子肽的体内活性则大大低于其体外活性。因此要开发在体内活性高的肽产品，应以二肽、三肽为主要组分，要求蛋白质水解程度要高，即达到接近或高于30%的水解度值。本发明提供了一种可工业化应用的以高温花生粕为原料，高效酶解花生蛋白、制备高水解度功能性短肽的工艺方法。

本发明从高温花生粕中以碱提酸沉法提取蛋白，然后采用亚硫酸钠处理技术对花生蛋白进行前处理，之后采用碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶先后水解花生蛋白制备高水解度（30%以上）蛋白水解液。随后应用超滤技术从酶解液中分离出小分子肽（以二肽和三肽为主），并采用纳滤技术对小分子肽进行脱盐处理，得到纯化的功能性短肽浓缩液，最终经冷冻干燥处理，得功能性短肽产品。本发明工艺具有操作方便、条件温和、处理速度快、可连续化的特点，适用于工业化生产。功能性短肽产品得率在25%以上（以原料蛋白为基准），分子量在284-401Da之间的短肽占90%左右，脱盐率85%以上，产品纯度80%以上，氨基酸含量5%以下。产品功能性短肽具有明显的血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性、抗氧化活性。酶解产物采用超滤技术分离、纳滤技术脱盐，此外，本发明以在我国产量极大的高温花生粕为原料制备高水解度的功能性短肽，为由于过度变性而难以深开发的花生粕蛋白的应用开拓了新的途径，具有很好的经济效益和社会效益。

Claims

1.一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于包括以下步骤：

5）将纳滤截留液进行冷冻干燥，即得高水解度功能性短肽。

2.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤1）中，所述高温花生粕粉碎至80目，所述高温花生粕与水的配比为1:8～12（m/v）；所述水可采用去离子水；所述花生粕粉料液最好调节pH为9.0～11.0，所述浸提的温度可为40～60℃，浸提的时间可为2h。

3.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤1）中，所述料液离心的条件为3000rpm、15min；所述上清液最好调节pH值至4.5；所述静置酸沉的时间可为30min；所述再离心的条件可为4000rpm、10min；所述干燥可采用冷冻干燥。

4.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤2）中，所述将步骤1）得到的花生蛋白粉进行亚硫酸钠前处理为：将花生蛋白粉溶解在去离子水中配制成浓度为3%～5%（m/v）的花生蛋白液，加热至50℃后，向花生蛋白液中加入Na₂SO₃至终浓度为0.04%～0.10%（m/v），并持续恒温搅拌1h。

5.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤3）中，所述前处理后的花生蛋白液调节至pH8.0～8.5、温度为50～55℃；所述加入碱性蛋白酶（Alcalase2.4，比活力138328U/g）的量可按每克花生蛋白加入5000～10000U/g酶；所述第一次酶解的时间可为180～240min。

6.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤3）中，所述加入菠萝蛋白酶的温度为40～45℃、pH6.0～7.0，加入菠萝蛋白酶（比活力49395U/g的量按每克花生蛋白加入5000～10000U/g的酶，所述第二次酶解时间可为180～240min。

7.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤3）中，在各段酶解过程中温度保持恒定，同时不断搅拌溶液，并通过加入1mol/L的NaOH来维持pH恒定；所述升温灭酶的条件可为在90℃下水浴灭酶20min。

8.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤4）中，所述离心的条件是在12000g条件下离心15min；所述超滤的条件为：采用截留分子量为1kDa的超滤膜，调节花生蛋白酶解液pH为6.8，在超滤压力为0.086～0.193MPa、超滤温度为25～45℃的条件下。

9.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤4）中，所述超滤采用恒体积超滤方式，所述恒体积超滤方式为：先在超滤设备料槽中加入超滤原液，然后利用一台辅助泵在超滤过程中向料槽内不断泵入去离子水，使水加入的流速与从超滤膜中透过的透过液流速相等，超滤过程中加入的去离子水总体积最好为料液初体积的2～6倍。

10.如权利要求1所述一种利用高温花生粕制备高水解度功能性短肽的方法，其特征在于在步骤4)中，所述纳滤的操作方法采用间歇式恒容积纳滤，纳滤的温度为25℃，纳滤的压力为1.5MPa；所述间歇式恒容积纳滤的具体操作方式可为：纳滤原液体积为V₀，经纳滤膜脱盐、浓缩至Vr，Vr=1/3V₀，再加水稀释至V₀，即每次透过液的体积与加水体积相同，随着加水次数的增多，粗盐脱除率逐渐增加，加水次数最好为10～20次。