CN102078012B

CN102078012B - 一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用

Info

Publication number: CN102078012B
Application number: CN2010105785791A
Authority: CN
Inventors: 田亚平; 姚翔
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Nantong Chitsuru Foods Co., Ltd.
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2030-12-08
Also published as: CN102078012A

Abstract

一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用，属于酶制剂﹑食品添加剂技术领域。本发明涉及枯草芽孢杆菌Zj016固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用，发酵液经过离心、澄清、浓缩、脱盐和冷冻干燥得固体氨肽酶。以活性产物主要是活性多糖和活性多肽对DPPH自由基即二苯代苦味肼基自由基的消除率为依据，通过正交试验优化条件选出紫菜酶解后活性产物高的内切酶，与固态氨肽酶进行复配，产生较高含量的活性产物，并且酶解后氨基酸含量也显著增加，将海菜类的酶解加工与酿造食品的加工有机地结合，可起到强化酿造食品的风味与功能因子的作用，在酿造食品和紫菜的深加工上有广泛的应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用

技术领域

一种食品级枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用，属于酶制剂、食品添加剂技术领域。

背景技术

酶制剂已广泛应用在食品、酿造、制药、有机酸、淀粉糖、饲料工业、纺织、皮革、洗涤剂及保健品等各个领域，应用领域越来越广泛，食品与人们的生活密切相关，因此酶在食品工业中的应用价值越来越重要，目前在烘焙、奶制品、肉类加工、新型营养食品和蛋白质的水解中得到很大的体现。

酶解蛋白质生产多肽已成为当今热门研究，通过不同的酶切方式可以获得不同功能的活性多肽，尤其是开发一些寡肽物质，成为蛋白质研究中的一个新领域。

在紫菜蛋白的氨基酸组成中，含量最高的几种氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸，而这些游离氨基酸对紫菜的风味贡献最大，其组成恰与主要呈味氨基酸组成相似。酶解紫菜释放出呈味氨基酸，可显著增强了鲜味。紫菜还具有较高的食疗药用价值，条斑紫菜提取液具有降血脂，防止动脉粥样硬化的功能。紫菜多糖除了传统工业价值外，还具有抗凝血、抗辐射、降血糖、调血脂、抗血栓、强心作用，抑制肿瘤、抗炎、防治溃疡、增强细胞免疫和体液免疫功能等多种生物活性，广泛用于食品和医药等行业。由紫菜蛋白经过酶解产生紫菜多肽，分子量介于蛋白质与氨基酸之间，是以小分子肽为主、多种功效成分共存的蛋白质水解产物，可100%吸收入血液循环。并且紫菜多肽营养高，可完全保留紫菜的营养成分，营养全面均衡，无抗原性，无过敏反应，服用安全；具有良好的溶解性、稳定性和低粘度性，同时还具有降血压、抗疲劳、提高免疫力、抗肿瘤、延缓衰老等作用。将紫菜的各类功能因子用来加工功能性食品已经成为紫菜深度开发利用的重要方向。本实验室生产的氨肽酶为外肽酶，可以从多肽链的N端解离氨基酸，经本实验室研究该氨肽酶与中性蛋白酶复合酶解紫菜，可得到相对较高的水解度，并得到高含量的消除DPPH自由基的活性物质，该枯草芽孢杆菌所产氨肽酶酶系较为单一，主要是一种外切型的蛋白酶，它具备与多种内切性蛋白酶复配应用的潜力。

发明内容

本发明目的对枯草芽孢杆菌发酵液提取工艺的改良，枯草芽孢杆菌发酵液经冷冻离心、澄清、超滤浓缩、脱盐和冷冻干燥，最终获得固体氨肽酶，得到的固体氨肽酶的比活达7.9×10³U/g，最适温度50℃，最适pH8.5。以紫菜为底物，以100mL Tris-HCl缓冲液为介质，中性蛋白酶加入量为E/S=1.6×10⁵-1.7×10⁵U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1.32×10⁴-1.58×10⁴U/g；50℃水解6h后，水解度为47.51%，DPPH自由基的消除率高达75.37%，其中多肽含量为21.47%，该部分对DPPH自由基的消除率为36.19%；多糖含量为23.92%，该部分对消除DPPH自由基的消除率为20.33%。酶解后酶解液中的游离氨基酸的总含量从45.2772mg/mL提高到93.8475mg/mL。主要呈味氨基酸丙氨酸含量从12.1796 mg/mL提高到27.5561 mg/mL，甘氨酸的含量从0.9597 mg/mL提高到2.4892 mg/mL，天冬氨酸的含量从0.6584 mg/mL提高到4.1911 mg/mL，谷氨酸的含量从0.9303 mg/mL提高到6.0014 mg/mL。

提取固体氨肽酶工艺的回收率统计如下：

澄清 88%～92%

超滤浓缩2.5倍 85%～90%

脱盐 75%～78%

冷冻干燥 82%～85%

总回收率 45%~55%

本发明的技术方案：一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用，枯草芽孢杆菌的发酵液冷冻离心、澄清、超滤浓缩、脱盐、冷冻干燥，得食品级固体氨肽酶，在优化条件下，固体氨肽酶对紫菜进行复配酶解。以活性产物对DPPH自由基的消除率为依据，寻找DPPH自由基消除率最高的酶解条件。

（1）将紫菜撕成小块，放入培养皿中；将培养皿放入烘箱中，于105℃的条件下烘干6~8h至恒重；取出将干品放入粉碎机中研碎，得到紫菜粉末；

（2）以2g紫菜粉末为底物，以100mL Tris-HCl缓冲液为介质，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配进行酶解，其中中性蛋白酶加入量为E/S=1.6×10⁵-1.7×10⁵U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1.32×10⁴-1.58×10⁴U/g；50℃酶解6h，煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静止12 h，然后4℃、10000rpm离心20min，此时沉淀为紫菜粗多糖，上清液为紫菜多肽混合物。

步骤（2）酶解后测得水解度达47.51%，DPPH自由基的消除率达75.37%，其中多肽含量为21.47%，该部分对DPPH自由基的消除率为36.19%；多糖含量为23.92%，该部分对DPPH自由基的消除率为20.33%；酶解后酶解液中的游离氨基酸的总含量从45.2772mg/mL提高到93.8475mg/mL；主要呈味氨基酸丙氨酸含量从12.1796 mg/mL提高到27.5561 mg/mL；甘氨酸的含量从0.9597 mg/mL提高到2.4892 mg/mL；天冬氨酸的含量从0.6584 mg/mL提高到4.1911 mg/mL；谷氨酸的含量从0.9303 mg/mL提高到6.0014 mg/mL。

A、枯草芽孢杆菌发酵液中固体氨肽酶的提取工艺为：

（1）发酵液经10000 rpm，4℃离心10min后，取上清，弃沉淀；

（2）向收集的上清液中加入(NH₄)₂SO₄，(边加边搅拌)，质量分数为20%，以10000rpm，4℃离心10min后，弃沉淀，收集澄清液；

（3）将收集到的澄清液进行超滤浓缩，浓缩2.5倍，所选用超滤膜截留分子量为50kDa；温度室温，操作压0.1mpa，pH自然，流速 30~35mL/min；

（4）将得到的超滤液进行脱盐，所选用超滤膜截留分子量为30kDa，温度室温，操作压0.1mpa；流速 40~45mL/min；

（5）将脱盐后的液体，进行冷冻干燥，即得到固体氨肽酶。

B、一种枯草杆菌固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用的条件确定

（1）将紫菜撕成小块，放入培养皿中；将培养皿放入烘箱中，于105℃的条件下烘干6h~8h至恒重；取出将干品放入粉碎机中研碎，得到紫菜粉末。

（2）以2g紫菜粉末为底物，底物与缓冲液的比例为1:50，分别加入中性蛋白酶，酸性蛋白酶，碱性蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶的量为2×10⁵ U/g，在其最优pH和水解温度下，酶解6h，通过单一酶解的比较，选择出酶解后活性物质活性最高的内切酶，为中性蛋白酶。其最优酶解条件为底物与pH7.5的磷酸缓冲液比例为1:50，加酶量为1.5×10⁵ U/g，50℃水解6h，煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静止12 h后10000rpm，4℃离心20min离心，此时沉淀为紫菜粗多糖，上清液为紫菜多肽混合物。测得水解度为36.43%，DPPH自由基的消除率高达51.61%，其中多肽含量为12.01%，该部分对DPPH自由基的消除率为20.17%；多糖含量为20.25%，该部分对DPPH自由基的消除率为17.43%。

（3）用中性蛋白酶和本实验室得到的固体氨肽酶进行复配，其中中性蛋白酶加入量为E/S=1.6×10⁵U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1.58×10⁴U/g；以2g紫菜粉末为底物，以100mL Tris-HCl缓冲液为介质，在50℃水解6h后，煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静止12 h后10000rpm，4℃离心20min离心，此时沉淀为紫菜粗多糖，上清液为紫菜多肽混合物。测得水解度为47.51%，DPPH自由基的消除率最高可达75.37%，其中多肽含量为21.47%，该部分对DPPH自由基的消除率为36.19%；多糖含量为23.92%，该部分对消除DPPH自由基的消除率为20.33%。酶解后酶解液中的游离氨基酸的总含量从45.2772mg/mL提高到93.8475mg/mL。主要呈味氨基酸丙氨酸含量从12.1796 mg/mL提高到27.5561 mg/mL，甘氨酸的含量从0.9597 mg/mL提高到2.4892 mg/mL，天冬氨酸的含量从0.6584 mg/mL提高到4.1911 mg/mL，谷氨酸的含量从0.9303 mg/mL提高到6.0014 mg/mL。

固体氨肽酶的酶活

LNA法测定。测定时，首先配Tris-HCl缓冲液，取6.075gTris溶于900mL蒸馏水，用浓HCl调至pH8.5，然后定容至1L。以L-亮氨酸对硝基苯胺 L-leu-pNA作为底物，取0.1g底物溶于1mL酒精，然后用Tris-HCl缓冲液定容到100mL。取0.1g固体氨肽酶粉用Tris-HCl缓冲液定容到100mL作为待测酶液。加入2mL的Tris-HCl缓冲液和1mL底物（L-亮氨酸对硝基苯胺 L-leu-pNA），一个加入1mL酶液，另一个加入1mLTris-HCl缓冲液作为对照，在50℃水浴反应10min后，405nm比色测定酶活。

酶活公式：酶活=A×105.7×4×n/10

其中：A为待测酶液的吸光度；n为待测酶液的稀释倍数。

酶活力定义：50℃，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生1微摩尔的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。

测定样品对DPPH自由基即二苯代苦味肼基自由基的清除率

采用消除DPPH自由基法。取2mL待测样品，加入2mL质量浓度为0.04g/L的DPPH·无水乙醇溶液，混合均匀后反应20min，在转速3500 r/min下，离心10min，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Ai；另取2mL待测样品于试管中，分别加入无水乙醇2 mL，反应20min，在转速3500r/min下离心10min，取上清液，在波长517nm处测其吸光度为Aj；以2mL质量浓度0.04g/L的DPPH·无水乙醇溶液和2mL无水乙醇反应作为参比，其在波长517nm处吸光度记为A₀，按照下列式子计算样品对DPPH自由基的清除率：

式中：A_i———DPPH·加待测样品的吸光度；

A_j———无水乙醇加待测样品的吸光度；

A₀———DPPH·加无水乙醇的吸光度

蒽酮比色法测多糖含量。配制一系列不同浓度梯度的标准葡萄糖溶液，分别取1mL置于试管中浸于冰水浴中冷却，然后在冰浴条件下加入蒽酮试剂，同时将各管置于沸水浴中准确加热7min，立即取出置冰浴中冷却至室温,640nm下测吸光度绘制标准曲线。将待测粗多糖溶液稀释30倍，按上述步骤操作，由回归方程得到对应的样品多糖含量。

磷钼酸沉淀法测多肽含量。取灭酶后的酶解液20mL置于50mL容量瓶中，加入15mL水及2mL钼酸钠溶液，定容摇匀，立即用滤纸重复过滤至滤清，将滤液稀释50倍后取1mL用福林酚法测定低肽的含量。

低肽含量(%)=（低肽量/总蛋白含量）×稀释倍数×100

TCA法测水解度。取5mL酶解液加入5mL 10%的TCA，混合振荡，4000r/min离心20min。取上清液稀释50倍，总蛋白含量和上清液可溶性蛋白的含量分别用微量凯氏定氮法和福林- 酚法测定。

DH(%)=(N₂- N₁)/(N₀- N₁) ×100

式中: N₀为紫菜中的总蛋白；

N₁为酶解反应前紫菜中的TCA可溶性蛋白；

N₂为酶解后上清液中的TCA可溶性蛋白。

（4）中性蛋白酶和氨肽酶复合酶解紫菜酶解液中游离氨基酸的测定。

氨基酸分析液相色谱仪(Ag1100) 游离氨基酸的总含量从45.2772mg/mL提高到93.8475mg/mL。主要呈味氨基酸丙氨酸含量从12.1796 mg/mL提高到27.5561 mg/mL，甘氨酸的含量从0.9597 mg/mL提高到2.4892 mg/mL，天冬氨酸的含量从0.6584 mg/mL提高到4.1911 mg/mL，谷氨酸的含量从0.9303 mg/mL提高到6.0014 mg/mL。结果如图2。

本发明的有益效果：固体氨肽酶的提取方法容易扩大生产，通过中性蛋白酶和固体氨肽酶复配酶解紫菜后，酶解液中呈味氨基酸含量变高，可增加鲜味，在酿造食品和饮料中具有很好的应用空间；同时得到的活性物质消除DPPH自由基的消除率显著提高，可增加在制备抗血压、抗氧化性肽方面具有很好的应用前景，对紫菜的深加工和充分合理利用有很好的发展前景。

附图说明

图1枯草芽孢杆菌固体氨肽酶提取及复合酶解紫菜工艺示意图。

具体实例方式

实施例1

将枯草芽孢杆菌Zj016（【食品与发酵工业】2006年32卷第3期已公开）发酵液在4℃，10000rpm离心10min收集3.5L发酵液，在4℃下加入(NH₄)₂SO₄700 g(边加边搅拌)，4℃，10000rpm离心10min收集澄清液3.6L，选用50kDa的超滤膜进行浓缩到1.4L，流速30~35mL/min；选用30kDa的超滤膜脱盐后1.4L，流速40 mL/min；将浓缩脱盐液冷冻干燥后中得到固体氨肽酶，得到的固态氨肽酶的酶活为7.9×10³ U/g。以2g紫菜粉末为底物，以100mL Tris-HCl缓冲液为介质，中性蛋白酶加入量为E/S=1.6×10⁵U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1.58×10⁴U/g，在50℃水解6h，煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静止12 h后10000rpm，4℃离心20min离心，此时沉淀为紫菜粗多糖，上清液为紫菜多肽混合物。测得水解度为47.51%，DPPH自由基的消除率最高可达75.37%，其中多肽含量为21.47%，该部分对DPPH自由基的消除率为36.19%；多糖含量为23.92%，该部分对DPPH自由基的消除率为20.33%。酶解后酶解液中的游离氨基酸的总含量从45.2772mg/mL提高到93.8475mg/mL。主要呈味氨基酸丙氨酸含量从12.1796 mg/mL提高到27.5561 mg/mL，甘氨酸的含量从0.9597 mg/mL提高到2.4892 mg/mL，天冬氨酸的含量从0.6584 mg/mL提高到4.1911 mg/mL，谷氨酸的含量从0.9303 mg/mL提高到6.0014 mg/mL。

实施例2

将枯草芽孢杆菌Zj016发酵液在4℃，10000rpm离心10min收集2.5L发酵液，在4℃下加入(NH₄)₂SO₄500 g(边加边搅拌)，4℃，10000rpm离心10min收集澄清液2.5L，选用50kDa的超滤膜进行浓缩到0.85L，流速30~35mL/min；选用30kDa的超滤膜脱盐后0.85L，流速40 mL/min，将浓缩脱盐液冷冻干燥后中得到固体氨肽酶。得到的固态氨肽酶的酶活为6.7×10³ U/g。以2g紫菜粉末为底物，以100mL Tris-HCl缓冲液为介质，中性蛋白酶加入量为E/S=1.7×10⁵U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1.32×10⁴U/g，在50℃水解6h，煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静止12 h后10000rpm，4℃离心20min离心，此时沉淀为紫菜粗多糖，上清液为紫菜多肽混合物。测得水解度为39.87%，DPPH自由基的消除率最高可达61.92%，其中多肽含量为14.56%，该部分对DPPH自由基的消除率为31.42%；多糖含量为21.89%，该部分对DPPH自由基的消除率为18.18%。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用，其特征在于

（2）以2g紫菜粉末为底物，以100mL Tris-HCl缓冲液为介质，用中性蛋白酶和固体氨肽酶复配进行酶解，其中中性蛋白酶加入量为E/S=1.6×10⁵-1.7×10⁵U/g，固体氨肽酶加入量为E/S=1.32×10⁴-1.58×10⁴U/g；50℃酶解6h，煮沸灭酶5min，加入体积分数95%的乙醇至体系乙醇体积分数为60%，静止12 h，然后4℃、10000rpm离心20min，此时沉淀为紫菜粗多糖，上清液为紫菜多肽混合物；

所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Zj016。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌固体氨肽酶在紫菜复合酶解中的应用，其特征在于步骤（2）酶解后测得水解度达47.51%，DPPH自由基的消除率达75.37%，其中多肽含量为21.47%，该部分对DPPH自由基的消除率为36.19%；多糖含量为23.92%，该部分对DPPH自由基的消除率为20.33%；酶解后酶解液中的游离氨基酸的总含量从45.2772mg/mL提高到93.8475mg/mL；主要呈味氨基酸丙氨酸含量从12.1796 mg/mL提高到27.5561 mg/mL；甘氨酸的含量从0.9597 mg/mL提高到2.4892 mg/mL；天冬氨酸的含量从0.6584 mg/mL提高到4.1911 mg/mL；谷氨酸的含量从0.9303 mg/mL提高到6.0014 mg/mL。