CN110025499B - 牡丹肽-富勒烯的制备方法 - Google Patents

牡丹肽-富勒烯的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种具有优异的水溶性和生物相容性且可有效提高抗氧化活性及促有丝分裂作用的牡丹肽‑富勒烯的制备方法，以海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶配制的复合酶酶解牡丹种子细粉，得到冷冻粉，然后以所得到的冻干粉为原料，加入氨基酸混合物，再利用海洋酸性蛋白酶进行二次酶解，得到二次酶解冻干粉；将二次酶解冻干粉溶于去离子水中，再加入乙醇得到均相溶液；在氮气保护下，将所得到的均相溶液缓慢滴加到C60的甲苯溶液中，搅拌后得到固体产物；将该固体产物用超纯水溶解后用截留分子量3000Da的透析袋在超纯水中进行透析，冷冻干燥得到牡丹肽‑富勒烯。

Description

牡丹肽-富勒烯的制备方法
技术领域
本发明属于一种合成牡丹肽-富勒烯的方法，尤其是一种具有优异的水溶性和生物相容性且可有效提高抗氧化活性及促有丝分裂作用的牡丹肽-富勒烯的制备方法。
背景技术
牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）是芍药科/毛茛科芍药属的多年生落叶灌木，活性成分极其丰富，具有极高的利用价值。牡丹根的皮经干燥炮制（传统中药丹皮），具有清热凉血、活血化瘀的作用；牡丹花可提取精油、原花色素等成分；牡丹种子可制成牡丹籽油、牡丹籽蛋白等。目前，对牡丹种子中肽类物质的利用成为一个新的研究热点。闫震等通过风味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶和碱性蛋白酶酶解牡丹籽粕蛋白，发现碱性蛋白酶是水解牡丹籽饼粕蛋白制备抗氧化肽的最佳酶源，所制备的抗氧化肽对DPPH 自由基的清除率为52.49%（阎震，郭溆，张金宝等. 酶解牡丹籽粕蛋白制备抗氧化肽的工艺优化[J]. 食品工业科技，DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2018.07.031）。颜辉等利用胰蛋白酶酶解牡丹籽蛋白，制备出具有降血糖作用的肽（颜辉，蔡豪，贾俊强等. 牡丹籽酶解制备降血糖肽工艺的响应面优化[J]. 江苏农业科学，2017，45（14）:167-170.）。
富勒烯（英语：Fullerene）是一种完全由碳组成的中空分子，形状呈球型、椭球型、柱型或管状。由于富勒烯能够亲和自由基，因此已有将水溶性富勒烯分散于化妆品中的应用。同时富勒烯的疏水特性有助于其他物质的膜穿透，将大大提高生物活性物质的利用率。但是，迄今为止并没有关于制备具有优异的水溶性和生物相容性且可有效提高抗氧化活性及促有丝分裂作用的牡丹肽-富勒烯的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种具有优异的水溶性和生物相容性且可有效提高抗氧化活性及促有丝分裂作用的牡丹肽-富勒烯的制备方法。
本发明的技术解决方案是：一种牡丹肽-富勒烯的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 将牡丹种子粉碎，过筛得牡丹种子细粉，向牡丹种子细粉中加入1~3倍体积pH4~5的0.01~0.1M磷酸缓冲液得匀浆，再加入与匀浆质量比为0.1~1%的复合酶，在37℃条件下，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1混合而成；
b. 离心取上清，采用截留分子量为3000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥得冻干粉；
c. 向冻干粉中加入氨基酸混合物，再加入1~3倍体积pH 4~5的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与冻干粉质量比为0.1~1%的海洋酸性蛋白酶，在37℃条件下，酶解12~48 h，在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液；所述氨基酸混合物与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5；
d. 将上清液中加入乙醇，至乙醇体积比70%，在6000rpm条件下离心20min，得到上样上清液，冷冻干燥得冻干粉；
e. 取d步骤得到的冻干粉和NaOH溶于去离子水中，再加入乙醇得到均相溶液，所述冻干粉、NaOH、去离子水及乙醇的用量比为80~200mg：600~2000mg：1~10ml：10~40ml；
f. 称取C60溶于甲苯中，所述C60与甲苯的用量比为10~100mg：20~60 ml，
在氮气保护下，将均相溶液缓慢滴加到C60的甲苯溶液中，搅拌48h后得到固体产物；
e. 将固体产物用超纯水溶解后用截留分子量3000Da的透析袋在超纯水中进行透析，冷冻干燥得到牡丹肽-富勒烯。
所述氨基酸混合物由甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸按质量比为1：1：1：1混合而成。
本发明是以海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶及木瓜蛋白酶组成的复合酶酶解牡丹籽粕蛋白得到牡丹肽，再加入氨基酸进行第二次酶解，可增加所得牡丹肽的种类，有效提高其活性，尤其是与富勒烯构成复合制品，更具有优异的水溶性和生物相容性且可有效提高抗氧化活性及促有丝分裂作用。
附图说明
图1是本发明实施例的牡丹肽-富勒烯红外光谱测试图。
具体实施方式
实施例1：
a. 将牡丹种子粉碎，过200目筛得牡丹种子细粉，向牡丹种子细粉中加入2倍体积pH 4的0.1M磷酸缓冲液得匀浆，再加入与匀浆质量比为1%的复合酶，在37℃条件下，酶解30h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶（Aspergillus sp.）：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1混合而成；
b. 离心取上清，采用截留分子量为3000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥得冻干粉；
c. 向冻干粉中加入氨基酸混合物，再加入2倍体积pH 4的0.1M磷酸缓冲液及与冻干粉质量比为1%的海洋酸性蛋白酶，在37℃条件下，酶解30h，迅速在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液；氨基酸混合物与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5，氨基酸混合物由甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸按质量比为1：1：1：1混合而成；
d. 将上清液中加入体积浓度为95%的乙醇，至乙醇体积比70%，在6000rpm条件下离心20min，得到上样上清液，冷冻干燥得冻干粉；
e. 取d步骤得到的冻干粉和NaOH溶于去离子水中，再加入体积浓度为95%乙醇得到均相溶液，所述冻干粉、NaOH、去离子水及乙醇的用量比为150mg：1500mg：5ml：30ml；
f. 称取C60溶于甲苯中，所述C60与甲苯的用量比为50mg：40 ml，在氮气保护下，将均相溶液缓慢滴加到C60的甲苯溶液中，搅拌48h后得到固体产物；
e. 将固体产物用超纯水溶解后用截留分子量3000Da的透析袋在超纯水中进行透析，冷冻干燥得到牡丹肽-富勒烯。
所述海洋酸性蛋白酶（Aspergillus sp.）、胃蛋白酶以及木瓜蛋白酶均为外购商品，单位质量的活力单位分别为80,000u/g、1,000,000 u/g和1,000,000 u/g。
实施例2：
a. 将牡丹种子粉碎，过200目筛得牡丹种子细粉，向牡丹种子细粉中加入1倍体积pH5的0.01M磷酸缓冲液得匀浆，再加入与匀浆质量比为0.1%的复合酶，在37℃条件下，酶解12h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶（Aspergillus sp.）：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1混合而成；
b. 离心取上清，采用截留分子量为3000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥得冻干粉；
c. 向冻干粉中加入氨基酸混合物，再加入1倍体积pH 5的0.01M磷酸缓冲液及与冻干粉质量比为0.1%的海洋酸性蛋白酶，在37℃条件下，酶解12h，迅速在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液；氨基酸混合物与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5，氨基酸混合物由甘氨酸、缬氨酸及异亮氨酸按质量比为1：1：1混合而成；
d. 将上清液中加入体积浓度为95%的乙醇，至乙醇体积比70%，在6000rpm条件下离心20min，得到上样上清液，冷冻干燥得冻干粉；
e. 取d步骤得到的冻干粉和NaOH溶于去离子水中，再加入体积浓度为95%乙醇得到均相溶液，所述冻干粉、NaOH、去离子水及乙醇的用量比为80mg：600mg：1ml：40ml；
f. 称取C60溶于甲苯中，所述C60与甲苯的用量比为10mg：20 ml，在氮气保护下，将均相溶液缓慢滴加到C60的甲苯溶液中，搅拌48h后得到固体产物；
e. 将固体产物用超纯水溶解后用截留分子量3000Da的透析袋在超纯水中进行透析，冷冻干燥得到牡丹肽-富勒烯。
所述海洋酸性蛋白酶（Aspergillus sp.）、胃蛋白酶以及木瓜蛋白酶均为外购商品，单位质量的活力单位分别为80,000u/g、1,000,000 u/g和1,000,000 u/g。
实施例3：
a. 将牡丹种子粉碎，过200目筛得牡丹种子细粉，向牡丹种子细粉中加入3倍体积pH 4的0.1M磷酸缓冲液得匀浆，再加入与匀浆质量比为0.05%的复合酶，在37℃条件下，酶解48h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶（Aspergillus sp.）：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1混合而成；
b. 离心取上清，采用截留分子量为3000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥得冻干粉；
c. 向冻干粉中加入氨基酸混合物，再加入3倍体积pH 4的0.1M磷酸缓冲液及与冻干粉质量比为0.05%的海洋酸性蛋白酶，在37℃条件下，酶解48h，迅速在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液；氨基酸混合物与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5，所述氨基酸混合物由甘氨酸、缬氨酸及亮氨酸按质量比为1：1：1混合而成；
d. 将上清液中加入体积浓度为95%的乙醇，至乙醇体积比70%，在6000rpm条件下离心20min，得到上样上清液，冷冻干燥得冻干粉；
e. 取d步骤得到的冻干粉和NaOH溶于去离子水中，再加入体积浓度为95%乙醇得到均相溶液，所述冻干粉、NaOH、去离子水及乙醇的用量比为200mg：2000mg：10ml：40ml；
f. 称取C60溶于甲苯中，所述C60与甲苯的用量比为100mg：60 ml，在氮气保护下，将均相溶液缓慢滴加到C60的甲苯溶液中，搅拌48h后得到固体产物；
e. 将固体产物用超纯水溶解后用截留分子量3000Da的透析袋在超纯水中进行透析，冷冻干燥得到牡丹肽-富勒烯。
对实施例得到的牡丹肽-富勒烯进行红外光谱测试，结果如图1所示。3308、2932和1652cm-1处吸收峰对应-NH伸缩振动、-CH2伸缩振动和-C=O伸缩振动。1183 cm-1处吸收峰对应C-N伸缩振动。红外光谱测试图表明，通过本发明实施例方法合成了牡丹肽-富勒烯。
实验例1：牡丹肽-富勒烯稳定性
将实施例1、2、3所得牡丹肽-富勒烯分别溶于生理盐水及磷酸缓冲液中，在6000r/m条件下离心10min后均无沉淀产生，说明本发明实施例的牡丹肽-富勒烯颗粒在这两种生理溶液中表现出较高的稳定性，有利于其与细胞产生有效的相互作用。
实验例2：本发明实施例牡丹肽-富勒烯清除DPPH 自由基能力
实验1组为本发明实施例1所得牡丹肽-富勒烯。
实验2组为实施例1中b步骤所得冻干粉。
实验3组为实施例1中d步骤所得冻干粉。
实验4组为按照下列步骤制备的制品。
a. 将牡丹种子粉碎，过200目筛得牡丹种子细粉，向牡丹种子细粉中加入2倍体积pH 4的0.1M磷酸缓冲液得匀浆，再加入与匀浆质量比为1%的复合酶，在37℃条件下，酶解30h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶（Aspergillus sp.）：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1混合而成；
b. 离心取上清，采用截留分子量为3000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥得冻干粉；
c. 取得到的冻干粉和NaOH溶于去离子水中，再加入体积浓度为95%乙醇得到均相溶液，所述冻干粉、NaOH、去离子水及乙醇的用量比为150mg：1500mg：5ml：30ml；
d. 称取C60溶于甲苯中，所述C60与甲苯的用量比为50mg：40 ml，在氮气保护下，将均相溶液缓慢滴加到C60的甲苯溶液中，搅拌48h后得到固体产物；
e. 将固体产物用超纯水溶解后用截留分子量3000Da的透析袋在超纯水中进行透析，冷冻干燥得到制品。
所述海洋酸性蛋白酶（Aspergillus sp.）、胃蛋白酶以及木瓜蛋白酶均为外购商品，单位质量的活力单位分别为80,000u/g、1,000,000 u/g和1,000,000 u/g。
实验5组是水溶性富勒烯。
用去离子水将不同实验组的产品配成不同浓度的溶液，分别取2ml不同浓度样品溶液于试管中，加入2ml所配置的DPPH溶液（0.004g DPPH粉末加到50mL容量瓶，用95%乙醇定容，4℃下避光保存），混合均匀，室温避光30min。在10000rpm离心10min，取上清于517nm下测定吸光度Aj，同时测2ml不同样品溶液加2ml的95%乙醇的吸光度Ai，2mlDPPH加2mL蒸馏水的吸光度A0。
DPPH自由基清除率（%）=[A0-(Aj-Ai)]/A0×100%
式中：A0空白对照的吸光值； Aj样液的吸光值；Ai 本身的吸光值
结果如表1所示。
表1
Figure DEST_PATH_IMAGE001
结果表明本发明的牡丹肽-富勒烯清除DPPH自由基的能力均高于其它实验组。
实验例3：本发明实施例牡丹肽-富勒烯清除ABTS的能力
分组同实验例2。
用蒸馏水配置 ABTS使浓度为7.4mmol/L，然后与2.6 mmol/L的K2S2O8均匀混合，黑暗室温放置12 h。用95%乙醇溶液稀释，使其能在波长为734 nm处的吸光度值为0.70±0.02A，即得到ABTS自由基储备液。在试管中加入0.9ml不同浓度的各实验组样品溶液和2ml的ABTS自由基储备液，在室温条件下放置6min，随后在转速 10000rpm下离心10min，取上清液在波长734nm处进行测定。
ABTS自由基清除率（%）=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%
式中：A0 空白对照的吸光值； Ai 样液的吸光值； Aj 本身的吸光值
结果如表2所示。
表2
Figure 188137DEST_PATH_IMAGE002
结果表明本发明的牡丹肽-富勒烯清除ABTS自由基的能力均高于其它实验组。
实验例4：本发明实施例牡丹肽-富勒烯对上皮细胞（HaCaT细胞）促有丝分裂作用
分组同实验例2。
利用四氮唑蓝比色法（MTT法）观察样品对人上皮细胞的增殖或抑制作用。MTT法是以代谢还原四氮唑蓝（MTT）为基础。活细胞线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色甲瓒，而死亡细胞此酶消失，MTT不被还原。用二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒后，用酶标仪在570 nm波长处检测吸光度大小。
将数量为4.5×104个/mL处于对数生长期的HaCaT细胞100 μL、不同实验组的不同浓度样品至每孔200 μL（GSGPs用含10%胎牛血清的DMEM(high glucose)培养基液配制至不同浓度），在5% CO2的37
Figure DEST_PATH_IMAGE003
培养箱中培养48 h后，加入20μL MTT（5 g/L）再培养4 h后，离心，弃去培养基，加入180 μL DMSO，在恒温振荡器上振荡60 S后，用酶标仪在570/630 nm波长处检测吸光度。每个浓度样品做3个平行样。根据测得的吸光度值计算抑制率。
抑制率=[(对照组吸光度值-实验组吸光度值)]/对照组吸光度值×100%
结果如表3所示。
表3
Figure 446556DEST_PATH_IMAGE004
结果表明本发明的牡丹肽-富勒烯对上皮细胞（HaCaT细胞）促有丝分裂作用均高于其它实验组，说明本发明的牡丹肽-富勒烯具有较好的促有丝分裂作用。

Claims (2)

1.一种牡丹肽-富勒烯的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：
a. 将牡丹种子粉碎，过筛得牡丹种子细粉，向牡丹种子细粉中加入1~3倍体积pH 4~5的0.01~0.1M磷酸缓冲液得匀浆，再加入与匀浆质量比为0.1~1%的复合酶，在37℃条件下，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋酸性蛋白酶：胃蛋白酶：木瓜蛋白酶按活力单位比为6：3：1混合而成；
b. 离心取上清，采用截留分子量为3000 Da超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体，冷冻干燥得冻干粉；
c. 向冻干粉中加入氨基酸混合物，再加入1~3倍体积pH 4~5的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与冻干粉质量比为0.1~1%的海洋酸性蛋白酶，在37℃条件下，酶解12~48 h，在95℃水浴中灭酶15min，冷却至室温后，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液；所述氨基酸混合物与冻干粉中总游离氨基酸质量之比为0.5；
d. 将上清液中加入乙醇，至乙醇体积比70%，在6000rpm条件下离心20min，得到上清液，冷冻干燥得冻干粉；
e. 取d步骤得到的冻干粉和NaOH溶于去离子水中，再加入乙醇得到均相溶液，所述冻干粉、NaOH、去离子水及乙醇的用量比为80~200mg：600~2000mg：1~10ml：10~40ml；
f. 称取C60溶于甲苯中，所述C60与甲苯的用量比为10~100mg：20~60 ml，
在氮气保护下，将均相溶液缓慢滴加到C60的甲苯溶液中，搅拌48h后得到固体产物；
e. 将固体产物用超纯水溶解后用截留分子量3000Da的透析袋在超纯水中进行透析，冷冻干燥得到牡丹肽-富勒烯。
2.根据权利要求1所述的牡丹肽-富勒烯的制备方法，其特征在于所述氨基酸混合物由甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸及异亮氨酸按质量比为1：1：1：1混合而成。
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