CN102495169B - 一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，属于生物制品分离纯化技术领域。本发明涉及枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶和中性蛋白酶复配酶解一种成本低廉的末水条斑紫菜，得到紫菜抗氧化多肽粗品。该粗品利用SephadexG-10、DEAE-52和SOURCE3RPC等色谱手段分离纯化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通过测定DPPH消除能力，清除超氧自由基能力，清除羟自由基能力和还原力来综合反映紫菜抗氧化活性肽的抗氧化性。经RP-HPLC分析型色谱测定其纯度，Q-TOF-MS分析鉴定其氨基酸组成，并对其抗氧化活性的稳定性进行研究。该紫菜抗氧化活性肽具有较小分子量，稳定性好，能够有效清除自由基，可作为食源性抗氧化剂，在保健食品，医药和化妆品领域有广泛的应用前景。
Description
技术领域
一种紫菜可控酶解产抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，属于生物制品分离纯化技术领域。
背景技术
酶制剂已广泛应用在食品、酿造、制药、有机酸、淀粉糖、饲料工业、纺织、皮革、洗涤剂及保健品等各个领域，应用领域越来越广泛，食品与人们的生活密切相关，因此酶在食品工业中的应用价值越来越重要，目前在烘焙、奶制品、肉类加工、新型营养食品和蛋白质的水解中得到很大的体现。
酶解蛋白质生产多肽已成为当今研究热门，通过不同的酶切方式可以获得不同功能的活性多肽，尤其是开发一些寡肽物质，成为蛋白质研究中的一个新领域。
紫菜具有较高的食疗药用价值，紫菜提取液具有降血脂，防止动脉粥样硬化的功能。我国沿海大量养殖紫菜，一般末水条斑紫菜因口感较差往往售价很低。但其蛋白质含量仍然在25%左右、另外还含有多糖、琼脂、VC、各种矿物质等。目前紫菜的主要利用途径是制成海苔休闲食品，深加工产品较少，不断开展对紫菜的深加工和综合利用显得尤为迫切和必要。
由紫菜蛋白经过酶解产生紫菜多肽，分子量介于蛋白质与氨基酸之间，是以小分子肽为主、多种功效成分共存的蛋白质水解产物，可100%吸收入血液循环。将紫菜的各类功能因子用来加工功能性食品已经成为紫菜深度开发利用的重要方向。
本实验室研究制备的固体氨肽酶为外肽酶，可以从多肽链的N端解离氨基酸，该枯草芽孢杆菌所产氨肽酶酶系较为单一，它具备与多种内切性蛋白酶复配应用的潜力。经本实验室研究该氨肽酶与中性蛋白酶复合酶解末水条斑紫菜，可得到相对较高的水解度，具有较小分子量，稳定性好，能够有效清除自由基的抗氧化活性肽。
发明内容
本发明目的是提供一种紫菜可控酶解产抗氧化活性肽的纯化及分析鉴定方法，该紫菜抗氧化活性肽具有较小分子量，稳定性好，能够有效清除自由基，其抗氧化活性均保持在60%以上，温度耐受性也较好，可作为食源性抗氧化剂，在保健食品，医药和化妆品领域有广泛的应用前景。
本发明的技术方案：
枯草芽孢杆菌Zj016固体氨肽酶（中国专利201010578579.1已公开，公开号CN102078012A，公开日2011-6-1）和商品化中性蛋白酶复配酶解紫菜，制备紫菜抗氧化多肽粗品。该粗品利用Sephadex G-10、DEAE-52和SOURCE 3RPC等色谱手段分离纯化，得到酶解紫菜抗氧化活性肽。通过测定DPPH消除能力、清除超氧自由基能力，清除羟自由基能力和还原力来综合反映紫菜抗氧化肽的抗氧化性。经反相高效液相 (RP-HPLC) 分析型色谱测定其纯度，超高效液相色谱-质谱法 (Q-TOF-MS) 分析鉴定其氨基酸组成，并对其稳定性进行研究。
提取工艺为：
A一种枯草杆菌固体氨肽酶在紫菜复配酶解中的应用
(1) 将一种末水条斑紫菜撕成小块，放入培养皿中；将培养皿放入烘箱中，于105℃的条件下烘干6h~8h至恒重；取出将干品放入粉碎机中研碎，得到紫菜粉末。
(2) 以紫菜粉末为底物，以pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液为介质，底物与缓冲液的比例为1︰30，中性蛋白酶加入量为E/S=1×105-2×105 U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1×104 -2×104U/g。50℃水解6 h，80℃灭酶15 min，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60%。室温静置12 h，10000 r/min离心10 min，得到的上清液为含抗氧化紫菜多肽的混合物。
B酶解紫菜抗氧化活性肽的分离纯化及鉴定方法
(1) 将紫菜多肽混合物通过大孔树脂D101脱色后，冷冻干燥得到淡黄色多肽粉末。将该淡黄色多肽粉末经过Sephadex G-10凝胶层析，流动相为0.1 mol/L NaCl，流速0.1 mL/min，收集峰组分，冷冻干燥，得到浅黄色多肽粉末。
(2) DEAE-52离子交换层析：步骤(1)所得多肽粉末进行离子交换层析，采用阶段洗脱的方法，流动相：0~250 min 0.1 mol/L NaCl，250~400 min 0.2 mol/L NaCl，400~550min 0.3 mol/L NaCl 和550~650min 0.4 mol/L NaCl的pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，进样量为20 mL，流速1 mL/min，检测波长为220 nm，收集峰组分，冷冻干燥；
(3)SOURCE 3RPC ST4.6/100反相层析：步骤(2)所得多肽粉末进行反相层析，流动相为A：含0.1%三氟乙酸的10%-15%乙腈溶液；B：含0.1%三氟乙酸的80%-75%乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～20 min 100% A；20~40 min 100%A~100%B；40~60 min 100%B，进样量为2 mL，流速1.5 mL/min，检测波长为220 nm，收集浓缩的峰组分，得到酶解紫菜抗氧化活性肽；
(4) 利用反相高效液相(RP-HPLC)分析型色谱测定该白色的酶解紫菜抗氧化活性肽纯度达87.44%。超高效液相色谱—质谱法 (Q-TOF-MS) 分析鉴定为一种六肽DGVGYG (Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly)。结果如图2。
C 酶解紫菜抗氧化活性肽的稳定性
紫菜抗氧化活性肽分别在60℃，80℃及100℃的水浴环境中放置2小时，立即用冰水冷却，其抗氧化活性均保持在60%以上，温度耐受性较好。结果如图3，图4。
氨肽酶的酶活
LNA法测定。测定时，首先配Tris-HCl缓冲液，取6.075g Tris溶于900mL蒸馏水，用浓HCl调至pH8.5，然后定容至1L。以L-亮氨酸对硝基苯胺 L-leu-pNA作为底物，取0.1g底物溶于1mL酒精，然后用Tris-HCl缓冲液定容到100mL。取0.1g固体氨肽酶粉用Tris-HCl缓冲液定容到100mL作为待测酶液。加入2mL的Tris-HCl缓冲液和1mL底物（L-亮氨酸对硝基苯胺 L-leu-pNA），一个加入1mL酶液，另一个加入1mL Tris-HCl缓冲液作为对照，在50℃水浴反应10min后，405nm比色测定酶活。
酶活公式：酶活=A×105.7×4×n/10
其中：A为待测酶液的吸光度；n为待测酶液的稀释倍数。
酶活力定义：50℃，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1微摩尔的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。
测定样品对DPPH（二苯代苦味肼基）自由基的清除率
采用消除DPPH自由基法。取2mL待测样品，加入2mL质量浓度为0.04g/L的DPPH·无水乙醇溶液，混合均匀后反应20min，在转速3500 r/min下，离心10min，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Ai；另取2mL待测样品于试管中，分别加入无水乙醇2 mL，反应20min，在转速3500r/min下离心10min，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Aj；以2mL质量浓度0.04g/L的DPPH·无水乙醇溶液和2mL无水乙醇反应作为参比，其在波长517nm处吸光度记为A0，按照下列式子计算样品对DPPH自由基的清除率：
清除率=(1— 
)
100%
式中：Ai———DPPH·加待测样品的吸光度；
Aj———无水乙醇加待测样品的吸光度；
A0———DPPH·加无水乙醇的吸光度；
测定样品对超氧自由基的清除率
称取适量酶解产物溶解于1mL的蒸馏水中，取0.1 mL加入2.8 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.2)，空白对照管以双蒸馏水代替样品，震荡混匀，在25℃水浴保温10 min 后加入0.1 mL 3 mmol/L的邻苯三酚溶液(25℃水浴预热)，迅速混匀并开始计时，每隔30 s在325 nm处测定吸光度值A325, 5 min后结束，以0.1 mL 双蒸水加2.8 mL 的Tris-HCL 缓冲溶液调零。作吸光度随时间变化的回归方程，其斜率为邻苯三酚自氧化速率V。按下式计算清除率：
式中：A 空白——空白样的吸光度；
A 样——样品的吸光度。
测定样品对羟自由基的清除率
在2 mL待测样品中，分别加入2 mL浓度为6 mmol/L的FeSO4，2 mL浓度为6 mmol/L的H2O2，混合后室温静置10 min，然后加入2 mL浓度为6 mmol/L的水杨酸，混合均匀，室温静置30 min后，在波长510 nm处测量其吸光度，记录为A i；用蒸馏水代替水杨酸再次测量其吸光度，记录为A j，空白对照组以蒸馏水代替样品，测量吸光度，记录为A o。清除羟自由基计算公式为：
清除率=(1—
)
100%
测定样品还原力
在15mL试管中分别加入不同浓度样品1mL, 磷酸盐缓冲溶液(0.2mol/L, pH6.6) 2.5mL和1%铁氰化钾5mL, 置于50℃水浴中反应20min, 然后加入10%的三氯乙酸5mL，摇匀。吸取上清液2.5mL, 加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1% 的三氯化铁溶液。样品在700nm处测定吸光值, 反应物的吸光值越大表明还原力越强。
本发明的有益效果：采用氨肽酶与中性蛋白酶复配酶解一种末水条斑紫菜，得到一种紫菜抗氧化多肽粗品；通过凝胶、离子交换、反相三步组合的分离步骤从中分离出达一定纯度，抗氧化活性较高且稳定的酶解紫菜抗氧化肽；利用超高效液相色谱—质谱法鉴定为一种六肽 (Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly)。该抗氧化肽具有较小分子量，能够有效清除自由基，可作为食源性抗氧化剂。在制备抗氧化药物、抗氧化性肽方面具有很好的应用前景，对紫菜的深加工和充分合理利用有很好的发展前景。
附图说明
图1紫菜酶解后所产抗氧化活性肽的纯化制备及分析鉴定流程示意图。
图2酶解紫菜抗氧化活性肽 m/z 505.25的氨基酸序列图。
图3 酶解紫菜抗氧化活性肽自由基消除率稳定性。
图4酶解紫菜抗氧化活性肽还原力稳定性。
具体实例方式
实施例1
将枯草芽孢杆菌Zj016发酵液在4℃，6000rpm离心10min收集2.5L发酵液，在4℃下加入(NH4)2SO4 500 g(边加边搅拌)，4℃，6000rpm离心10min，收集澄清液2.5L，选用50kDa的超滤膜进行浓缩到0.85L，流速30mL/min；选用30kDa的超滤膜脱盐后0.85L，流速40 mL/min，将浓缩脱盐液冷冻干燥后得到固体氨肽酶。得到的固体氨肽酶的酶活为7×105U/g。
以烘干到恒重的2g末水条斑紫菜粉末为底物，以pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液为介质，底物与缓冲液的比例为1: 30，中性蛋白酶加入量为E/S=1.48×105 U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1.30×104 U/g。50 ℃水解6 h，80℃灭酶15 min，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60%。室温静置12 h，10000 r/min离心10 min，得到的上清液为含抗氧化紫菜多肽的混合物。将紫菜多肽混合物通过大孔树脂D101脱色后，冷冻干燥得到淡黄色多肽粉末。将该淡黄色多肽粉末经过Sephadex G-10凝胶层析，流动相为0.1 mol/L NaCl，流速0.1 mL/min，收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥，得到浅黄色多肽粉末。再经过DEAE-52离子交换层析分离纯化，流动相分别为0-250min含0.1 mol/L NaCl、250-400min 0.2 mol/L NaCl、400-550min 0.3 mol/L NaCl和550-650min 0.4 mol/L NaCl的pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，进样量为20mL，流速1mL/min，检测波长220nm，收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥。然后利用SOURCE 3RPC ST4.6/100进一步分离纯化后，流动相为A：10%乙腈，0.1%三氟乙酸(TFA)；B：80%乙腈，0.1%三氟乙酸(TFA)；梯度洗脱：0-20min 100%A，20-40min 100%A~100%B，40~60min 100%B，进样量为2mL，检测波长220nm，流速1.5mL/min，收集浓缩抗氧化活性较高的峰组分得到酶解紫菜抗氧化活性肽。当其浓度为100μg/mL时，对超氧自由基、DPPH和羟自由基的清除率依次为23.25%，47.12%，47.12%，分别是同浓度下抗坏血酸(VC)的0.79，0.87，0.91倍，还原能力为VC的1.23倍，有很强的抗氧化性。反相高效液相 (RP-HPLC) 分析型色谱测定其纯度达87.44%。超高效液相色谱—质谱法 (Q-TOF-MS) 分析鉴定为一种六肽DGVGYG (Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly)。紫菜抗氧化活性肽分别在60℃，80℃和100℃的水浴环境中放置2小时，立即用冰水冷却，其抗氧化活性均保持在60%以上，温度耐受性较好。
实施例2
以烘干到恒重的3g末水条斑紫菜粉末为底物，以pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液为介质，底物与缓冲液的比例为1: 30，中性蛋白酶加入量为E/S=1.48×105 U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1.30×104 U/g。50 ℃水解6 h，80 ℃灭酶15 min，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60%。室温静置12 h，10000 r/min离心10 min，得到的上清液为含抗氧化紫菜多肽的混合物。将紫菜多肽混合物通过大孔树脂D101脱色后，冷冻干燥得到淡黄色多肽粉末。将该淡黄色多肽粉末经过Sephadex G-10凝胶层析，流动相为0.1 mol/L NaCl，流速0.1 mL/min，收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥，得到浅黄色多肽粉末。再经过DEAE-52离子交换层析分离纯化，流动相为分别含0.1 mol/L NaCl、0.2 mol/L NaCl、0.3 mol/L NaCl和0.4 mol/L NaCl的pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，流速1 mL/min，收集抗氧化活性较高的峰组分，冷冻干燥。然后利用SOURCE 3RPC ST4.6/100进一步分离纯化后，流动相为A：15%乙腈，0.1%三氟乙酸(TFA)；B：70%乙腈，0.1%三氟乙酸(TFA)；流速1.5mL/min，收集浓缩抗氧化活性较高的峰组分得到酶解紫菜抗氧化活性肽。当其浓度为100μg/mL时，对超氧自由基、DPPH和羟自由基的清除率依次为23.17%，47.04%，47.06%，分别是同浓度下抗坏血酸(VC)的0.78，0.86，0.90倍，还原能力为VC的1.23倍，有很强的抗氧化性。反相高效液相 (RP-HPLC) 分析型色谱测定其纯度达87.44%。超高效液相色谱—质谱法 (Q-TOF-MS) 分析鉴定为一种六肽DGVGYG (Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly)。紫菜抗氧化活性肽分别在60℃，80℃和100℃的水浴环境中放置2小时，立即用冰水冷却，其抗氧化活性均保持在60%以上，温度耐受性较好。
Claims (1)
1.一种紫菜可控酶解后的抗氧化活性肽的分离纯化、鉴定方法，其特征在于：
（1）以烘干到恒重的末水条斑紫菜粉末为底物，以pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液为介质，底物与缓冲液的质量比例为1:30，中性蛋白酶加入量为E/S=1×105-2×105U/g，由枯草芽孢杆菌Zj016的发酵液提纯后得到的固体氨肽酶加入量为E/S=1×104 -2×104U/g，50℃水解6 h，80℃灭酶15min，加入乙醇至体系乙醇体积分数为60%，室温静置12h，10000 r/min离心10min，得到的上清液为含紫菜抗氧化多肽粗品；
（2）将紫菜抗氧化多肽粗品通过大孔树脂D101脱色后，冷冻干燥得到淡黄色多肽粉末，将该淡黄色多肽粉末依次经过Sephadex G-10、DEAE-52和SOURCE 3RPC ST4.6/100进一步分离纯化后，得到紫菜抗氧化活性肽；
a）Sephadex G-10凝胶层析：脱色后的多肽粉末进行凝胶层析，流动相为0.1 mol/L NaCl，流速0.1 mL/min，收集峰组分，冷冻干燥，得到浅黄色多肽粉末；
b）DEAE-52离子交换层析：步骤a)所得多肽粉末进行离子交换层析，采用阶段洗脱的方法，流动相：0~250 min 0.1 mol/L NaCl的pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，250~400 min 0.2 mol/L NaCl的pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，400~550min 0.3 mol/L NaCl的pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液和550~650min 0.4 mol/L NaCl的pH8.5 Na2HPO4-KH2PO4缓冲液，进样量为20 mL，流速1 mL/min，检测波长为220 nm，收集峰组分，冷冻干燥；
c）SOURCE 3RPC ST4.6/100反相层析：步骤b)所得多肽粉末进行反相层析，流动相为A：含0.1%三氟乙酸的10%-15%乙腈溶液；B：含0.1%三氟乙酸的80%-75%乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～20 min 100% A；20~40 min 100%A~100%B；40~60 min 100%B，进样量为2 mL，流速1.5 mL/min，检测波长为220 nm，收集浓缩的峰组分，得到紫菜抗氧化活性肽；
当其浓度为100μg/mL时，对超氧自由基、DPPH和羟自由基的清除率依次为超过20%，超过45%，超过45%，还原能力为VC的1倍以上，有很强的抗氧化性；
（3）分析鉴定：将所得紫菜抗氧化活性肽进行反相高效液相RP-HPLC分析型色谱测定，其纯度达85%以上；超高效液相色谱—质谱法Q-TOF-MS分析鉴定为一种六肽DGVGYG：Asp-Gly-Val-Gly-Tyr-Gly；
（4）温度耐受性：将所得紫菜抗氧化活性肽分别在60℃，80℃及100℃的水浴环境中放置2小时，立即用冰水冷却，其抗氧化活性均保持在60%以上。
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