CN114478703B

CN114478703B - 一种乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽及其制备方法

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Publication number: CN114478703B
Application number: CN202111548665.2A
Authority: CN
Inventors: 孟永宏; 杨雪言; 李封辰; 师琳珊; 张帅; 路亚龙
Original assignee: Shaanxi Normal University
Current assignee: Shaanxi Normal University
Priority date: 2021-12-17
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2041-12-17
Also published as: CN114478703A

Abstract

本发明公开了一种乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽及其制备方法，所述漆籽粕蛋白肽是氨基酸序列为Val‑Lys‑Gly‑Asn‑Phe‑Leu‑Gln‑His‑Ile‑Met‑Arg‑Glu‑Val、Gly‑His‑Val‑Leu‑Cys‑Glu‑Phe‑Ser‑Cys‑Ala‑Met‑Asn‑Val和Ala‑Trp‑Cys‑Arg‑Leu‑Ile‑His‑Glu‑Met‑Asp‑Phe的多肽混合物。本发明以廉价的漆籽粕为原料，经正己烷脱脂后，碱溶酸沉提取蛋白，再利用碱性蛋白酶低限度酶解，最后采用超滤分离和凝胶层析纯化，获得漆籽粕蛋白肽。本发明漆籽粕蛋白肽具有良好的乳化活性和乳化稳定性，且制备工艺简单，易于分离纯化，生产成本低，适合大规模商业化生产，同时实现了漆籽粕中粗蛋白的高值化利用，对促进漆树产业的可持续发展具有重要意义。

Description

一种乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽及其制备方法

技术领域

本发明属于多肽产品技术领域，具体涉及一种乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽及其制备方法。

背景技术

蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要成分，人体的生长、发育都需要大量蛋白质的摄入。因此，人们对蛋白质常用的功能特性，如溶解性、乳化性、乳化稳定性、起泡性、起泡稳定性等都非常关注，但是许多蛋白质受其自身结构的影响，部分特性并不如人们所愿，因此就需要借助一些方法对蛋白质进行改性。目前常用的改性方法有物理改性、化学改性以及酶法改性。物理改性方法主要包括热处理、超声处理、微波、超高压处理等，化学改性方法主要有蛋白质-多糖的美拉德反应以及蛋白质-磷酸盐的磷酸化反应，这些方法虽简单易行，但处理过程中极端的环境和条件会造成蛋白质营养的损失，并且生产过程中会产生大量废水，造成环境污染。与之相比，酶法改性具有条件温和、水解效率高、环境友好等众多优点。值得注意的是，酶解工艺的选择对于水解产物功能特性的影响非常大，相关研究表明，适度的酶解可以有效改善蛋白质的功能特性，但当水解度过大时，肽链较短，这会严重影响水解产物的功能性质，甚至会造成某些功能性质的大幅降低甚至丧失。此外，水解产物的功能特性，不仅与氨基酸组成有关，与其分子量的分布也密切相关，据相关研究，分子量小于500道尔顿的水解产物多由寡肽和氨基酸组成，这一分子量范围的产物不仅功能活性较低，并且大多为苦味肽。

漆树(Rhus verniciflua stokes)为漆树科(Anacardiaceae)漆树属(Toxicodendron)的一种落叶乔木。漆树是我国重要的特用经济林，生漆是天然树脂涂料，素有“涂料之王”的美誉。漆籽为漆树的果实，其中果皮为蜡质层，可以提取漆蜡，内核为种子，可榨取漆油。据统计，我国现有漆树5亿多株，年产漆籽200多万吨。目前对漆籽的研究主要集中在漆油提取及精制加工等方面，例如专利CN108998205A、CN103849470A、CN107557136A等。而在漆籽提取漆油(蜡)的过程中会产生大量漆籽粕，占漆籽总量的70％左右，漆籽粕中含有多种有益成分，其中粗蛋白含量可达20％，但由于缺乏加工技术，大量漆籽粕作为废渣进行焚烧处理，造成了严重的资源浪费和经济损失。为了充分利用资源，扩大漆籽蛋白的应用范围，对其进行合理处理进而制备功能特性良好的蛋白肽具有重要意义，同时也实现了漆籽加工副产物的提质增效。

发明内容

本发明的目的是提供一种乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽及其制备方法，通过结合低限度酶解和基于分子量大小的肽段筛选，有效提高水解产物的乳化活性和乳化稳定性，以实现漆树籽粕中粗蛋白的高值化利用，促进漆树产业的综合发展。

针对上述目的，本发明乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽是氨基酸序列为Val-Lys-Gly-Asn-Phe-Leu-Gln-His-Ile-Met-Arg-Glu-Val、Gly-His-Val-Leu-Cys-Glu-Phe-Ser-Cys-Ala-Met-Asn-Val和Ala-Trp-Cys-Arg-Leu-Ile-His-Glu-Met-Asp-Phe的多肽混合物，各多肽占漆籽粕多肽的质量百分比依次为8％～12％、38％～42％、48％～52％。

上述乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽的制备方法由下述步骤组成：

(1)脱脂漆籽粕粉的制备

将漆籽粕经高速粉碎机粉碎后过60～80目筛，利用正己烷，按料液比1g:5～15mL在常温条件下进行浸提，除去残留的漆籽油，得到脱脂漆籽粕粉。

(2)漆籽粕蛋白的制备

按照料液比1g:10～20mL，向脱脂漆籽粕粉中加入去离子水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH为10～12，常温下搅拌浸提1.5～2h，离心取上清液，然后用1mol/L HCl水溶液调pH为4～5，于室温静置90～120min，离心所得沉淀经水洗后冷冻干燥，得到漆籽粕蛋白粉。

(3)低限度酶解

将漆籽粕蛋白粉以1g:15～25mL的比例重悬于去离子水中，用1mol/L HCl水溶液调节pH为8～10，再加入碱性蛋白酶进行限制性酶解，控制水解度为3％～10％；然后将酶解液于90～100℃下煮沸10～15min灭酶，冷却后离心，收集上清液，得到漆籽粕蛋白水解液。

(4)基于分子量大小的肽段筛选

将漆籽粕蛋白水解液分别经1kDa、3kDa、5kDa截留分子量的超滤膜分离，收集分子量范围为3～5kDa的水解物进行冷冻干燥，得到漆籽粕蛋白肽初提物。

(5)蛋白水解物的凝胶层析纯化

将漆籽粕蛋白肽初提物溶解于去离子水中，然后对该组分进行凝胶层析纯化，固定相为Sephadex G-25，利用纯水洗脱，洗脱流速为0.3～0.7mL/min，洗脱液在220nm处用分光光度计比色，将同一洗脱峰下的组分进行合并，收集保留时间在9～12min的组分，将其冷冻干燥，即得具有良好乳化性能的漆籽粕蛋白肽。

上述步骤(3)中，优选碱性蛋白酶的加入量为漆籽粕蛋白粉重量的2％～5％。

上述步骤(3)中，优选限制性酶解的温度为45～55℃，时间为2～5h。

本发明的有益效果如下：

1、本发明漆籽粕蛋白肽的水解度低、分子量适中，具有良好的乳化性能，且制备工艺简单，易于分离纯化，适合大规模商业化生产。

2、本发明以廉价的漆树籽粕为原料，大大降低了生产成本，同时有效利用了漆籽粕中的蛋白资源，对促进漆树产业的可持续发展具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。

下面实施例中水解度及乳化性测定方法如下：

1、水解度(DH)的测定

采用茚三酮比色法测定水解度(DH)。以去离子水为溶剂，配制20μg/mL甘氨酸标准溶液，取此液再分别用去离子水稀释成甘氨酸含量为0～20μg/mL甘氨酸水溶液用于绘制标准曲线。分别取2mL不同浓度甘氨酸水溶液于试管中，加入1mL茚三酮显色剂，混匀后沸水浴15min，同时作空白试验，然后冷水冷却，加入5mL体积浓度为40％的乙醇水溶液混匀，放置15min后，于570nm波长处测定吸光值，以甘氨酸含量为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

取漆籽粕蛋白水解液0.5mL，稀释至50mL，取0.4mL稀释液于试管中，加入1.6mL去离子水、1mL茚三酮显色剂，以后操作同标准曲线，以随行试剂为空白，同时作3次重复实验，利用标准曲线计算水解液中氨基含量，同时按照下面公式计算水解液的水解度。

式中：h_tot是每克蛋白质的肽键毫摩尔数，经计算得漆籽粕蛋白肽的h_tot＝6.74mmol/g；6.25×N是漆籽粕蛋白肽含量(g/L)，凯氏定氮法测定。

2、乳化性测定方法

乳化性及乳化稳定性的测定参考Ziegler等人(2018)的方法，并稍做修改。具体方法为：准确称取100mg样品分散于去离子水中，配制为10mg/mL的样品溶液。取6mL样品溶液加入2mL核桃油、漆籽油、橄榄油或茶油中的任意一种，使用高剪切分散乳化机均质3min，立即从溶液底部移取50μL样品，加入5mL 1mg/mL的十二烷基硫酸钠水溶液后，涡旋震荡5s，在500nm处测定样品吸光值。将乳液置于室温条件下，静置10min后再次取样，测定样品的乳化稳定性。乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)的计算公式如下：

式中：DF为稀释因子(100)；c为样品浓度(g/mL)；Φ为光路(1cm)；θ为油相在乳液的分散系数(0.25)；A₀和A₁₀别是样品在0min、10min的吸光值。

实施例1

(1)脱脂漆籽粕粉的制备

将漆籽粕经高速粉碎机粉碎后过60目筛，利用正己烷，按料液比1g:5mL在常温条件下进行搅拌浸提三次，每2h更换一次正己烷，除去残留的漆籽油；然后于常温风干以除去多余的正己烷，收集脱脂漆籽粕粉并于4℃保存。

(2)漆籽粕蛋白的制备

按照料液比1g:10mL，向脱脂漆籽粕粉中加入去离子水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH为11，常温下磁力搅拌浸提2h，8000r/min离心10min，取上清液用1mol/L HCl水溶液调pH为4.5，于4℃静置60min，8000r/min离心10min，所得沉淀水洗2次后进行冷冻干燥，得到漆籽粕蛋白粉。

(3)低限度酶解

称取得到漆籽粕蛋白粉10g，重悬于200mL去离子水中，用1mol/L HCl水溶液调节pH至9，再加入0.5g碱性蛋白酶，于50℃下搅拌酶解3h，测得水解度为7.23％，然后将酶解液于90℃下煮沸15min灭酶，冷却后的酶解液于4℃下8000r/min离心20min，收集上清液，即得到漆籽粕蛋白水解液，于4℃冷藏。

(4)基于分子量大小的肽段筛选

将漆籽粕蛋白水解液分别经1kDa、3kDa、5kDa截留分子量的超滤膜分离，将其分为＜1kDa、1～3kDa、3～5kDa、＞5kDa这四个分子量范围的水解物，分别测定不同分子量范围水解物的乳化活性和乳化稳定性，结果见表1。对活性最高的3～5kDa组分进行冷冻干燥，即得漆籽粕蛋白肽初提物。

(5)蛋白水解物的凝胶层析纯化

将漆籽粕蛋白肽初提物溶解于去离子水中，配制成100mg/mL的溶液，然后对该溶液进行凝胶层析纯化，固定相为Sephadex G-25，利用纯水洗脱，洗脱流速为0.5mL/min，洗脱液在220nm处用分光光度计比色，自动收集器设定为每5min收集一次，将同一洗脱峰下的组分进行合并，分离得到5个多肽组分，分别收集各组分并测定其乳化活性和乳化稳定性，筛选出高乳化活性洗脱峰对应的组分，即保留时间在9～12min的组分(第2个多肽组分，见表2)，将其冷冻干燥，即得具有良好乳化性能的漆籽粕蛋白肽。经检测，该漆籽粕蛋白肽乳化活性EAI(m²/g)＝156.28，乳化稳定性ESI(min)＝113.74。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪对该漆籽粕蛋白肽进行氨基酸序列测定，基质采用α-氰基-4-羟基肉桂酸，溶剂采用三氟乙酸、乙腈和超纯水。将α-氰基-4-羟基肉桂酸溶于含0.1％(v/v)三氟乙酸的50％乙腈(v/v)水溶液中，制成α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液，离心，取5μL上清液与5μL样品等体积混合，取5μL点靶，送入离子源中进行质谱检测，经测定，该漆籽粕蛋白肽是氨基酸序列为Val-Lys-Gly-Asn-Phe-Leu-Gln-His-Ile-Met-Arg-Glu-Val、Gly-His-Val-Leu-Cys-Glu-Phe-Ser-Cys-Ala-Met-Asn-Val和Ala-Trp-Cys-Arg-Leu-Ile-His-Glu-Met-Asp-Phe的混合物，其各自占混合物质量的百分比为10％、40％、50％。

实施例2

(1)脱脂漆籽粕粉的制备

将漆籽粕经高速粉碎机粉碎后过70目筛，利用正己烷，按料液比1g:10mL在常温条件下进行搅拌浸提三次，每2h更换一次正己烷，除去残留的漆籽油；然后于常温风干以除去多余的正己烷，收集脱脂漆籽粕粉并于4℃保存。

(2)漆籽粕蛋白的制备

按照料液比1g:15mL，向脱脂漆籽粕粉中加入去离子水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH为9，常温下磁力搅拌浸提2h，8000r/min离心10min，取上清液用1mol/L HCl水溶液调pH为4，于4℃静置60min，8000r/min离心10min，所得沉淀水洗2次后进行冷冻干燥，得到漆籽粕蛋白粉。

(3)低限度酶解

称取得到漆籽粕蛋白粉10g，重悬于150mL去离子水中，用1mol/L HCl水溶液调节pH至9，再加入0.5g碱性蛋白酶，于50℃下搅拌酶解2h，测得水解度为3.52％，然后将酶解液于90℃下煮沸15min灭酶，冷却后的酶解液于4℃下9000r/min离心20min，收集上清液，即得到漆籽粕蛋白水解液，于4℃冷藏。

(4)基于分子量大小的肽段筛选

(5)蛋白水解物的凝胶层析纯化

将漆籽粕蛋白肽初提物溶解于去离子水中，配制成100mg/mL的溶液，然后对该溶液进行凝胶层析纯化，固定相为Sephadex G-25，利用纯水洗脱，洗脱流速为0.3mL/min，洗脱液在220nm处用分光光度计比色，自动收集器设定为每5min收集一次，将同一洗脱峰下的组分进行合并，分离得到5个多肽组分，分别收集各组分并测定其乳化活性和乳化稳定性，筛选出高乳化活性洗脱峰对应的组分，即保留时间在9～12min的组分(第2个多肽组分，见表2)，将其冷冻干燥，即得具有良好乳化性能的漆籽粕蛋白肽。经检测，该组分的乳化活性EAI(m²/g)＝149.08，乳化稳定性ESI(min)＝106.47。

实施例3

(1)脱脂漆籽粕粉的制备

将漆籽粕经高速粉碎机粉碎后过80目筛，利用正己烷，按料液比1g:5mL在常温条件下进行搅拌浸提三次，每2h更换一次正己烷，除去残留的漆籽油；然后于常温风干以除去多余的正己烷，收集脱脂漆籽粕粉并于4℃保存。

(2)漆籽粕蛋白的制备

按照料液比1g:20mL，向脱脂漆籽粕粉中加入去离子水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH为12，常温下磁力搅拌浸提2h，8000r/min离心10min，取上清液用1mol/L HCl水溶液调pH为5，于4℃静置60min，8000r/min离心10min，所得沉淀水洗2次后进行冷冻干燥，得到漆籽粕蛋白粉。

(3)低限度酶解

称取得到漆籽粕蛋白粉10g，重悬于250mL去离子水中，用1mol/L HCl水溶液调节pH至9，再加入0.5g碱性蛋白酶，于50℃下搅拌酶解5h，测得水解度为9.82％，然后将酶解液于90℃下煮沸15min灭酶，冷却后的酶解液于4℃下9000r/min离心20min，收集上清液，即得到漆籽粕蛋白水解液，于4℃冷藏。

(4)基于分子量大小的肽段筛选

(5)蛋白水解物的凝胶层析纯化

将漆籽粕蛋白肽初提物溶解于去离子水中，配制成100mg/mL的溶液，然后对该溶液进行凝胶层析纯化，固定相为Sephadex G-25，利用纯水洗脱，洗脱流速为0.7mL/min，洗脱液在220nm处用分光光度计比色，自动收集器设定为每5min收集一次，将同一洗脱峰下的组分进行合并，分离得到5个多肽组分，分别收集各组分并测定其乳化活性和乳化稳定性，筛选出高乳化活性洗脱峰对应的组分，即保留时间在9～12min的组分，(第2个多肽组分，见表2)将其冷冻干燥，即得具有良好乳化性能的漆籽粕蛋白肽。经检测，该组分的乳化活性EAI(m2/g)＝140.42，乳化稳定性ESI(min)＝101.25。

表1实施例1～3中经不同分子量超滤膜后各组分乳化能力对比

表2实施例1～3中凝胶层析后各组分乳化能力对比

Claims

1.一种乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽，其特征在于：所述漆籽粕蛋白肽是氨基酸序列为Val-Lys-Gly-Asn-Phe-Leu-Gln-His-Ile-Met-Arg-Glu-Val、Gly-His-Val-Leu-Cys-Glu-Phe-Ser-Cys-Ala-Met-Asn-Val和Ala-Trp-Cys-Arg-Leu-Ile-His-Glu-Met-Asp-Phe的多肽混合物，各多肽占漆籽粕多肽的质量百分比依次为8％～12％、38％～42％、48％～52％。

2.一种权利要求1所述的乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽的制备方法，其特征在于所述方法由下述步骤组成：

(1)脱脂漆籽粕粉的制备

将漆籽粕经高速粉碎机粉碎后过60～80目筛，利用正己烷，按料液比1g:5～15mL在常温条件下进行浸提，除去残留的漆籽油，得到脱脂漆籽粕粉；

(2)漆籽粕蛋白的制备

按照料液比1g:10～20mL，向脱脂漆籽粕粉中加入去离子水，用1mol/L NaOH水溶液调节pH为10～12，常温下搅拌浸提1.5～2h，离心取上清液，然后用1mol/LHCl水溶液调pH为4～5，于室温静置90～120min，离心所得沉淀经水洗后冷冻干燥，得到漆籽粕蛋白粉；

(3)低限度酶解

将漆籽粕蛋白粉以1g:15～25mL的比例重悬于去离子水中，用1mol/L HCl水溶液调节pH为8～10，再加入碱性蛋白酶进行限制性酶解，控制水解度为3％～10％；然后将酶解液于90～100℃下煮沸10～15min灭酶，冷却后离心，收集上清液，得到漆籽粕蛋白水解液；

(4)基于分子量大小的肽段筛选

将漆籽粕蛋白水解液分别经1kDa、3kDa、5kDa截留分子量的超滤膜分离，收集分子量范围为3～5kDa的水解物进行冷冻干燥，得到漆籽粕蛋白肽初提物；

(5)蛋白水解物的凝胶层析纯化

3.权利要求2所述的乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述碱性蛋白酶的加入量为漆籽粕蛋白粉重量的2％～5％。

4.根据权利要求2所述的乳化性能良好的漆籽粕蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述限制性酶解的温度为45～55℃，时间为2～5h。