CN103342734B

CN103342734B - 一种蛋清源抗氧化肽粉及其制备方法

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Publication number: CN103342734B
Application number: CN201310277235.0A
Authority: CN
Inventors: 林松毅; 金艳; 邢杰; 赵桐; 于晓然; 王睦; 刘静波
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2013-06-29
Filing date: 2013-06-29
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2033-06-29
Also published as: CN103342734A

Abstract

本发明属于蛋品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，公开了一种蛋清源抗氧化肽粉及其制备方法，解决了以蛋清蛋白酶解液为原料，以DPPH自由基清除率、还原力为抗氧化活性评价指标，设计了利用超滤装置、真空旋转浓缩仪、柱层析柜系统、真空冷冻干燥技术制备蛋清源抗氧化肽粉的工艺过程，能够制得分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28%，DPPH清除率为90.2%，还原力为1.8，含水量为1%～3%的蛋清源抗氧化肽粉。本发明的制备方法，提高了蛋清源抗氧化肽的抗氧化活性，使其DPPH清除率由50%提高到90.2%，还原力由1.46提高到1.8，有助于提高禽蛋资源综合利用开发功能性产品的研发水平。

Description

一种蛋清源抗氧化肽粉及其制备方法

技术领域

本发明属于农副产品精深加工及其副产物综合利用的技术领域，涉及一种蛋清源抗氧化肽粉及其制备方法，利用超滤技术、真空旋转浓缩技术、柱层析柜分离技术和真空冷冻干燥技术，制得含水量为1%～3%、分子量为300～600Da、DPPH清除率为90.2%、还原力为1.8的蛋清源抗氧化肽粉。

背景技术

生物活性肽已成为当今热点，抗氧化肽产品以其预防疾病、保护健康的良好功效深受大众瞩目。生物活性肽是一类具有多种生物学功能的分子量小于6k Da的多肽。现在生理学研究表明，摄入人体的蛋白质大多以肽的形式被吸收，并且比游离氨基酸消化更快、吸收更多，肽的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。因此为了提高蛋白质资源的利用率，生物活性肽成为蛋白质开发十分重要的产物，除了提供营养物质外还具有很多蛋白质和游离氨基酸所不具备的功能。而抗氧化肽作为生物活性肽研究中的重要部分，除了能抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基，有报道证实其还具有抗癌、抗诱导及抗衰老等其他生物活性，因此抗氧化肽不仅在食品工业，而且在医药、化妆品和整形外科等领域中都得到广泛应用。近年来，国内外学者从大豆、玉米、花生、牛乳、草鱼等动植物蛋白中提取分离了具有抗氧化活性的肽类。

中国是世界上最大蛋品生产和消费国，蛋清蛋白成为抗氧化肽的极佳来源。鸡蛋作为我国食物蛋白的主要来源，不仅营养丰富，且含有大量抗菌、抗病毒、抗癌、调节免疫等多种生理活性物质。而蛋清蛋白更是作为含有8种人体必需氨基酸的优质蛋白，已成为鸡蛋综合利用的主要对象，被认为是获得生物活性肽良好资源。蛋清蛋白经蛋白酶水解后其分子量降低、致敏性降低、消化性提高且生物功能更加丰富。国内外学者关于蛋清蛋白酶解产物抗肿瘤、抗高血压、免疫调节等研究取得了显著成果，而对蛋清酶解产物抗氧化研究主要集中在酶解工艺方面，对抗氧化肽分离纯化、作用机理及稳定性等方面研究则相对较少。研究发现鸡蛋卵白蛋白酶解物具有抗氧化功效，并且利用蛋清蛋白在适宜蛋白酶的水解作用下，过敏原蛋白质抗原性降低甚至消失，能够广泛开发蛋清蛋白抗氧化肽系列产品。

柱层析技术作为分离纯化活性物质的一种重要方法，具有较好的可操作性、高效性和环保性。柱层析技术是一种色谱技术，在圆柱管中先填充不溶性基质，形成一个固定相，用特殊溶剂洗脱，溶剂组成流动相。洗脱过程中，根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配将组分分离。柱层析技术广泛应用于多种活性物质的分离纯化，其操作简单，处理量大，已经受到学者认可。然而，利用柱层析技术分离纯化抗氧化肽，存在一定的难度，由于抗氧化肽极大的吸水性，同时其抗氧化活性会因酶解液中多肽或短肽不同种类/含量的不同产生显著差异，造成分离后的抗氧化肽稳定性不足，抗氧化活性降低。因此，在分离纯化抗氧化肽的过程中，最重要的原则是保持抗氧化肽的高活性，这直接影响到抗氧化肽产品的生产成本以及蛋清产品的有效价值。

本发明的技术优势主要体现在以下两个方面：

第一，本专利技术是以柱层析分离技术为核心技术。特别强调的是，将柱层析分离技术应用于蛋清抗氧化肽的研究中，其优势突出体现在：

（1）提高了抗氧化肽的抗氧化活性，可使蛋清源抗氧化肽粉的DPPH清除率由50%提高至90.2%，还原力由1.46提高至1.8，提高了产品利用价值，降低了成本；

（2）分离时间短，在2～5h内即可制备得到高活性的蛋清源抗氧化肽粉；

（3）能耗较低，人力资源占用少，有利于蛋清蛋白附加值产品开发的工业化生产。

第二，本专利技术是以蛋清蛋白酶解液为原料，由蛋清蛋白粉经酶水解即可获得，酶解工艺成熟，来源广泛，成本低廉，适于蛋品工业副产物的增值增效等技术应用。

通过前期大量研究，本专利发明人公开发表论文《蛋清蛋白水解物体内抗氧化作用的实验研究》[J].食品工业，2009，2：5～8；《蛋清蛋白酶解物清除DPPH自由基活性研究》[J].食品工业，2009，3：1～3；《响应面法优化高还原性能蛋清肽的可控酶解技术》[J].食品科技，2010，35（7）：24～28；蛋清蛋白酶解工艺既已成熟，蛋清蛋白肽产率稳定，活性较高。蛋清蛋白酶解工艺是以蛋清蛋白粉（蛋白质含量80.96%）为原料，用蒸馏水配制成5.16%（W/W）的蛋清蛋白溶液，漩涡震荡均匀，90℃水浴10min后，调节溶液pH为10.66，水浴温度50℃，加入碱性蛋白酶2.37%，保持pH为10.66，酶解3h，解结束后，将溶液在90℃的水浴锅中加热10min，调节pH为7.0，即得到蛋清蛋白酶解液，测得其DPPH清除率为50%，还原力为1.46。

DPPH清除率与还原力作为抗氧化肽的活性评价指标，操作简便，结果准确，受到广泛的认可。其检测数值越大代表抗氧化肽活性越高，即抗氧化能力越强，因此本专利以DPPH清除率与还原力为评价指标。另外，生物活性肽的活性高低与其分子量大小有直接的关系，研究表明，分子量小的蛋清源活性肽，其抗氧化活性较高，因此本专利利用超滤技术获得较小分子量的蛋清蛋白肽，再利用柱层析技术进一步分离，制备出更高活性的蛋清抗氧化肽粉。

综上所述，本专利要求保护的是：以蛋清蛋白酶解液为原料，利用超滤技术，通过控制超滤压力、膜通量、截留分子量，初步分离得到分子量小于1kDa的超滤液，经真空旋转浓缩后，通过控制凝胶孔径、物料浓度、上样量、洗脱流速、洗脱体积，确定适宜的柱层析分离条件，经真空冷冻干燥后，制备出DPPH清除率更高，还原力较强的蛋清源抗氧化肽粉。

总之，本发明专利旨在解决蛋清抗氧化肽制备过程中的稳定性差、抗氧化活性不高等技术问题，优化一条绿色、高效、低成本的蛋清抗氧化肽制备工艺参数，最终获得高活性蛋清源抗氧化肽粉，并达到降低蛋清抗氧化肽生产成本，提高产品功能价值的目的。

发明内容

本发明需要解决的技术问题：

本发明以蛋清蛋白酶解液为原料，以DPPH清除率、还原力为抗氧化活性评价指标，利用超滤技术、真空旋转浓缩技术、柱层析柜分离技术、真空冷冻干燥技术，通过单因素和响应面设计，确定其柱层析分离参数，公开一种蛋清源抗氧化肽粉及其制备方法，能够获得分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28%，DPPH清除率为90.2%，还原力为1.8，含水量为1%～3%的蛋清源抗氧化肽粉。

本发明的技术方案：

1.一种蛋清源抗氧化肽粉，其特征在于，分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28%，DPPH清除率为90.2%，还原力为1.8，含水量为1%～3%。

2.一种蛋清源抗氧化肽粉的制备方法，其特征在于，以蛋清蛋白酶解液为原料，经过超滤、真空旋转浓缩、柱层析分离、真空冷冻干燥的工艺过程，制得分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28%，DPPH清除率为90.2%，还原力为1.8，含水量为1%～3%的蛋清源抗氧化肽粉；其中，所述的蛋清蛋白酶解液，是以蛋白质含量为80.96%的蛋清蛋白粉为原料，按照质量比为5.16%的比例配制蛋清蛋白水溶液，经机械搅拌均匀后，置于酶解釜中，升温至90℃，保温10min使蛋清蛋白热变性后，用1M氢氧化钠溶液调节pH至10.66±0.04，调整水浴温度为50℃，按照蛋清蛋白粉质量的2.37%加入液体或固体的碱性蛋白酶，用1M氢氧化钠溶液调节pH为10.66±0.04，恒定酶解温度和恒定酶解pH的条件下酶解3h后，将酶解液迅速升温至90℃，保温10min后，调节pH为7.0，选择离心温度为6℃、离心转速为6000×g、离心时间15min处理后收集上清液，即为DPPH清除率为50%、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液；

1）所述的超滤过程，是指将pH为7.0、DPPH清除率为50%、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液，依次泵入超滤装置中的30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，且超滤过程中要求膜通量3.5～8L/m²·h、控制温度为10～30℃、回流阀压力0～20psi，最后收集1kDa超滤膜的膜下液，即为分子量小于1kDa的超滤液，置于4℃冰箱内备用；

2）所述的真空旋转浓缩过程，是指将分子量小于1kDa的超滤液，用真空旋转浓缩仪进行浓缩处理，要求控制转速为1000～1500rpm，浓缩温度为50～70℃，浓缩至初始体积的1/5～1/10，获得蛋白质浓度为60%～80%的浓缩液；

3）所述的柱层析分离过程，是指将浓缩液，选用Sephadex G-25或G-15凝胶柱层析进行分离，包括层析柱的装配、上样、洗脱、收集的过程；

所述的层析柱装配过程，是指称取Sephadex G-25或G-15凝胶10～40g置于烧杯中，加入150～500mL蒸馏水，于沸水浴中煮沸溶胀1～2h后反复洗涤，选取径高比为1/100～13/300的层析柱，垂直固定于4～6℃恒温柜中，自顶端沿柱壁缓慢、匀速加入充分溶胀、均一、无杂质的凝胶，待凝胶沉积至离层析柱顶约3～8cm时，缓慢泵入蒸馏水，使层析柱床稳定，保证柱床均一，无气泡，将层析柱下端出口与紫外检测器连接，调节紫外检测器的波长范围为220～280nm，灵敏度为0.1～0.5；

所述的上样过程，是指按照浓缩液与水的体积比为1:50～1:5混合，经0.45μm膜过滤后，取1～5mL缓缓地滴加到层析床表面，待层析柱床表面恰好露出时，加入1mL蒸馏水洗涤，让洗涤液进入层析柱床内后再注满蒸馏水，封闭层析柱，准备洗脱；

所述的洗脱过程，是指通过调节恒流泵工作状态，控制水在柱层析系统中的恒流速度范围为0.5～2mL/min；

所述的收集过程，是指自洗脱开始40～90min后开始收集洗脱液，收集60～150min；

4）所述的真空冷冻干燥过程，是指将多次同一时间洗脱液合并于一个干燥盘中，置于预冻温度为-85℃～-80℃冷冻库中，预冻5～6h后，移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-57℃～-55℃，冻干时间为24～27h，获得分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28%，DPPH清除率为90.2%，还原力为1.8，含水量为1%～3%。

3.根据权利要求2所述的超滤过程，其特征在于，将pH为7.0、DPPH清除率为50%、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液，依次泵入超滤装置中的30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，且超滤过程中要求膜通量3.5～8L/m²·h、控制温度为10～30℃、回流阀压力0～20psi，最后收集1kDa超滤膜的膜下液，即为分子量小于1kDa的超滤液，置于4℃冰箱内备用。

4.根据权利要求2所述的真空旋转浓缩过程，其特征在于，是指将分子量小于1kDa的超滤液，用真空旋转浓缩仪进行浓缩处理，要求控制转速为1000～1500rpm，浓缩温度为50～70℃，浓缩至初始体积的1/5～1/10，获得蛋白质浓度为60%～80%浓缩液。

5．根据权利要求2所述的柱层析分离过程，其特征在于，是指将蛋白质浓度为60%浓缩液，选用Sephadex G-25或G-15凝胶柱层析进行分离，包括层析柱的装配、上样、洗脱、收集的过程；

所述的收集过程，是指自洗脱开始40～90min后开始收集洗脱液，收集60～150min。

6.根据权利要求2所述的真空冷冻干燥过程，其特征在于，是将超滤液、浓缩液或洗脱液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度在3～6mm，温度为-85℃～-80℃，预冻5～6h后，移至真空冷冻干燥机中，温度为-57℃～-55℃，冻干时间为24～27h，获得分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28%，DPPH清除率为90.2%，还原力为1.8，含水量为1%～3%的蛋清源抗氧化肽粉。

7.根据权利要求2、3所述的层析柱装配、上样、洗脱过程所需用水，其特征在于，为经0.45μm水膜过滤后的pH为7.0的蒸馏水。

本发明技术效果：

（1）本发明是以蛋清蛋白酶解液为原料，采用超滤、真空旋转浓缩、柱层析分离、真空冷冻干燥技术，能够制得分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28%，DPPH清除率为90.2%，还原力为1.8，含水量为1%～3%的蛋清源抗氧化肽粉。

（2）本发明所涉及的蛋清源抗氧化肽粉制备方法，提高了蛋清源抗氧化肽的抗氧化活性，使其DPPH清除率由50%提高到90.2%，还原力由1.46提高到1.8。

（3）本发明所涉及的技术路线简单，设备投资较少，产品利用价值高，有助于提高蛋清的综合利用效率，降低生产成本。

（4）本发明所涉及的抗氧化肽粉制备方法，同样可适用于大豆、玉米、松籽等生物抗氧化肽的制备，为实现抗氧化肽的工业化生产奠定基础。

具体实施方式

实施例1：

以蛋白质含量为80.96%的蛋清蛋白粉为原料，按照质量比为5.16%的比例配制蛋清蛋白水溶液，经机械搅拌均匀后，置于酶解釜中，升温至90℃，保温10min使蛋清蛋白热变性后，用1M氢氧化钠溶液调节pH至10.66±0.04，调整水浴温度为50℃，按照蛋清蛋白粉质量的2.37%加入液体或固体的碱性蛋白酶，用1M氢氧化钠溶液调节pH为10.66±0.04，恒定酶解温度和恒定酶解pH的条件下酶解3h后，将酶解液迅速升温至90℃，保温10min后，调节pH为7.0，选择离心温度为6℃、离心转速为6000×g、离心时间15min处理后收集上清液，即为DPPH清除率为50%、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液；将蛋清蛋白酶解液依次泵入超滤装置中的30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，要求膜通量3.5L/m²·h、控制温度为10℃、回流阀压力8psi，最后收集1kDa超滤膜的膜下液，即为分子量小于1kDa的超滤液，置于4℃冰箱内备用。用真空旋转浓缩仪处理超滤液，控制转速为1500rpm，浓缩温度设定为50℃，直至初始体积的1/6，获得蛋白质浓度为70%的浓缩液。称取Sephadex G-15凝胶25g置于烧杯中，加入500mL蒸馏水，于沸水浴中煮沸溶胀1h后反复洗涤，选取径高比为2/125的层析柱，垂直固定于4℃恒温柜中，自顶端沿柱壁缓慢、匀速加入充分溶胀、均一、无杂质的凝胶，待凝胶沉积至离层析柱顶约5cm时，缓慢泵入蒸馏水，使层析柱床稳定，保证柱床均一，无气泡。将层析柱下端出口与紫外检测器连接，调节紫外检测器光量为220nm，灵敏度为0.5。按照浓缩液与蒸馏水比例为1:10混合，漩涡震荡1min后经0.45μm水膜过滤，取2mL缓缓地滴加到层析床表面，待层析柱床表面恰好露出时，加入1mL蒸馏水洗涤，让洗涤液进入层析柱床内后再注满蒸馏水。调节恒流泵流速为1mL/min，洗脱60min后开始收集洗脱液，收集100min。将洗脱液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为5mm，温度为-80℃，预冻时间为5h，而后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为10Pa，冻干时间为24h，获得含水量为3%、蛋白质含量为82.6%、DPPH清除率为84%、还原力为1.64的蛋清源抗氧化肽粉。

实施例2：

以蛋白质含量为80.96%的蛋清蛋白粉为原料，按照质量比为5.16%的比例配制蛋清蛋白水溶液，经机械搅拌均匀后，置于酶解釜中，升温至90℃，保温10min使蛋清蛋白热变性后，用1M氢氧化钠溶液调节pH至10.66±0.04，调整水浴温度为50℃，按照蛋清蛋白粉质量的2.37%加入液体或固体的碱性蛋白酶，用1M氢氧化钠溶液调节pH为10.66±0.04，恒定酶解温度和恒定酶解pH的条件下酶解3h后，将酶解液迅速升温至90℃，保温10min后，调节pH为7.0，选择离心温度为6℃、离心转速为6000×g、离心时间15min处理后收集上清液，即为DPPH清除率为50%、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液；将蛋清蛋白酶解液依次泵入超滤装置中的30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，要求膜通量4L/m²·h、控制温度为15℃、回流阀压力10psi，最后收集1kDa超滤膜的膜下液，即为分子量小于1kDa的超滤液，置于4℃冰箱内备用。用真空旋转浓缩仪处理超滤液，控制转速为1400rpm，浓缩温度设定为55℃，直至初始体积的1/8，获得蛋白质浓度为75%的浓缩液。称取Sephadex G-25凝胶30g置于烧杯中，加入400mL蒸馏水，于沸水浴中煮沸溶胀1h后反复洗涤。选取径高比为13/400的层析柱，垂直固定于6℃恒温柜中，自顶端沿柱壁缓慢、匀速加入充分溶胀、均一、无杂质的凝胶，待凝胶沉积至离层析柱顶约3cm时，缓慢泵入蒸馏水，使层析柱床稳定，保证柱床均一，无气泡。将层析柱下端出口与紫外检测器连接，调节紫外检测器光量为226nm，灵敏度为0.1。按照浓缩液与蒸馏水比例为1:20混合，漩涡震荡1min后经0.45μm水膜过滤，取4mL缓缓地滴加到层析床表面，待层析柱床表面恰好露出时，加入1mL蒸馏水洗涤，让洗涤液进入层析柱床内后再注满蒸馏水。调节恒流泵流速为0.5mL/min，洗脱90min后开始收集洗脱液，收集100min。将洗脱液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为4mm，温度为-82℃，预冻时间为6h，而后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为15Pa，冻干时间为26h，获得含水量为2.4%、蛋白质含量为84.2%、DPPH清除率为86%、还原力为1.66的蛋清源抗氧化肽粉。

实施例3：

以蛋白质含量为80.96%的蛋清蛋白粉为原料，按照质量比为5.16%的比例配制蛋清蛋白水溶液，经机械搅拌均匀后，置于酶解釜中，升温至90℃，保温10min使蛋清蛋白热变性后，用1M氢氧化钠溶液调节pH至10.66±0.04，调整水浴温度为50℃，按照蛋清蛋白粉质量的2.37%加入液体或固体的碱性蛋白酶，用1M氢氧化钠溶液调节pH为10.66±0.04，恒定酶解温度和恒定酶解pH的条件下酶解3h后，将酶解液迅速升温至90℃，保温10min后，调节pH为7.0，选择离心温度为6℃、离心转速为6000×g、离心时间15min处理后收集上清液，即为DPPH清除率为50%、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液；依次泵入超滤装置中的30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，要求膜通量5L/m²·h、控制温度为20℃、回流阀压力12psi，最后收集1kDa超滤膜的膜下液，即为分子量小于1kDa的超滤液，置于4℃冰箱内备用。用真空旋转浓缩仪处理超滤液，控制转速为1300rpm，浓缩温度设定为60℃，直至初始体积的1/5，获得蛋白质浓度为60%的浓缩液。称取Sephadex G-15凝胶15g置于烧杯中，加入200mL蒸馏水，于沸水浴中煮沸溶胀1.5h后反复洗涤。选取径高比为2/75的层析柱，垂直固定于5℃恒温柜中，自顶端沿柱壁缓慢、匀速加入充分溶胀、均一、无杂质的凝胶，待凝胶沉积至离层析柱顶约4cm时，缓慢泵入蒸馏水，使层析柱床稳定，保证柱床均一，无气泡。将层析柱下端出口与紫外检测器连接，调节紫外检测器光量为260nm，灵敏度为0.2。按照浓缩液与蒸馏水比例为1:25混合，漩涡震荡1min后经0.45μm水膜过滤，取2mL缓缓地滴加到层析床表面，待层析柱床表面恰好露出时，加入1mL蒸馏水洗涤，让洗涤液进入层析柱床内后再注满蒸馏水。调节恒流泵流速为1.2mL/min，洗脱50min后开始收集洗脱液，收集120min。将洗脱液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为5mm，温度为-85℃，预冻时间为5h，而后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为20Pa，冻干时间为24h，获得含水量为1.6%、蛋白质含量为90.4%、DPPH清除率为88%、还原力为1.65的蛋清源抗氧化肽粉。

实施例4：

以蛋白质含量为80.96%的蛋清蛋白粉为原料，按照质量比为5.16%的比例配制蛋清蛋白水溶液，经机械搅拌均匀后，置于酶解釜中，升温至90℃，保温10min使蛋清蛋白热变性后，用1M氢氧化钠溶液调节pH至10.66±0.04，调整水浴温度为50℃，按照蛋清蛋白粉质量的2.37%加入液体或固体的碱性蛋白酶，用1M氢氧化钠溶液调节pH为10.66±0.04，恒定酶解温度和恒定酶解pH的条件下酶解3h后，将酶解液迅速升温至90℃，保温10min后，调节pH为7.0，选择离心温度为6℃、离心转速为6000×g、离心时间15min处理后收集上清液，即为DPPH清除率为50%、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液；将蛋清蛋白酶解液依次泵入超滤装置中的30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，要求膜通量8L/m²·h、控制温度为30℃、回流阀压力0psi，最后收集1kDa超滤膜的膜下液，即为分子量小于1kDa的超滤液，置于4℃冰箱内备用。用真空旋转浓缩仪处理超滤液，控制转速为1200rpm，浓缩温度设定为65℃，直至初始体积的1/10，获得蛋白质浓度为80%的浓缩液。称取Sephadex G-25凝胶10g置于烧杯中，加入300mL蒸馏水，于沸水浴中煮沸溶胀1.5h后反复洗涤。选取径高比为1/60的层析柱，垂直固定于6℃恒温柜中，自顶端沿柱壁缓慢、匀速加入充分溶胀、均一、无杂质的凝胶，待凝胶沉积至离层析柱顶约8cm时，缓慢泵入蒸馏水，使层析柱床稳定，保证柱床均一，无气泡。将层析柱下端出口与紫外检测器连接，调节紫外检测器光量为280nm，灵敏度为0.2。按照浓缩液与蒸馏水比例为1:5混合，漩涡震荡1min后经0.45μm水膜过滤，取2mL缓缓地滴加到层析床表面，待层析柱床表面恰好露出时，加入1mL蒸馏水洗涤，让洗涤液进入层析柱床内后再注满蒸馏水。调节恒流泵流速为0.8mL/min，洗脱70min后开始收集洗脱液，收集60min。将洗脱液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为5mm，温度为-75℃，预冻时间为7h，而后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为12Pa，冻干时间为28h，获得含水量为2%、蛋白质含量为88.3%、DPPH清除率为85%、还原力为1.56的蛋清源抗氧化肽粉。

实施例5：

以蛋白质含量为80.96%的蛋清蛋白粉为原料，按照质量比为5.16%的比例配制蛋清蛋白水溶液，经机械搅拌均匀后，置于酶解釜中，升温至90℃，保温10min使蛋清蛋白热变性后，用1M氢氧化钠溶液调节pH至10.66±0.04，调整水浴温度为50℃，按照蛋清蛋白粉质量的2.37%加入液体或固体的碱性蛋白酶，用1M氢氧化钠溶液调节pH为10.66±0.04，恒定酶解温度和恒定酶解pH的条件下酶解3h后，将酶解液迅速升温至90℃，保温10min后，调节pH为7.0，选择离心温度为6℃、离心转速为6000×g、离心时间15min处理后收集上清液，即为DPPH清除率为50%、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液；将蛋清蛋白酶解液依次泵入超滤装置中的30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，要求膜通量6L/m²·h、控制温度为18℃、回流阀压力20psi，最后收集1kDa超滤膜的膜下液，即为分子量小于1kDa的超滤液，置于4℃冰箱内备用。用真空旋转浓缩仪处理超滤液，控制转速为1000rpm，浓缩温度设定为70℃，直至初始体积的1/7，获得蛋白质浓度为72%的浓缩液。称取Sephadex G-25凝胶20g置于烧杯中，加入300mL蒸馏水，于沸水浴中煮沸溶胀1.5h后反复洗涤。选取径高比为1/50的层析柱，垂直固定于6℃恒温柜中，自顶端沿柱壁缓慢、匀速加入充分溶胀、均一、无杂质的凝胶，待凝胶沉积至离层析柱顶约6cm时，缓慢泵入蒸馏水，使层析柱床稳定，保证柱床均一，无气泡。将层析柱下端出口与紫外检测器连接，调节紫外检测器光量为260nm，灵敏度为0.5。按照浓缩液与蒸馏水比例为1:50混合，漩涡震荡1min后经0.45μm水膜过滤，取2mL缓缓地滴加到层析床表面，待层析柱床表面恰好露出时，加入1mL蒸馏水洗涤，让洗涤液进入层析柱床内后再注满蒸馏水。调节恒流泵流速为1.5mL/min，洗脱40min后开始收集洗脱液，收集90min。将洗脱液分装于冷冻盘中进行预冻，控制液面厚度为4mm，温度为-80℃，预冻时间为8h，而后再置于真空冷冻干燥机内，控制真空度为16Pa，冻干时间为25h，获得含水量为1%、蛋白质含量为92.5%、DPPH清除率为89%、还原力为1.72的蛋清源抗氧化肽粉。

Claims

1.一种蛋清源抗氧化肽粉的制备方法，其特征在于，以蛋清蛋白酶解液为原料，经过超滤、真空旋转浓缩、柱层析分离、真空冷冻干燥的工艺过程，制得分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28％，DPPH清除率为90.2％，还原力为1.8，含水量为1％～3％的蛋清源抗氧化肽粉；

1)所述的超滤过程，是指将pH为7.0、DPPH清除率为50％、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液，依次泵入超滤装置中的30kDa、10kDa、3kDa和1kDa的超滤膜，且超滤过程中要求膜通量3.5～8L/m²·h、控制温度为10～30℃、回流阀压力0～20psi，最后收集1kDa超滤膜的膜下液，即为分子量小于1kDa的超滤液，置于4℃冰箱内备用；

2)所述的真空旋转浓缩过程，是指将分子量小于1kDa的超滤液，用真空旋转浓缩仪进行浓缩处理，要求控制转速为1000～1500rpm，浓缩温度为50～70℃，浓缩至初始体积的1/5～1/10，获得蛋白质质量浓度为60％～80％的浓缩液；

3)所述的柱层析分离过程，是指将浓缩液，选用Sephadex G-25或G-15凝胶柱层析进行分离，包括层析柱的装配、上样、洗脱、收集的过程；

所述的层析柱装配过程，是指称取Sephadex G-25或G-15凝胶，加入蒸馏水，于沸水浴中煮沸溶胀1～2h后反复洗涤，选取径高比为1/100～13/300的层析柱，垂直固定于4～6℃恒温柜中，自顶端沿柱壁缓慢、匀速加入充分溶胀、均一、无杂质的凝胶，待凝胶沉积至离层析柱顶3～8cm时，缓慢泵入蒸馏水，使层析柱床稳定，保证柱床均一，无气泡，将层析柱下端出口与紫外检测器连接，调节紫外检测器的波长范围为220～280nm，灵敏度为0.1～0.5；

4)所述的真空冷冻干燥过程，是指将多次同一时间洗脱液合并于一个干燥盘中，置于预冻温度为-85℃～-80℃冷冻库中，预冻5～6h后，移至真空冷冻干燥机中，温度设定为-57℃～-55℃，冻干时间为24～27h，获得分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28％，DPPH清除率为90.2％，还原力为1.8，含水量为1％～3％的蛋清源抗氧化肽粉。

2.根据权利要求1所述的蛋清源抗氧化肽粉的制备方法，其特征在于，所述的蛋清蛋白酶解液，是以蛋白质含量为80.96％的蛋清蛋白粉为原料，按照质量比为5.16％的比例配制蛋清蛋白水溶液，经机械搅拌均匀后，置于酶解釜中，升温至90℃，保温10min使蛋清蛋白热变性后，用1M氢氧化钠溶液调节pH至10.66±0.04，调整水浴温度为50℃，按照蛋清蛋白粉质量的2.37％加入液体或固体的碱性蛋白酶，用1M氢氧化钠溶液调节pH为10.66±0.04，恒定酶解温度和恒定酶解pH的条件下酶解3h后，将酶解液迅速升温至90℃，保温10min后，调节pH为7.0，选择离心温度为6℃、离心转速为6000×g、离心时间15min处理后收集上清液，即为DPPH清除率为50％、还原力为1.46的蛋清蛋白酶解液。

3.根据权利要求1所述的蛋清源抗氧化肽粉的制备方法，其特征在于，所述的层析柱装配过程，是称取Sephadex凝胶10～40g置于烧杯中，加入150～500mL蒸馏水，沸水浴后装柱。

4.一种蛋清源抗氧化肽粉，其特征在于，其制备工艺按照权利要求1所述的蛋清源抗氧化肽粉的制备方法，其分子量为300～600Da，蛋白质含量为94.28％，DPPH清除率为90.2％，还原力为1.8，含水量为1％～3％。