CN104788541A - 具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。该小肽的氨基酸序列为AREGETVVPG。该小肽的制备方法包括：将麦胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物Ⅰ；取所述清蛋白水解产物Ⅰ中分子量小于10KDa的组分，采用凝胶过滤色谱分离，取具有抗氧化活性的组分作为清蛋白提取物Ⅱ；将所述清蛋白提取物Ⅱ采用碱性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物Ⅲ；将所述清蛋白水解产物Ⅲ依次采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离，得到所述小肽。本发明小肽具有较强抗氧化活性，来源于麦胚清蛋白，具有安全、高效、制备方法简单重复性好的特点，可以应用于提高食品的稳定性、储藏期或制备具有抗氧化活性保健食品。

Description

具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用。

背景技术

自由基理论被提出后，许多研究结果都显示自由基与人类多种疾病和衰老的发生有关，如动脉粥样硬化、血栓、心肌缺血再灌注损伤、糖尿病、癌症和神经退行性疾病等。活性氧(ROS)是一种广泛存在于人体中的自由基，由线粒体产生，包括超氧阴离子自由基、羟基自由基等，它们会损伤线粒体DNA、酶和膜脂质，从而引起各种疾病的发生。抗氧化剂具有捕获和中和自由基的能力，当机体中的自由基产生过多而超出清除能力的范围时，通过补充抗氧化剂可以清除多余的自由基，维持体内自由基平衡，可以有效预防多种自由基引起的疾病。人工合成的抗氧化剂如BHA、BHT、PG、TBHQ等，是多种食品的添加剂，它们能延缓或阻止食品中的油脂酸败、蛋白质变性，提高食品的稳定性、延长储藏期。但长期服用会伤害人体的肝、脾、肺，具有蓄积性致癌作用，影响与呼吸相关的酶的活性，人工抗氧化剂的应用因此受到了限制。从动物和植物中寻找具有抗氧化活性的天然物质是解决这一问题的关键，且天然抗氧化剂具有安全、高效、来源广泛的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有较强抗氧化活性的小肽，来源于麦胚清蛋白，具有安全、高效、来源广泛的特点。

本发明的另一目的是提供上述小肽的制备方法，该方法简单，安全，高效，重复性好。

本发明的再一目的是提供上述小肽在提高食品的稳定性、延长食品储藏期或者制备具有抗氧化活性的保健食品方面的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种具有抗氧化活性的小肽，氨基酸序列为AREGETVVPG，如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供所述小肽的制备方法，包括如下步骤：

(1)将麦胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物Ⅰ；

(2)取所述清蛋白水解产物Ⅰ中分子量小于10KDa的组分，采用凝胶过滤色谱分离，取具有抗氧化活性的组分作为清蛋白提取物Ⅱ；

(3)将所述清蛋白提取物Ⅱ采用碱性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物Ⅲ；

(4)将所述清蛋白水解产物Ⅲ依次采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离，得到所述小肽。

优选的技术方案中，步骤(2)中所述凝胶过滤色谱中的凝胶填料为SephadexG-75，流动相为水。

优选的技术方案中，步骤(4)中所述凝胶过滤色谱中的凝胶填料为SephadexG-15，流动相为水，取具有抗氧化活性的洗脱液。

优选的技术方案中，步骤(4)中所述反相高效液相色谱中使用WatersXBridgeTM prep C18色谱柱，洗脱程序为：0～10min，流动相A100～85％线性降低，流动相B0～15％线性升高；10～15min，流动相A85～80％线性降低，流动相B15～20％线性升高；收集对应于流动相B体积浓度为15.8～16％时的洗脱液，即得所述小肽；所述流动相A是浓度为0.05-0.15％三氟乙酸的水溶液，流动相B是浓度为0.05-0.15％三氟乙酸的乙腈溶液。

步骤(1)中所述麦胚清蛋白优选采用如下方法获得：采用水提取脱脂麦胚粉中的清蛋白，加入硫酸铵至饱和度为70％-80％，搅拌，离心取沉淀。

优选的技术方案中，所述胰蛋白酶酶解过程中，每克清蛋白中加入6000-8000U胰蛋白酶，酶解温度为36.5-37.5，酶解pH7.0-8.0，酶解时间5-7h。

优选的技术方案中，步骤(3)中碱性蛋白酶酶解过程中，每克蛋白中加入碱性蛋白酶0.1-0.2AU，酶解温度45-55℃，酶解pH7.5-8.5，酶解时间1.0-2.0h。

本发明还要求保护所述小肽在提高食品的稳定性、延长食品储藏期或者制备具有抗氧化活性的保健食品方面的应用。

本发明小肽，具有较强的抗氧化活性，来源于麦胚清蛋白，是理想的天然抗氧化剂，具有安全、高效、来源广泛、价格低廉的特点。该小肽可以应用于提高食品的稳定性、延长食品储藏期；或者制成具有抗氧化活性的保健食品，为人体的健康和疾病的预防提供更多的选择。

本发明将麦胚清蛋白进行酶解后，巧妙选择了超滤和色谱法从组分众多、成分复杂的蛋白水解物中分离到了具有抗氧化活性的小肽。该方法简单，安全，高效，重复性好。

附图说明

图1为Sephadex G-75分离图谱。

图2为Sephadex G-15分离图谱。

图3为RP-HPLC分离图谱，其中横坐标为保留时间，纵坐标为响应值(单位mAU)。

图4为洗脱液P3中活性组分的的TIC图，其中横坐标为保留时间，纵坐标为峰高。

图5为洗脱液P3中活性组分的二级质谱图，其中横坐标表示离子的质荷比(m/z)值，纵坐标表示离子流的强度。

图6为洗脱液P3中活性组分对细胞内ROS的影响，其中横坐标为不同的处理，纵坐标为ROS的量。

具体实施方式

实施例1制备具有抗氧化活性的小肽

(1)麦胚清蛋白的提取：准确称取脱脂麦胚粉100g，加入1000ml去离子水，混合均匀，在40℃水浴中搅拌提取1h；8000rpm离心30min，取上清液缓慢加入硫酸铵至饱和度为75％，4℃下搅拌2h；12000rpm离心20min，弃去上清，收集沉淀，该沉淀即为麦胚清蛋白。为了进行后续的纯化，将麦胚清蛋白透析除盐、冷冻干燥获得麦胚清蛋白粉。

(2)胰蛋白酶酶解：用pH7.6、浓度0.1M的磷酸盐缓冲液溶解麦胚清蛋白粉，每克蛋白加入7000U胰蛋白酶(购自上海生工生物工程有限公司，2500000U/g)，在37℃下酶解6h，得到清蛋白水解产物Ⅰ。pH7.6、浓度0.1M的磷酸盐缓冲液：取86.6ml的磷酸氢二钾(1M)溶液和13.4ml的磷酸二氢钾(1M)溶液混合均匀并定容到1L。

(3)清蛋白水解产物Ⅰ的分离纯化：①超滤膜法：将截留分子量为10KDa超滤膜安装在超滤装置上，去离子水清洗；清蛋白水解产物Ⅰ用pH7.6、0.1M磷酸盐缓冲液稀释至质量百分浓度为0.1％后上样；调节泵的压力使进口端压力不超过20psi，出口端的压力不超过30psi进行超滤。超滤后收集滤过液，其中含有分子量小于10KDa的组分。将分子量小于10KDa的组分除盐并冷冻干燥，获得冻干粉。②凝胶过滤色谱法：Sephadex G-75干粉(购自美国GE公司)用去离子水充分溶胀，利用重力沉降原理装填入2.5*75cm层析柱中，去离子水平衡；将①得到冻干粉溶于去离子水配成质量百分浓度为2％的溶液，经0.22μm的滤膜过滤除去颗粒物，采用Sephadex G-75凝胶柱分离，上样量为柱体积的5％；去离子水洗脱，流速为30ml/h，检测波长220nm，每10min收集一管洗脱液，收集液冷冻干燥，测抗氧化活性。分离色谱图如图1所示。经测定，对应于保留时间6.5h～8.25h的洗脱液具有抗氧化活性，将该洗脱液作为清蛋白提取物Ⅱ，冷冻干燥，获得冻干粉。

(4)碱性蛋白酶酶解：将清蛋白提取物Ⅱ冻干粉溶于pH8.0、浓度0.1M的磷酸盐缓冲液，每克蛋白中加入0.15AU碱性蛋白酶(购自诺维信公司，2.4AU/ml)酶解，在50℃下酶解1.5h，得到清蛋白水解产物Ⅲ，冷冻干燥得到冻干粉。

(5)清蛋白水解产物Ⅲ的分离纯化：①凝胶过滤色谱法：Sephadex G-15干粉(购自美国GE公司)用去离子水充分溶胀，利用重力沉降原理装填入1.5*60cm层析柱中，去离子水平衡；清蛋白水解产物Ⅲ冻干粉溶于去离子水配成质量百分浓度为2％的溶液，经0.22μm的滤膜过滤除去颗粒物，采用Sephadex G-15凝胶柱分离，上样量为柱体积的3％；去离子水洗脱，流速为30ml/h，检测波长220nm，每10min收集一管洗脱液，收集液冷冻干燥，测抗氧化活性。分离色谱图如图2所示。对应于保留时间1.5h～2.5h的洗脱液具有抗氧化活性，收集该洗脱液冷冻干燥后进行下一步纯化。②制备型RP-HPLC法：将Sephadex G-15凝胶柱分离到的组分采用反相高效液相色谱法分离。选用Waters XBridgeTM prep C18色谱柱(购自美国Waters公司)，流动相A是是体积百分浓度为0.1％TFA(三氟乙酸)的去离子水溶液，流动相B是体积百分浓度为0.1％TFA(三氟乙酸)的乙腈溶液。

洗脱程序为：0～10min，流动相A100～85％线性降低，流动相B0～15％线性升高；10～15min，流动相A85～80％线性降低，流动相B15～20％线性升高。检测波长为214nm，柱温为25℃。分离图谱如图3所示。收集对应于流动相B体积浓度为15.8～16％的洗脱液P3，其抗氧化活性最高，进行进一步的结构鉴定。

(6)结构鉴定：采用LC-MS/MS检测反相高效液相色谱色谱法中洗脱液P3中的活性组分纯度及氨基酸序列。将待测样品溶于去离子水配制成浓度为20μg/ml的蛋白溶液。流动相A为0.1％(质量百分浓度)甲酸的水溶液，B为0.1％(质量百分浓度)甲酸的乙腈溶液，选用BEH C18色谱柱柱。洗脱程序为：0-5min，流动相A100～85％线性降低，流动相B0～15％线性升高；5～10min，流动相A85～100％线性升高，流动相B15％～0线性降低。样品经过液相色谱分离系统后，再由质谱系统将肽段打成不同分子量的碎片，并由质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器检测得到质谱图，实验结果如图4-5。分析质谱图，发现洗脱液P3中的活性组分为氨基酸序列为AREGETVVPG的小肽，分子量为1014.52Da。洗脱液P3的冻干粉中该小肽的纯度为85％。

(7)测定小肽AREGETVVPG的抗氧化活性

①采用DPPH法测样品的抗氧化活性，方法步骤为:准确称量DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，购自美国Sigama公司)0.0046g，用无水乙醇溶解后定容到100ml，配成0.12mM的DPPH溶液；待测样品稀释成不同浓度，将1ml待测样品和1ml DPPH溶液混合均匀，25℃下避光反应30min，反应结束后在517nm波长下测定吸光值A_i。实验需设置空白组和对照组。其中，空白组中以水替代样品，其他步骤同样品检测方法，得到吸光值A₀；对照组中以无水乙醇替代DPPH溶液，其他步骤同样品检测方法，测定吸光值A_j。每组设置3个平行，按如下公式计算清除率：

该小肽清除自由基DPPH的IC₅₀为1mg/ml。

②采用DCFH-DA法测样品对细胞内活性氧(ROS)自由基的清除能力，实验方法为：将DCFH-DA(二氯荧光黄二乙酸酯，购自美国Sigama公司)溶于DMSO配置成10mM/L的储存液，-20℃避光保存。24孔板中每孔加入2-6万个血管平滑肌细胞和500μl低糖培养液(含有10％(体积百分含量)胎牛血清，1％(体积百分含量)Penicillin-Streptomycin和89％(体积百分含量)DMEM培养基，3种试剂均购自Gibco公司)，在CO₂培养箱中培养48h使细胞贴壁。吸取细胞培养液，加入不含血清的DMEM低糖培养液(购自Gibco公司)饿细胞16h，然后对细胞分别进行不同处理：低糖组(NG)细胞不添加任何物质；阳性对照组(NG+H₂O₂)加入H₂O₂(每孔浓度为200μM)；高糖组(HG)加入终浓度为25mM的葡萄糖；样品组(HG+AOPⅠ组和HG+AOPⅡ组)加入终浓度为25mM葡萄糖和不同浓度的本发明小肽，HG+AOPⅠ组中本发明小肽的终浓度为5μg/ml，HG+AOPⅡ组中本发明小肽的终浓度为10μg/ml，混合均匀，培养8h。吸取孔内液体，用HBSS缓冲液(又称Hank's平衡盐溶液，购自Gibco公司)洗细胞2次，加入用HBSS稀释后的DCFH-DA溶液(DCFH-DA的浓度为10μM)，混合均匀，在CO₂培养箱中培养1h。最后在酶标仪中激发波长485nm，发射波长530nm下测定各孔荧光值。实验结果如图6。高糖组(HG)的ROS量明显高于低糖组(NG)，高糖中加入抗氧化肽(HG+AOP)可显著抑制高糖所引起的血管平滑肌细胞内ROS的产生增加。

小肽AREGETVVPG清除自由基DPPH的IC₅₀为1mg/ml，能显著抑制血管平滑肌细胞内由高糖引起的ROS量增加，说明小肽AREGETVVPG具有较强的抗氧化活性，可以用于提高食品的稳定性、延长食品储藏期或者制备具有抗氧化活性的保健食品。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京财经大学

 

<120>  具有抗氧化活性的小肽、制备方法及其应用

 

<130>  20150506

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  10

<212>  PRT

<213>  麦胚

 

<400>  1

 

Ala Arg Glu Gly Glu Thr Val Val Pro Gly

1               5                   10 

 

 

Claims (9)

1.一种具有抗氧化活性的小肽，氨基酸序列为AREGETVVPG。

2.权利要求1所述小肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将麦胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物Ⅰ；

(2)取所述清蛋白水解产物Ⅰ中分子量小于10KDa的组分，采用凝胶过滤色谱分离，取具有抗氧化活性的组分作为清蛋白提取物Ⅱ；

(3)将所述清蛋白提取物Ⅱ采用碱性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解产物Ⅲ；

(4)将所述清蛋白水解产物Ⅲ依次采用凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱分离，得到所述小肽。

3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述凝胶过滤色谱中的凝胶填料为Sephadex G-75，流动相为水。

4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤(4)中所述凝胶过滤色谱中的凝胶填料Sephadex G-15，流动相为水，取具有抗氧化活性的洗脱液。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于步骤(4)中所述反相高效液相色谱中使用Waters XBridgeTM prep C18色谱柱，洗脱程序为：0～10min，流动相A 100～85％线性降低，流动相B 0～15％线性升高；10～15min，流动相A85～80％线性降低，流动相B 15～20％线性升高；收集对应于流动相B体积浓度为15.8～16％时的洗脱液，即得所述小肽；所述流动相A是浓度为0.05-0.15％三氟乙酸的水溶液，流动相B是浓度为0.05-0.15％三氟乙酸的乙腈溶液。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于步骤(1)中所述麦胚清蛋白采用如下方法获得：采用水提取脱脂麦胚粉中的清蛋白，加入硫酸铵至饱和度为70％-80％，搅拌，离心取沉淀。

7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于所述胰蛋白酶酶解过程中，每克清蛋白中加入6000-8000U胰蛋白酶，酶解温度为36.5-37.5，酶解pH7.0-8.0，酶解时间5-7h。

8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于步骤(3)中碱性蛋白酶酶解过程中，每克蛋白中加入碱性蛋白酶0.1-0.2AU，酶解温度45-55℃，酶解pH7.5-8.5，酶解时间1.0-2.0h。

9.权利要求1所述小肽在提高食品的稳定性、延长食品储藏期或者制备具有抗氧化活性的保健食品方面的应用。