KR20150031658A - 프로토펙티나아제를 이용한 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법 - Google Patents
프로토펙티나아제를 이용한 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 땅콩 종자를 발아시켜 땅콩새싹을 수득한 후, 수득된 땅콩새싹에 프로토펙티나아제를 처리한 후, 여과하고 감압농축 및 동결건조하는 것을 특징으로 하는 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로는 프로토펙티나아제를 이용하여 레스베라트롤의 함량이 높고 항산화 및 항암효과가 증진된 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
동북아 인류의 식물성 단백질원인 콩이 콩나물로, 녹두가 숙주나물로 진화해 아시아인의 주요 식재료로 사용된 데 이어 열대성 곡물인 땅콩이 나물로 새로 태어나고 있다. 땅콩이 땅콩새싹으로 자라는 과정에서 땅콩이 갖고 있는 고함량의 지질과 단백질이 각종 폴리페놀과 필수 아미노산 등 기능성 성분으로 변환해 계란, 우유 등의 동물성 완전식품보다 우수한 식물성 완전식품으로 재 탄생하는 것이다.
땅콩을 수경재배해 키운 땅콩 나물에는 장수 기대 물질인 레스베라트롤을 포함해 다양한 폴리페놀류와 비타민 등의 성분이 풍부하게 함유되어 있다. 농촌진흥청은 2008년말 땅콩을 콩나물처럼 키운 싹나물에서 항암성분인 레스베라트롤과 숙취해소에 좋다는 아스파라긴산이 다량 함유되어 있다는 연구결과를 밝혀, 땅콩 싹나물의 기능성 성분을 함유한 다양한 제품 개발과 산업화 가능성을 제시하고 있다.
또한, 땅콩 새싹에는 지금까지 알려진 성분 중에서 항암, 항산화 작용이 뛰어난 레스베라트롤이 포도주의 50배 정도가 들어있는 것으로 밝혀졌으며(농촌진흥청 발표 2010. 3.12,: 땅콩새싹 실용화 기술 연구) 숙취해소에 뛰어난 아스파라긴산이 콩나물의 60배 가까이 함유되어 있다고 보고하고 있다.
한편, 과채류의 가공공정에서 가장 문제가 되는 것으로는 열처리 및 기계적 마쇄로 인한 영양 및 생리활성성분들의 파괴, 색이나 향기와 같은 기호성분의 변화, 부유물질의 생성 등이 있다.
이에 땅콩새싹을 이용하여 제품화함에 있어, 땅콩새싹의 영양 및 생리활성성분들을 파괴하지 않으며 가공하는 기술의 개발이 절실히 요구되는 실정이다. 이에 본 발명의 발명자들은 땅콩새싹을 단세포화하여 영양의 파괴없이 제품화하는 기술에 대하여 예의연구한 결과, 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.
본 발명은 프로토펙티나아제 처리로 땅콩새싹의 영양이 손실되지 않아, 레스베라트롤의 함량이 높고, 항산화 및 항암효과가 증진되는 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 땅콩 종자를 발아시켜 땅콩새싹을 수득한 후, 수득된 땅콩새싹에 증류수를 가하고 프로토펙티나아제를 처리한 후, 여과하고 감압농축 및 동결건조하는 것을 특징으로 하는 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 땅콩새싹이 땅콩 종자를 7 ~ 9일간 발아시킨 것을 특징으로 하는 땅콩 새싹 효소 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로토펙티나아제를 땅콩새싹에 대하여 2 ~ 2.5중량% 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 땅콩 새싹 효소 추출물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프로토펙티나아제 처리를 pH 5 ~ 5.5의 조건에서 6시간 ~ 8시간 30분동안 진행하는 것을 특징으로 하는 땅콩 새싹 효소 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 땅콩새싹 효소 추출물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 프로토펙티나아제를 이용하여 땅콩새싹 효소 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
프로토펙티나아제(Protopectinase)는 식물세포에 있어 세포와 세포간의 중엽부(middle lamella)의 주성분을 이루는 펙틴(pectin)의 모체가 되는 불용성 프로토펙틴(protopectin)을 제한가수분해하여 수용성 펙틴(pectin)을 생산하는 효소이다. 이에 땅콩새싹을 프로토펙티나아제로 효소처리하면 세포벽이 가수분해되어 단세포화되는 동시에 세포막은 보존되어 세포 안에 존재하는 영양소의 손실을 최소화할 수 있다. 이에 본 발명은 프로토펙티나아제 처리에 의하여 땅콩새싹을 단세포화함에 따라 추출성의 증대와 유효 생리활성성분 손실의 최소화라는 이점을 얻을 수 있다.
여기서, 땅콩새싹은 땅콩 종자를 7 ~ 9일간 발아, 바람직하게는 9일간 발아시킨 것을 사용하는 것이 좋다. 땅콩 종자를 상기 기간 동안 발아시키는 경우 땅콩 새싹의 레스베라트롤의 함량이 매우 높아져 항산화 및 항암효과를 대폭 증진시킬 수 있다.
또한, 프로토펙티나아제는 상기 땅콩새싹에 대하여 2 ~ 2.5중량% 농도로 처리되는 것이 바람직하다. 프로토펙티나아제를 상기 농도 범위로 처리하는 경우 잔사율이 대폭 감소될 뿐만 아니라 폴리페놀의 함량이 대폭 증진되어 항산화 및 항암효과가 매우 증진될 수 있다.
또한, 이때 pH는 5 ~ 5.5의 범위로 하며, 처리시간은 6시간 ~ 8시간 30분 정도로 하는 것이 추출 효율 면에서 바람직하다.
예를 들면, 본 발명의 땅콩새싹 효소 추출물은 땅콩 종자를 9일간 발아시켜 땅콩새싹을 수득한 후, 수득된 땅콩새싹에 증류수를 가한 뒤, pH를 5 ~ 5.5의 범위로 맞춰준 후, 무게 당 2 ~ 2.5중량% 농도로 프로토펙티나아제를 첨가한 뒤 대략 50℃에서 6시간 ~ 8시간 30분 정도 교반하고, 여과 후 감압농축 및 동결건조함으로써 제조할 수 있다.
이와 같이 수득된 땅콩새싹 효소 추출물은 기계적 마쇄 공정을 거친 땅콩새싹 물 추출물에 비하여 레스베라트롤의 함량이 매우 높으며, 항산화 및 항암 효과도 높다. 이는 상기와 같이 프로토펙티나아제를 이용하여 땅콩새싹 효소 추출물을 제조함에 따라, 땅콩새싹의 세포벽이 가수분해되어 단세포화되는 동시에 세포막은 보호되어 유효 생리활성성분의 손실을 최소화하며 추출성이 좋아진 결과로 판단되었다.
따라서, 이와 같이 제조된 본 발명의 땅콩새싹 효소 추출물은 각종 기능성 식품이나 약학 소재로 유의 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명에 의하면, 프로토펙티나아제 처리에 의하여 땅콩새싹의 세포벽이 가수분해되어 단세포화되는 동시에 세포막은 보호되어 땅콩새싹의 영양의 손실을 최소화할 수 있으며, 추출성도 증진시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면, 프로토펙티나아제 처리에 의하여 레스베라트롤의 함량이 매우 높아져 항산화 및 항암효과가 증진된 땅콩새싹 효소 추출물을 제조할 수 있다.
도 1은 본 실험예 2의 땅콩새싹 효소 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성 실험 결과이다.
도 2는 본 실험예 3의 땅콩새싹 효소 추출물의 대장암세포(HT-29) 억제 실험 결과이다.
도 3은 본 실험예 3의 땅콩새싹 효소 추출물의 전립선암세포(RC-58T) 억제실험 결과이다.
도 2는 본 실험예 3의 땅콩새싹 효소 추출물의 대장암세포(HT-29) 억제 실험 결과이다.
도 3은 본 실험예 3의 땅콩새싹 효소 추출물의 전립선암세포(RC-58T) 억제실험 결과이다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
실험예 1 : 최적의 효소 처리 조건의 확립
땅콩새싹의 최적의 효소처리 조건을 확립하고자, 효소농도, 반응시간, pH 조건을 각각 달리하며, 잔사율 및 폴리페놀 함량을 측정하였다.
구체적으로 땅콩새싹을 깨끗이 세척한 후, 3 ~ 5cm 절단하여 무게 당 3배수의 증류수를 가한 후, 구연산을 이용하여 pH를 5, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5로 달리하며, 무게당 1, 1.3, 1.5, 2, 2.5중량% 농도로 프로토펙티나아제를 첨가한 뒤 50℃에서 반응시간을 6시간, 6시간 30분, 7시간, 7시간 30분, 8시간, 8시간 30분으로 달리하며 교반하여 효소처리하였다. 이후, 각각의 처리조건에서 잔사율과 폴리페놀함량을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
(폴리페놀 함량 단위 : mg/g)
상기 표 1에 의하면, 효소농도가 2 ~ 2.5중량%, 반응시간이 6시간에서 8시간 30분, pH 5.0 ~ 5.5의 조건인 경우 잔사율이 대폭 감소하며, 폴리페놀 함량은 대폭 증가함을 알 수 있었다. 땅콩새싹 추출 후에는 잔사물이 부산물로 발생하여 폐기물 처리가 문제되는데, 상기 조건으로 효소처리를 하면 잔사율이 대폭 감소되는바, 수율 향상과 폐기물 처리의 감소라는 측면에서 매우 유리함을 알 수 있었다.
한편, 효소농도 2중량%, 반응시간 7시간, pH 5.2인 경우 잔사율은 13%로 매우 낮으며, 폴리페놀 함량은 23.4±3.1 mg/g으로 매우 높은바, 하기에서는 이러한 조건으로 효소처리를 하였다.
제조예
: 땅콩새싹 효소 추출물의 제조(효소처리에 의한 단세포화 가공)
수확한 땅콩새싹을 깨끗이 세척한 뒤 3~5cm 절단하여 무게 당 3배수의 증류수를 가하였으며 구연산을 이용하여 pH 5.2를 맞춰 주었다. 그 뒤 무게 당 2중량% 농도로 프로토펙티나아제를 첨가한 뒤 50℃에서 7시간 교반하였다. 0.45㎛ 실린지 필터(sylinge filter)로 여과한 후, 감암농축(SB-1000, EYELA, Tokyo, Japan)하였다. 그 후 동결건조(FD 5805, IlShin, Yangju, Korea)하였으며 분쇄 후 과립형태로 제조하였다.
비교예 : 땅콩새싹 물 추출물의 제조(기계적 마쇄 처리 가공)
수확한 땅콩새싹을 깨끗이 세척하여 완전히 건조한 뒤 분쇄하여 분말화 하였으며, 무게 당 8배의 증류수를 가하여 60℃에서 24시간 교반하면서 유효성분을 추출하였다. 0.45㎛ 실린지 필터(sylinge filter)로 여과한 후, 감암농축(SB-1000, EYELA, Tokyo, Japan)하였다. 그 후 동결건조(FD 5805, IlShin, Yangju, Korea)하였으며 분쇄 후 과립형태로 제조하였다.
실험예 2 : 땅콩새싹 효소 추출물의 항산화 실험
본 실험예에서는 상기 제조예와 비교예의 땅콩새싹 효소 추출물과 땅콩새싹 물 추출물에 대하여 항산화 실험을 진행하였다.
- DPPH 라디칼 소거활성
DPPH 라디칼 소거활성은 Blois 등의 방법에 따라 측정하였다. 상기 제조예와 비교예의 추출물을 에탄올로 희석하여 농도별로 준비한 시료 600 μL에 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl)200 μL를 첨가하여 암조건에서 30분간 반응시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 시료 대신 에탄올을 넣어 측정하였으며, 다음 계산식에 의거하여 소거활성(%)을 측정하였다.
그 결과는 하기 도 1에 나타내었다.
하기 도 1에 나타나는 바와 같이, 효소 추출의 경우 물 추출(일반추출)에 비하여 DPPH 소거활성이 높게 나타났다. 이는 프로토펙티나아제의 처리로 인하여 세포벽이 가수분해 되고 세포막이 보호됨에 따라 항산화 물질의 손실은 방지되고 추출성은 좋아진 것이라 판단되었다.
- 환원력, ABTS 라디칼 소거활성 및 베타카로틴 탈색활성
환원력은 Yildirim 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 1ml 에 인산완충용액(0.2M, pH 6.6) 2.5ml, potassium ferricyanide (1%, w/v)을 첨가하여 섞은 후 50℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액에 trichloroacetic acid(10%, w/v) 2.5ml을 첨가한 후 3000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상등액 1ml을 취하여 증류수 1ml과 FeCl3 0.2ml을 첨가하여 700nm에서 흡광 측정하였다.
ABTS 라디칼 소거 활성은 Van den Berg등의 방법을 변형하여 측정하였다. 7mM의 2,2'-azobis(2-aminopropane) dihydrochloride(AAPH)와 2.45mM의 ABTS를 혼합한 후 23℃의 암조건에서 16시간 동안 반응시켰다. ABTS 용액의 농도는 734nm에서 0.700±0.005 정도가 되도록 조정하였다. 시료 0.1ml와 ABTS 용액 3.9ML 용액을 혼합한 후 23℃에서 6분간 반응시키면서 734nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 0.1% BHT와 1mg/ml α-Tocopherol을 사용하였으며 다음 계산식에 의거하여 소거활성(%)을 측정하였다.
베타카로틴 탈색활성(β-carotene bleaching assay)은 β-carotene linoleate system을 이용한 항산화 측정으로 Elzaawely 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 클로로포름 50ml에 β-carotene 50mg을 용해하여 β-carotene 용액을 만든 후 β-carotene 용액 10ml에 linoleic acid 40mg, tween 40 400mg를 첨가하여 40℃에서 진공회전농축하여 클로로포름을 제거한 후 증류수 100ml를 첨가하여 진탕하여 emulsion 용액을 제조하였다. emulsion 용액 4ml에 시료, 에탄올(대조구), 양성 대조구인 α-tocopherol과, BHC 용액 0.2ml을 첨가하여 50℃ 배양기에 저장하였다. 저장기간 중 0분에서 120분 동안 15분 간격으로 470nm에서 흡광도 측정을 하였다.
그 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에 나타나는 바와 같이, 효소 추출의 경우 물 추출(일반추출)에 비하여 환원력, ABTS 라디칼 소거활성, 베타카로틴 탈색활성이 높게 나타났다. 이는 프로토펙티나아제의 처리로 인하여 세포벽이 가수분해 되고 세포막이 보호됨에 따라 항산화 물질의 손실은 방지되고 추출성은 좋아진 것이라 판단되었다.
실험예 3: 땅콩새싹 효소 추출물의 항암실험(MTT assay)
본 실험예에서는 상기 제조예와 비교예의 땅콩새싹 효소 추출물과 땅콩새싹 물 추출물에 대하여 암세포의 생존율을 측정함으로써 항암 효능을 알아보았다.
- 대장암세포(HT-29) 억제실험
배양이 끝난 세포 생존율은 Chung 등이 사용한 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉 세포를 96-well plates에 1×106cells/mL 농도로 150 ㎕씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 항생제가 첨가되지 않은 배지에 시료을 농도별로 제조한 후 세포에 처리하였고, 처리 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 MEM의 10분의 1에 해당하는 MTT 용액(5 mg/mL)을 가하여 주고 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시킨 후 상층액을 제거하였다. 그런 다음 암 조건에서 30분간 건조 한 후 DMSO를 100 ㎕씩 분주하여 1시간 동안 shaking 한 후 570 nm 에서 흡광측정하였다.
그 결과는 도 2에 나타내었다. 하기 도 2에 의하면, 정제된 레스베라트롤은 농도가 증가함에 따라 대장암세포 억제효능이 높아짐을 알 수 있었으며, 나아가 효소 추출의 경우 물 추출(일반추출)에 비하여 대장암세포 억제효능이 높게 나타났다. 이는 프로토펙티나아제의 처리로 인하여 세포벽이 가수분해 되고 세포막이 보호됨에 따라 항암 물질의 손실을 방지되고 추출성은 좋아진 것이라 판단되었다.
- 전립선암세포(RC-58T) 억제실험
배양이 끝난 세포 생존율은 Chung 등이 사용한 3-[4,5-dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT) 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉 세포를 96-well plates에 1×106cells/mL 농도로 150 ㎕씩 분주한 뒤 24시간 동안 배양한 후 FBS와 항생제가 첨가되지 않은 배지에 시료을 농도별로 제조한 후 세포에 처리하였고, 처리 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 MEM의 10분의 1에 해당하는 MTT 용액(5 mg/mL)을 가하여 주고 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시킨 후 상층액을 제거하였다. 그런 다음 암 조건에서 30분간 건조 한 후 DMSO를 100 ㎕씩 분주하여 1시간 동안 shaking 한 후 570 nm 에서 흡광 측정하였다.
그 결과는 도 3에 나타내었다. 하기 도 3에 의하면, 정제된 레스베라트롤은 농도가 증가함에 따라 전립선암세포 억제효능이 높아짐을 알 수 있었으며, 나아가 효소 추출의 경우 물 추출(일반추출)에 비하여 전립선암세포 억제효능이 높게 나타났다. 이는 프로토펙티나아제의 처리로 인하여 세포벽이 가수분해 되고 세포막이 보호됨에 따라 항암 물질의 손실을 방지되고 추출성은 좋아진 것이라 판단되었다.
실험예 4 : 땅콩새싹 효소 추출물의 레스베라트롤의 함량 측정(HPLC)
본 실험예에서는 상기 제조예와 비교예의 방법으로 제조된 땅콩새싹 효소 추출물, 땅콩새싹 물 추출물에 대하여 땅콩새싹의 생장일수에 따른 레스베라트롤의 함량 변화를 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 측정하였다.
이때, HPLC 분석 조건은 다음과 같다.
< HPLC 분석 조건 >
기기 : Shimadzu CBM-20A
컬럼 : Eclipse XDB-C18, 4.6×150mm, 5m, Agilent
용매 A : 물(0.1% TFA)
용매 B : 아세토니트릴(0.1% TFA)
구배조건 : 0분, 10%B; 2분, 10%B; 5분, 20%B; 15분, 40%B; 20분, 40%B; 25분, 100%B
주입부피 : 10㎕
유동속도 : 1.0ml/분
그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
상기 표 3에 의하면, 효소 추출과 물 추출 모두 생장일수가 길어질수록 레스베라트롤의 함량이 높아짐을 알 수 있었으며, 효소 추출의 경우 물 추출(일반추출)에 비하여 레스베라트롤의 함량이 대폭 증가함을 알 수 있었다. 이는 앞선 항산화 실험 및 항암 실험 결과와도 일치하는 결과라고 판단되었다.
이상 종합하면, 프로토펙티나아제 효소 처리로 인한 세포막의 보존이 땅콩새싹의 가공 처리 중 발생되는 유효 생리활성성분의 손실을 대폭 줄여, 항산화, 항암 효과를 증진시킴을 알 수 있었다. 즉, 기계적 마쇄 과정 중에는 식물 세포의 파괴에 따라 유효 생리활성성분이 많이 손실되는 반면, 프로토펙티나아제로 효소처리하면 식물 세포의 파괴를 최소화할 수 있어 가공 과정 중 발생되는 유효 생리활성성분의 손실을 최소화할 수 있어 항산화와 항암효과가 대폭 증진될 수 있고, 이에 땅콩새싹 효소 추출물은 각종 건강기능식품이나 약학소재로 활용될 수 있으리라 판단되었다.
Claims (4)
- 땅콩 종자를 발아시켜 땅콩새싹을 수득한 후,
수득된 땅콩새싹에 증류수를 가하고 프로토펙티나아제를 처리한 후,
여과하고 감압농축 및 동결건조하는 것을 특징으로 하는 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 땅콩새싹은 땅콩 종자를 7 ~ 9일간 발아시킨 것을 특징으로 하는 땅콩 새싹 효소 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 프로토펙티나아제는 땅콩새싹에 대하여 2 ~ 2.5중량% 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 땅콩 새싹 효소 추출물의 제조방법.
- 제1항에 있어서,
상기 프로토펙티나아제 처리는 pH 5 ~ 5.5의 조건에서 6시간 ~ 8시간 30분동안 진행하는 것을 특징으로 하는 땅콩 새싹 효소 추출물의 제조방법.
Priority Applications (1)
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| KR20130111127A KR20150031658A (ko) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | 프로토펙티나아제를 이용한 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법 |
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|---|---|---|---|
| KR20130111127A KR20150031658A (ko) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | 프로토펙티나아제를 이용한 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법 |
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| KR20130111127A KR20150031658A (ko) | 2013-09-16 | 2013-09-16 | 프로토펙티나아제를 이용한 땅콩새싹 효소 추출물의 제조방법 |
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| KR (1) | KR20150031658A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021004463A1 (zh) * | 2019-07-08 | 2021-01-14 | 桂林理工大学 | 一种高压辅助酶解制备的花生抗氧化肽及其制备方法 |
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2013
- 2013-09-16 KR KR20130111127A patent/KR20150031658A/ko active IP Right Grant
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|---|---|---|---|---|
| WO2021004463A1 (zh) * | 2019-07-08 | 2021-01-14 | 桂林理工大学 | 一种高压辅助酶解制备的花生抗氧化肽及其制备方法 |
| GB2590263A (en) * | 2019-07-08 | 2021-06-23 | Univ Guilin Technology | Peanut antioxidative peptide prepared from high pressure-assisted enzymatic hydrolysis and preparation method therefor |
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