CN108251487B - 抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，包括如下步骤：(1)制备新疆黑蜂蜂王浆冻干粉；(2)脱脂和制备蜂王浆主蛋白；(3)制备球蛋白及获得醇溶性蛋白制备原料；(4)制备醇溶性蛋白及获得谷蛋白制备原料；(5)制备谷蛋白；(6)制备新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物；(7)分离谷蛋白酶解产物中不同分子量肽段。通过提取新疆黑蜂蜂王浆中谷蛋白，然后进行酶解，得到酶解产物后将其分为不同分子量肽段，采用清除二苯基‑2‑苦肼自由基(DPPH·)的测定方法、抑制亚油酸氧化法测蜂王浆谷蛋白及其酶解产物的抗氧化活性，并测其总抗氧化能力，获得了抗氧化活性最强的小于3kD的肽类物质。

Description

抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法

技术领域

本发明涉及新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白的研究。更具体地，涉及抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法。

背景技术

新疆黑蜂又名伊犁黑蜂，与欧洲黑蜂同属一个品系，是世界四大名蜂之一。适合在新疆生存，但由于数量有限，现已濒临灭绝，被列入保护动物，因此具有较高的经济和科研价值。新疆黑蜂主要分布于新疆伊犁、塔城、阿勒泰、新源、特克斯、尼勒克、昭苏、巩留、伊宁和布尔津等地。其主要原料为海拔1800m-2500m天山深处无污染的鲜花分泌液，主要营养成分为矿物质、有机酸、蛋白质、维生素和酶，有提神醒脑保护肠胃，润肺止咳解酒保肝的功效。

蜂王浆(Royal Jelly)又名蜂皇浆，简称王浆，俗称蜂王乳，是一种乳白色或淡黄色的浆状物，味道酸涩并带有辛辣，略带甜味。根据研究表明，新鲜的蜂王浆的成分相当复杂，其中含有水分60％-70％、糖类10％-16％、蛋白质12％-15％、脂类3％-6％、维生素、游离氨基酸和矿物质等2％-3％。其中蛋白质、糖类为主要成分，蛋白质含量极其丰富，约占蜂王浆干物质的50％。蜂王浆有很多种营养与保健功能，尤其是具有很强的抗氧化能力，其中的蛋白质成分是延缓衰老的关键物质。据研究表明，蜂王浆有可改善患者的多项生理指标，如可进行免疫调节、调节人体血压、降低体内血糖、促进机体细胞增长、还有抗菌、抗炎、抗肿瘤等功效还可有效降低化疗药物sub-chroniccisplatn对肾脏的损伤。

就近几年对蜂王浆中蛋白质的研究趋势来看，已经从其基本的功能探索逐步深入到对其的功能基团和结构的发现与研究。如蜂王浆质量控制研究、化学组分研究、生物学活性研究、以及其应用等。蜂王浆中的抑菌活性早在20世纪60年代便测得，但不确定此抑菌活性是否与其中蛋白质有关。

蜂王浆中的蛋白质和肉类中的完全性蛋白质的不同之处是：不含中性脂肪，不仅含有10种必需氨基酸，还含有12种非必需氨基酸，因此是人类滋补的良好食物。自由基衰老学说认为，人类的衰老是因为人体过多地产生与积累自由基，只有清除这些过多的自由基，健康才能有保障。

长期以来，为了更好地利用蛋白质，许多研究人员致力于蛋白水解物—多肽的研究。蛋白质经蛋白酶适度水解后，不仅可以提高蛋白质的消化率，保持和改进营养价值，而且可改善其溶解性、乳化性、起泡性和持水性等功能特性。此外，蛋白质经酶解后生成的某些低分子肽类物质，不仅能提供人体生长、发育所需的营养物质，而且更易为人体所消化、吸收，同时还具有防病，调节人体生理机能的功效。低分子肽类物质作为一种功能性食品基料，在医药、宇航食品、饮料、运动食品、老年食品及减肥食品等诸多方面获得了广泛的应用。目前，在西欧、日本和美国各国已有商品化多肽类食品上市。我国多肽类食品的研究相对滞后，处于起步阶段。国内研究较多的是大豆蛋白和乳清蛋白，而对蜂王浆蛋白的研究尚无报道。目前对于蜂王浆抗氧化性的研究只局限于对其总体成分的研究和推断，研究方法也比较单一。

发明内容

本发明目的在于提供一种抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备新疆黑蜂蜂王浆冻干粉；

(2)脱脂和制备蜂王浆主蛋白；

(3)制备球蛋白及获得醇溶性蛋白制备原料；

(4)制备醇溶性蛋白及获得谷蛋白制备原料；

(5)制备谷蛋白；

(6)制备新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物；

(7)分离谷蛋白酶解产物中不同分子量肽段。

上述抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，在步骤(1)中新疆黑蜂蜂王浆冻干粉制备方法如下：

取新鲜黑蜂蜂王浆，用分析天平称重后，放入离心管中，然后将放有新鲜黑蜂蜂王浆的离心管置于-75～-85℃冰箱中，待新鲜黑蜂蜂王浆完全冻结后，用真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得新疆黑蜂蜂王浆冻干粉。

上述抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，在步骤(2)中，采用如下方法脱脂：将新疆黑蜂蜂王浆冻干粉用石油醚在温度为3～5℃的条件下、用集热式恒温磁力搅拌器搅拌1～3h，进行脱脂，过滤，弃去滤液得滤渣，再将滤渣用石油醚在同样条件下重复脱脂三次，最后所得到的滤渣即为脱脂蜂王浆；

制备蜂王浆主蛋白的方法如下：将脱脂蜂王浆溶于蒸馏水中浸提、过滤，再将滤渣用蒸馏水在同样条件下重复浸提三次，然后合并滤液，所得滤液为蜂王浆水溶性总蛋白溶液，将蜂王浆水溶性总蛋白溶液用14K透析膜进行透析后，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后即得蜂王浆主蛋白冻干粉；滤渣为球蛋白制备原料。

上述抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，在步骤(2)中，采用一步法脱脂和制备水溶性总蛋白，具体步骤如下：

在蒸馏水中依次加入双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷和N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸，使双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷的浓度为0.3～0.5g/L、N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为0.1～0.2g/L，搅拌，调节溶液的pH为7，即得蜂王浆活化提取液；然后向蜂王浆活化提取液加入新疆黑蜂蜂王浆冻干粉，搅拌活化0.5～1h，再加入石油醚，每升蜂王浆活化提取液加入新疆黑蜂蜂王浆冻干粉4～7g，石油醚与蜂王浆活化提取液的体积比为1:1.5～2；振荡0.5～1h，过滤，滤渣为球蛋白制备原料；滤液静置分层，除去有机相；将水相用14K透析膜进行透析后，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后即得蜂王浆主蛋白冻干粉。

上述抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，在步骤(3)中，采用如下两种方法中的一种制备球蛋白：

第一种方法：在温度为4℃的条件下，将脱脂和制备蜂王浆主蛋白后的滤渣用8～12倍体积的、浓度为1.5～2.5wt％的NaCl溶液溶解，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌1.5～2h，过滤，将滤渣用浓度为1.5～2.5wt％的NaCl溶液在同样条件下重复浸提三次，合并滤液后用透析膜透析，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结后，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后所得干粉即为球蛋白，滤渣为醇溶性蛋白制备原料；

第二种方法：在温度为4℃的条件下，将脱脂和制备蜂王浆主蛋白后的滤渣用8～12倍体积的、NaCl浓度为1.5～2.5wt％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为0.3～0.6wt％、pH＝7的溶液溶解，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌0.5～1h，过滤，将滤液用透析膜透析，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结后，真空冷冻干燥机冷冻干燥后所得干粉即为球蛋白，滤渣为醇溶性蛋白制备原料。

上述抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，在步骤(4)：将醇溶性蛋白制备原料用75wt％乙醇溶液浸提，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌2h，过滤，重复三次，合并滤液，真空干燥除去乙醇及水，冷冻干燥得到醇溶性蛋白，滤渣为谷蛋白制备原料。

上述抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，在步骤(5)中，采用如下两种方法之一提取谷蛋白：

第一种方法：向谷蛋白制备原料中加入0.01mol/L的NaOH溶液浸提，过滤，重复三次，合并滤液，用透析膜透析，保留液冷冻干燥即得谷蛋白；

第二种方法：向0.01mol/L的NaOH溶液中加入N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸的加入量为NaOH物质的量的二分之一，然后再加入谷蛋白制备原料浸提，过滤，将滤液用透析膜透析，保留液冷冻干燥即得谷蛋白。

上述抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，在步骤(6)中，称取0.2500g谷蛋白溶于62.5mL超纯水中后，均分成五份：

第一份用精密酸度计调pH至2.0，加入0.0667g胃蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第二份用精密酸度计调pH至7.5，加入0.0333g胰蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第三份用精密酸度计调pH至8.5，加入0.0333g胰凝蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第四份先用精密酸度计调至pH至2.0，加入0.0667g胃蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，然后再用精密酸度计调pH至7.5，加入0.0333g胰蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h；

第五份先用精密酸度计调pH至2.0，加入0.1000g胃蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，之后用精密酸度计调pH至7.5，再加入0.1000g胰蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，再用精密酸度计将pH调至8.5，最后加入0.1000g胰凝蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h；

酶解结束后将上述五份溶液放置于数显式恒温水浴锅中沸水浴15min，使酶失活；分别用离心机离心，离心力为12000xg，在4℃下离心10min后得到酶解产物：第一份离心后得到酶解产物命名为胃蛋白酶酶解产物、第二份离心后得到酶解产物命名为胰蛋白酶酶解产物、第三份离心后得到酶解产物命名为胰凝蛋白酶酶解产物、第四份离心后得到酶解产物命名为胃+胰蛋白酶酶解产物、第五份离心后得到酶解产物命名为胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物；

将上述得到的酶解产物胃蛋白酶酶解产物、胰蛋白酶酶解产物、胰凝蛋白酶酶解产物、胃+胰蛋白酶酶解产物和胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物，用截留分子量为10kD和3kD的超滤管或截留分子量为10kD和3kD的蜂王浆酶解产物超滤装置进行超滤分离得到大于10kD的肽段、3kD-10kD的肽段、以及小于3kD的肽段。

本发明的有益效果如下：

本发明中最佳实验条下所提取谷蛋白占蜂王浆干重的19.2％，与理论值19.88±0.35非常接近。新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白具有一定的抗氧化作用，但是酶解后的产物抗氧化活性大大提升。实验结果表明，五种酶解产物中对DPPH·的清除能力最好的为胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝蛋白酶共同作用的，其次为胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用的，最不稳定的是胃蛋白酶酶解的产物。将酶解产物经过超滤分离为三个肽段后发现，抗氧化活性最强的是小于3kD的肽类物质，其次是3-10kD的肽类物质，大于10kD肽类的抗氧化活性很弱。四种蛋白酶酶解产物抑制亚油酸氧化能力和总抗氧化能力大小顺序是：胃+胰蛋白酶酶解产物＞胰凝蛋白酶酶解产物＞胰蛋白酶酶解产物＞胃蛋白酶酶解产物。超滤分离得到的肽段中，抑制亚油酸能力和总抗氧化氧化能力大小顺序为：3kD以下肽段的酶解产物＞3-10kD肽段的酶解产物＞10kD以上肽段的酶解产物。由此可知，蜂王浆谷蛋白中起主要抗氧化作用的是三种蛋白酶共同酶解且分子量小于3kD的肽类物质。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1不同酶解产物对应的不同浓度底物的消除率；

图2不同酶解产物不同肽段对应的不同浓度底物的消除率；

图3谷蛋白酶解产物及各自不同肽段总抗氧化能力；

图4为谷蛋白批量酶解用实验装置的结构示意图；

图5为谷蛋白批量酶解用实验装置的一级酶解管路的翅片管部分的结构示意图。

图4和图5中：1-1-谷蛋白存放容器；1-2-酶解用蛋白酶存放容器；1-3-壳体；1-4-一级混合容器；1-5-一级酶解管路；1-6-一级酶解容器；1-7-二级混合容器；1-8-二级酶解管路；1-9-二级酶解容器；1-10-混合用搅拌桨；1-11-酶解用搅拌桨；1-12-混合用电机；1-13-酶解用电机；1-14-微型泵；1-15-温度传感器；1-16-供热装置；1-17-谷蛋白酶解产物存放容器；1-18-扰流片。

图6为谷蛋白酶解产物批量超滤装置的结构示意图；

图7为谷蛋白酶解产物批量超滤装置的混流管的结构示意图。

图6和图7中，1-酶解产物存放容器；2-第一供液泵；3-第一中空纤维超滤膜组件；4-第一透出液存储容器；5-第一浓缩液稀释容器；6-第一卷式超滤膜组件；7-第一限流阀；8-第二供液泵；9-第一蒸馏水供给装置；10-第一混流管；11-扰流片；12-第三供液泵；13-第二中空纤维超滤膜组件；14-第二透出液存储容器；15-第二浓缩液稀释容器；16-第二卷式超滤膜组件；17-第二限流阀；18-第四供液泵；19-第二蒸馏水供给装置；20-第二混流管；22-大于10kD肽段存放容器；23-3kD-10kD的肽段存放容器。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

1材料与方法

1.1材料与试剂

材料：新疆黑蜂蜂王浆。

试剂：石油醚；NaCl；75wt％乙醇(AR)；NaOH(AR)；二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·自由基)；85wt％的磷酸；牛血清白蛋白(结晶)；甲醛(天津致远化学试剂有限公司)；胰蛋白酶(盖德化工东京合成工业株式会社)；胃蛋白酶(盖德化工东京合成工业株式会社)；胰凝蛋白酶(盖德化工东京合成工业株式会社)；铁氰化铁；三氯化铁；无水氯化铁(山东西亚化学工业有限公司)；考马斯亮蓝G―250(Sigma公司)；亚油酸；总抗氧化试剂(北京索莱宝科技有限公司)；磷酸缓冲液(山东西亚股份有限公司)；硫氰酸铵等。

1.2实验仪器

离心管；超滤管或酶解产物超滤装置(自制)；烧杯；试管；试管架；移液管；14K透析膜；FD-1A-50真空冷冻干燥机(杭州聚同电子有限公司)；HJ8集热式恒温磁力搅拌器(广州沪瑞明仪器有限公司)；FA1004B电子天平(郑州宝晶电子科技有限公司)；TD5Z高速冷冻离心机(上海赵迪生物科有限公司)；HH.S21-4数显式恒温水浴锅(邢台润联机械设备有限公司)；SHA-B恒温振荡器(江苏省金坛市友联仪器研究所)或谷蛋白批量酶解用实验装置(自制)；D-9143B-1电热恒温鼓风干燥箱(汇尔仪器)；TGL-16G高速台式离心机(北京市平建实验室设备有限公司)；KQ-100B超声波清洗器(上海市超声仪器有限公司)；UV2400分光光度计(舜宇恒平)；pHS-3C精密pH调节计(上海虹益仪器仪表厂有限公司)。

2实验方法

2.1.新疆黑蜂蜂王浆中谷蛋白的制备；

首先取新鲜黑蜂蜂王浆，用分析天平称重后，置于-80℃冰箱中，待新鲜黑蜂蜂王浆完全冻结后，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后，得到干粉。

脱脂：所得干粉用石油醚在温度为4℃的条件下、用集热式恒温磁力搅拌器搅拌2h，进行脱脂，过滤，弃去滤液得滤渣，再将滤渣用石油醚在同样条件下重复脱脂三次，最后所得到的滤渣即为脱脂蜂王浆。

制备水溶性总蛋白及获得球蛋白制备原料：将所得的脱脂蜂王浆溶于蒸馏水中浸提，过滤，再将滤渣用蒸馏水在同样条件下重复浸提三次，然后合并滤液，所得滤液为蜂王浆水溶性总蛋白溶液；滤渣为球蛋白制备原料。

为了简化脱脂、制备水溶性总蛋白及获得球蛋白制备原料的流程及工序，提高水溶性总蛋白的产率，减少杂质对后续制备球蛋白的影响，本发明提供如下一步法脱脂和制备水溶性总蛋白及获得球蛋白制备原料：在蒸馏水中依次加入双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷和N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸，使双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷的浓度为0.3g/L、N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为0.1g/L，搅拌，调节溶液的pH为7，即得蜂王浆活化提取液；然后向蜂王浆活化提取液加入新疆黑蜂蜂王浆冻干粉，搅拌活化0.5h，再加入石油醚，每升蜂王浆活化提取液加入新疆黑蜂蜂王浆冻干粉6g，石油醚与蜂王浆活化提取液的体积比为1:1.5；振荡0.5h，过滤，滤渣为球蛋白制备原料；滤液静置分层，除去有机相，水相即为蜂王浆水溶性总蛋白溶液。一步法脱脂和制备水溶性总蛋白及获得球蛋白制备原料具有如下技术优点：(1)减少了脱脂操作的次数：加入石油醚之后只需要一次就可以实现蜂王浆完全脱脂，将所得滤渣再次用石油醚浸提，使用液相色谱也未能在石油醚中检测到脂类物质，这说明已经将干粉彻底脱脂；而简单使用石油醚脱脂，脱脂五次之后，将所得滤渣再次用石油醚浸提依旧能够在石油醚中检测到脂类物质。(2)减少了制备水溶性总蛋白时的浸提次数：将水提和醚提合二为一，不仅简化了实验步骤，而且经过一次提取之后，再次用蒸馏水浸提滤渣，滤液中已经检测不到蛋白质(具体检测方法参见GB9697-2008)，这说明水溶性蛋白的提取非常彻底；如果单纯使用蒸馏水提取，至少需要进行六次以上的提取，才能实现滤液中检测不到蛋白质。

将蜂王浆水溶性总蛋白溶液用孔径为14K的透析膜进行透析，将保留液放入-80℃冰箱中，待其完全冻结后，用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，所得干粉即为蜂王浆主蛋白；将蜂王浆水溶性总蛋白溶液放入-80℃冰箱中，待其完全冻结后，用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，所得水溶性总蛋白冻干粉溶于超纯水中，配制成水溶性总蛋白浓度为6.0mg/mL的蜂王浆水溶性总蛋白溶液，在100℃下用恒温水浴锅加热10min，再用离心机离心，去除蜂王浆主蛋白，取上层清液放入-80℃冰箱中冻结后，用真空冷冻干燥机冻干，得到其它水溶性蛋白。

在温度为4℃的条件下，将球蛋白制备原料用10倍体积的浓度为2wt％的NaCl溶液溶解，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌2h，过滤，将滤渣用浓度为2wt％的NaCl溶液在同样条件下重复浸提三次，合并滤液后用透析膜透析，保留液放入-80℃冰箱中冻结后，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后所得干粉即为球蛋白，滤渣为醇溶性蛋白制备原料。

为了提高球蛋白的提取效率，简化提取步骤，使用10倍体积的、NaCl浓度为2wt％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为0.4wt％、pH＝7的溶液溶解球蛋白制备原料，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌2h，过滤，将滤液用透析膜透析，将保留液放入-80℃冰箱中冻结后，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后所得干粉即为球蛋白(相比只用浓度为2wt％NaCl重复提取，干粉中蛋白质纯度提高了10％)，滤渣为醇溶性蛋白制备原料。用浓度为2wt％的NaCl溶液再次对滤渣进行提取，使用现有技术中的考马斯亮蓝染色法测滤液中球蛋白含量，已经检测不到球蛋白，球蛋白提取率接近100％。而单纯使用浓度为2wt％的NaCl溶液重复提取三次之后，再次浸提滤渣，使用现有技术中的考马斯亮蓝染色法测滤液中球蛋白含量，依旧能够检测到球蛋白，重复提取10次之后才无法检测到。

将醇溶性蛋白制备原料用75wt％乙醇溶液浸提，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌2h，过滤，重复三次，合并滤液，真空干燥除去乙醇及水，冷冻干燥得到醇溶性蛋白，滤渣为谷蛋白制备原料。

采用如下两种方法之一提取谷蛋白：

第一种方法：向谷蛋白制备原料中加入0.01mol/L的NaOH溶液浸提，过滤，重复三次，合并滤液，用透析膜透析，保留液冷冻干燥即得谷蛋白；

第二种方法：向0.01mol/L的NaOH溶液中加入N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸的加入量为NaOH物质的量的二分之一，然后再加入谷蛋白制备原料浸提，过滤，将滤液用透析膜透析，保留液冷冻干燥即得谷蛋白。相比只用浓度为0.01mol/L的NaOH溶液重复提取，干粉中蛋白质纯度提高了13.7％。用浓度为0.01mol/L的NaOH溶液再次对滤渣进行提取，使用现有技术中的考马斯亮蓝染色法测滤液中谷蛋白含量，已经检测不到谷蛋白，谷蛋白提取率接近100％。而单纯使用浓度为0.01mol/L的NaOH溶液重复提取三次之后，再次浸提滤渣，使用现有技术中的考马斯亮蓝染色法测滤液中谷蛋白含量，依旧能够检测到谷蛋白，重复提取八次之后才无法检测到。

2.2.新疆黑蜂蜂王浆中谷蛋白酶解产物的制备；

称取0.2500g谷蛋白溶于62.5mL超纯水中后，均分成五份：

第一份用精密酸度计调pH至2.0，加入0.0667g胃蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第二份用精密酸度计调pH至7.5，加入0.0333g胰蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第三份用精密酸度计调pH至8.5，加入0.0333g胰凝蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第四份先用精密酸度计调至pH至2.0，加入0.0667g胃蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，然后再用精密酸度计调pH至7.5，加入0.0333g胰蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h；

第五份先用精密酸度计调pH至2.0，加入0.1000g胃蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，之后用精密酸度计调pH至7.5，再加入0.1000g胰蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，再用精密酸度计将pH调至8.5，最后加入0.1000g胰凝蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h；

酶解结束后将上述五份溶液放置于数显式恒温水浴锅中沸水浴15min，使酶失活；分别用离心机离心，离心力为12000xg，在4℃下离心10min后得到酶解产物：第一份离心后得到酶解产物命名为胃蛋白酶酶解产物、第二份离心后得到酶解产物命名为胰蛋白酶酶解产物、第三份离心后得到酶解产物命名为胰凝蛋白酶酶解产物、第四份离心后得到酶解产物命名为胃+胰蛋白酶酶解产物、第五份离心后得到酶解产物命名为胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物。

如图4和图5所示，谷蛋白批量酶解用实验装置包括谷蛋白存放容器1-1、谷蛋白酶解容器、微型泵1-14、酶解用蛋白酶存放容器1-2和谷蛋白酶解产物存放容器1-17，所述谷蛋白酶解容器包括壳体1-3、一级混合容器1-4、一级酶解管路1-5、一级酶解容器1-6、二级混合容器1-7、二级酶解管路1-8和二级酶解容器1-9，所述壳体1-3内设有保温腔，所述一级混合容器1-4、所述一级酶解管路1-5、所述一级酶解容器1-6、所述二级混合容器1-7、所述二级酶解管路1-8和所述二级酶解容器1-9分别设置在所述保温腔内；所述谷蛋白存放容器1-1的出液端和所述酶解用蛋白酶存放容器1-2的出液端分别与所述一级混合容器1-4的进液端流体导通连接，所述一级混合容器1-4的出液端与所述一级酶解容器1-6的进液端通过所述一级酶解管路1-5流体导通连接，所述一级酶解容器1-6的出液端与所述微型泵1-14的进液端流体导通连接，所述微型泵1-14的出液端与所述二级混合容器1-7的进液端流体导通连接，所述二级混合容器1-7的出液端与所述二级酶解容器1-9的进液端流体导通连接，所述二级酶解容器1-9的出液端与所述谷蛋白酶解产物存放容器1-17流体导通连接；所述一级酶解管路1-5和所述二级酶解管路1-8均为内壁上设有扰流片1-18的翅片管管路；所述保温腔的高温媒介进口与供热装置1-16的高温媒介出口流体导通连接。所述一级酶解管路1-5和所述二级酶解管路1-8均为螺旋管路，高温媒介为热空气。为了提高谷蛋白、蛋白酶以及水在所述一级混合容器1-4内和所述二级混合容器1-7内的混合均匀度，在所述一级混合容器1-4内和所述二级混合容器1-7内设置有混合用搅拌桨1-10，所述混合用搅拌桨1-10与混合用电机1-12的输出轴传动连接，同时为了提高谷蛋白酶解反应的均匀度，还在所述一级酶解容器1-6内和所述二级酶解容器1-9内均设有酶解用搅拌桨1-11，所述酶解用搅拌桨1-11与酶解用电机1-13的输出轴传动连接。鉴于蛋白酶在外界因素影响下会发生失活，因此在酶解反应进行过程中部需要对酶解反应体系补充蛋白酶，也可以将原本一次性添加的蛋白酶量分两次加入，因此将所述酶解用蛋白酶存放容器1-2的出液端与所述二级混合容器1-7的进液端流体导通连接。而且鉴于酶的活性与反应体系的温度有一定的关系，为了避免局部温度过高或者局部温度过低，在所述一级酶解管路1-5上设有三个温度传感器1-15，在所述一级酶解管路1-5上，第一个温度传感器1-15设置在所述一级酶解管路1-5的进液口，第二个温度传感器1-15设置在所述一级酶解管路1-5终端的管内，第三个温度传感器1-15设置在所述一级酶解管路1-5的出液口，并在所述二级酶解管路1-8上设有三个温度传感器1-15，在所述二级酶解管路1-8上，第一个温度传感器1-15设置在所述二级酶解管路1-8的进液口，第二个温度传感器1-15设置在所述二级酶解管路1-8终端的管内，第三个温度传感器1-15设置在所述二级酶解管路1-8的出液口，同时在所述保温腔内设有温度传感器1-15。进行谷蛋白酶解反应时，将所述谷蛋白存放容器1-1的谷蛋白加入所述一级混合容器1-4内，并将所述酶解用蛋白酶存放容器1-2内的一部分蛋白酶加入到所述一级混合容器1-4内，并在所述一级混合容器1-4内的所述混合用搅拌桨1-10的作用下进行混合，初步混合后的谷蛋白、蛋白酶以及酶解反应用的蒸馏水沿所述一级酶解管路1-5向所述一级酶解容器1-6流动，在流动过程中，混合溶液在所述扰流片1-18的扰流作用下发生进一步的混合，同时谷蛋白在蛋白酶的催化作用下进行初步酶解，进行初步酶解的混合溶液流入所述一级酶解容器1-6内后，待混合溶液在所述一级酶解容器1-6内的所述酶解用搅拌桨1-11搅拌作用下在所述一级酶解容器1-6内反应一段时间后，再利用所述微型泵1-14将混合溶液泵入所述二级混合容器1-7内，同时将所述酶解用蛋白酶存放容器1-2内的一部分蛋白酶加入所述二级混合容器1-7内，然后在所述二级混合容器1-7内的所述混合用搅拌桨1-10的作用下进行混合，混合后的溶液沿所述二级酶解管路1-8向所述二级酶解容器1-9流动，在流动过程中，混合溶液在所述扰流片1-18的扰流作用下发生进一步的混合，同时混合溶液中的谷蛋白会在蛋白酶的催化作用下进行进一步的酶解反应，混合溶液流入所述二级酶解容器1-9后，在所述二级酶解容器1-9中的所述酶解用搅拌桨1-11搅拌作用下，混合溶液中的谷蛋白继续进行酶解反应，待反应一段时间之后就可以反应溶液排入所述谷蛋白酶解产物存放容器1-17内保存。利用所述一级酶解管路1-5和所述二级酶解管路1-8不仅可以提高混合溶液的混合程度以及蛋白酶在混合溶液中分布的均匀度，还可以延长酶解反应路径，同时还便于对反应溶液进行加热以及保温，从而可以使在相同时的反应时间内谷蛋白的酶解程度得到有效提高。

2.3.谷蛋白酶解产物中不同分子量肽段的制备；

将步骤2.2中得到的酶解产物胃蛋白酶酶解产物、胰蛋白酶酶解产物、胰凝蛋白酶酶解产物、胃+胰蛋白酶酶解产物和胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物，分别用截留分子量为10kD和3kD的超滤管或截留分子量为10kD和3kD的谷蛋白酶解产物超滤装置进行超滤分离得到大于10kD的肽段、3kD-10kD的肽段、以及小于3kD的肽段。

如图6和图7所示，谷蛋白酶解产物批量超滤装置包括大于10kD的肽段分离系统和3kD-10kD的肽段分离系统，大于10kD的肽段分离系统包括球蛋白酶解产物存放容器1、第一供液泵2、第一中空纤维超滤膜组件3、第一浓缩液稀释容器5、第二供液泵8、第一卷式超滤膜组件6和第一透出液存储容器4，所述球蛋白酶解产物存放容器1的出液端与所述第一供液泵2的进液端流体导通连接，所述第一供液泵2的出液端与所述第一中空纤维超滤膜组件3的进液端流体导通连接，所述第一中空纤维超滤膜组件3的浓缩液出液端与所述第一浓缩液稀释容器5的进液端流体导通连接，所述第一浓缩液稀释容器5的出液端与所述第二供液泵8的进液端流体导通连接，所述第二供液泵8的出液端与所述第一卷式超滤膜组件6的进液端流体导通连接，所述第一卷式超滤膜组件6的透出液出液端与所述第一供液泵2的进液端流体导通连接；所述第一中空纤维超滤膜组件3的透出液出液端与所述第一透出液存储容器4的进液端流体导通连接；所述第一卷式超滤膜组件6的浓缩液出液端与大于10kD肽段存放容器22的进液端流体导通连接。其中，为了避免所述第一供液泵2向所述第一中空纤维超滤膜组件3内泵入液体时对所述第一卷式超滤膜组件6内超滤体系产生较大的影响，在所述第一卷式超滤膜组件6的透出液出液端设置有第一限流阀7，通过所述第一限流阀7限制由所述第一卷式超滤膜组件6的透出液出液端流向所述第一供液泵2进液端的流量。而为了提高从所述第一中空纤维超滤膜组件3的浓缩液流出端流出的浓缩液与蒸馏水混合均匀度，将所述第一中空纤维超滤膜组件3的浓缩液出液端与所述第一浓缩液稀释容器5的进液端通过第一混流管10流体导通连接，所述第一混流管10为内壁上设有扰流片11的导流管，所述第一混流管10的进液端与第一蒸馏水供给装置9的出液端流体导通连接，并且所述第一浓缩液稀释容器5中设有搅拌桨，所述搅拌桨与搅拌电机的输出轴传动连接。使用时，启动所述第一供液泵2将球蛋白酶解产物泵入所述第一中空纤维超滤膜组件3内，在所述第一中空纤维超滤膜组件3的分离作用下，球蛋白酶解产物分成透出液和浓缩液，透出液经过管路流入所述第一透出液存储容器4存放，浓缩液则经由所述第一混流管10流入所述第一浓缩液稀释容器5内，浓缩液流经所述第一混流管10时，在所述扰流片11的扰流作用下与所述第一蒸馏水供给装置9流出的蒸馏水混合，流入所述第一浓缩液稀释容器5内之后，浓缩液和蒸馏水会在所述搅拌桨的搅拌作用下进行充分混合，从而使浓缩液中的水溶性物质充分地溶入水中，经过稀释的浓缩液经由所述第二供液泵8泵入所述第一卷式超滤膜组件6中，并由所述第一卷式超滤膜组件6进行分离，经由所述第一卷式超滤膜组件6进行分离得到的浓缩液直接排入大于10kD肽段存放容器22内，而由所述第一卷式超滤膜组件6进行分离得到的透出液则由所述第一供液泵2泵入所述第一中空纤维超滤膜组件3内进行再次分离。所述第一卷式超滤膜组件6对稀释后的浓缩液进行二次分离，并将由所述第一卷式超滤膜组件6分离得到的透出液进行再次分离，从而可以将球蛋白酶解产物中水溶性物质尽可能快速地分离出来，以便为对球蛋白酶解产物进行多组的特性及生理功能测试提供样品。

3kD-10kD的肽段分离系统包括第三供液泵12、第二中空纤维超滤膜组件13、第二浓缩液稀释容器15、第四供液泵18、第二卷式超滤膜组件16和第二透出液存储容器14，所述第一透出液存储容器4的出液端与所述第二供液泵12的进液端流体导通连接，所述第二供液泵12的出液端与所述第二中空纤维超滤膜组件13的进液端流体导通连接，所述第二中空纤维超滤膜组件13的浓缩液出液端与所述第二浓缩液稀释容器15的进液端流体导通连接，所述第二浓缩液稀释容器15的出液端与所述第四供液泵18的进液端流体导通连接，所述第四供液泵18的出液端与所述第二卷式超滤膜组件16的进液端流体导通连接，所述第二卷式超滤膜组件16的透出液出液端与所述第二供液泵12的进液端流体导通连接；所述第二中空纤维超滤膜组件13的透出液出液端与所述第二透出液存储容器14的进液端流体导通连接；所述第二卷式超滤膜组件16的浓缩液出液端与3kD-10kD的肽段存放容器23的进液端流体导通连接。其中，为了避免所述第三供液泵12向所述第二中空纤维超滤膜组件13内泵入液体时对所述第二卷式超滤膜组件16内超滤体系产生较大的影响，在所述第二卷式超滤膜组件16的透出液出液端设置有第二限流阀17，通过所述第二限流阀17限制由所述第二卷式超滤膜组件16的透出液出液端流向所述第三供液泵12进液端的流量。而为了提高从所述第二中空纤维超滤膜组件13的浓缩液流出端流出的浓缩液与蒸馏水混合均匀度，将所述第二中空纤维超滤膜组件13的浓缩液出液端与所述第二浓缩液稀释容器15的进液端通过第二混流管20流体导通连接，所述第二混流管20为内壁上设有扰流片11的导流管，所述第二混流管20的进液端与第二蒸馏水供给装置19的出液端流体导通连接，并且所述第二浓缩液稀释容器15中设有搅拌桨，所述搅拌桨与搅拌电机的输出轴传动连接。使用时，启动所述第三供液泵12将球蛋白酶解产物泵入所述第二中空纤维超滤膜组件13内，在所述第二中空纤维超滤膜组件13的分离作用下，球蛋白酶解产物分成透出液和浓缩液，透出液经过管路流入所述第二透出液存储容器14存放(即为小于3kD的肽段)，浓缩液则经由所述第二混流管20流入所述第二浓缩液稀释容器15内，浓缩液流经所述第二混流管20时，在所述扰流片11的扰流作用下与所述第二蒸馏水供给装置19流出的蒸馏水混合，流入所述第二浓缩液稀释容器15内之后，浓缩液和蒸馏水会在所述搅拌桨的搅拌作用下进行充分混合，从而使浓缩液中的水溶性物质充分地溶入水中，经过稀释的浓缩液经由所述第四供液泵18泵入所述第二卷式超滤膜组件16中，并由所述第二卷式超滤膜组件16进行分离，经由所述第二卷式超滤膜组件16进行分离得到的浓缩液直接排入3kD-10kD的肽段存放容器23内，而由所述第二卷式超滤膜组件16进行分离得到的透出液则由所述第三供液泵12泵入所述第二中空纤维超滤膜组件13内进行再次分离。所述第二卷式超滤膜组件16对稀释后的浓缩液进行二次分离，并将由所述第二卷式超滤膜组件16分离得到的透出液进行再次分离，从而可以将球蛋白酶解产物中水溶性物质尽可能快速地分离出来，以便为对球蛋白酶解产物进行多组的特性及生理功能测试提供样品。

大于10kD的肽段分离系统和3kD-10kD的肽段分离系统均采用双超滤膜组件对谷蛋白酶解产物进行分离提取，不仅可以进一步降低浓缩液中水溶性物质的含量，而且还可以提高谷蛋白酶解产物分离的效率，缩短为研究谷蛋白酶解产物特性及生理功能提供样品的时间，从而满足同时多组实验的样品需求。

2.4清除DPPH·法测谷蛋白酶解物抗氧化活性(参照现有技术中的测试方法)

二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·自由基)清除能力测定：二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·自由基)是被经常使用的一种自由基，将其溶于乙醇后呈深紫色并且极其稳定，其孤电子对在516nm-518nm附近有强吸收。当加入清除DPPH·自由基的物质时，1,1’-苯基-苦肼基自由基(DPPH·自由基)的孤电子对得到配对，吸光度也跟着减弱或消失，深紫色变成浅紫色，它的褪色程度和它接受的电子对数量保持一定的比例关系，使它在最大波长处的吸光度数值减少。通过测量溶液吸光度的数值变化来判断谷蛋白酶解物对1,1’-苯基-苦肼基自由基(DPPH·自由基)的清除能力。

无水乙醇溶解1,1-苯基-苦肼基自由基(DPPH·自由基)使其浓度为0.2mmol/L，将待测样品按一定稀释梯度用超纯水进行稀释配制成待测样品溶液，取待测样品溶液2mL与2mL的浓度为0.2mmol/L的DPPH·自由基乙醇溶液混匀，以溶剂为对照，在517nm处测其吸光度(Ai)；取待测样品溶液2mL，加入2mL无水乙醇充分混匀，测定在517nm处的吸光度(Aj)；测定空白对照溶液(2mL超纯水与2mL的浓度为0.2mmol/L的DPPH·自由基乙醇溶液的混合溶液)的517nm出的吸光度(Ac)。

DPPH抑制率(％)＝{1-[(Ai)-(Aj)]/Ac]}×100％；

Ai：以溶剂为对照物时样品在517nm处的吸光度；

Aj：待测样品在517nm处的吸光度；

Ac：空白对照在517nm处的吸光度。

2.5抑制亚油酸氧化法测抗氧化活性(参照现有技术中的测试方法)

取配制好的浓度为0.01mg/mL的黑蜂王浆谷蛋白各组分待测样品各1mL，分别加入1mL体积浓度为2.50％(V/V)的亚油酸无水乙醇溶液，再加入2mL浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)和1mL无水乙醇，密闭后放在暗处并保持37℃恒温保存。空白组不加抗氧化剂，其它步骤同上。

取0.5mL上述混合液，加入5.00mL体积浓度为75％的乙醇溶液和0.5mL质量分数为30％的NH₄SCN，再加入0.5mL浓度为0.02mol/L的FeCl₂盐酸溶液(FeCl₂盐酸溶液的配制方法为：将FeCl₂加入到质量分数为3.5％的盐酸中，使得FeCl₂的浓度为0.02mol/L)，反应3min后，测其在500nm处的吸光度，之后每隔24h测定一次。

2.6总抗氧化能力测定方法(参照现有技术中的测试方法)

配制0.01mg/mL黑蜂王浆谷蛋白各组分试样，按照T-AOC试剂盒说明进行操作，在520nm处测吸光度。试验重复3次，取其平均值。本实验以样品管与对照管在520nm处的吸光度的差值大小来反应其总抗氧化能力，差值越大，总抗氧化能力越强。

2.7考马斯亮蓝染色法测谷蛋白含量(参照现有技术中的测试方法)

绘制标准曲线：

配制浓度为20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL和100μg/mL的牛血清白蛋白标准溶液，与考马斯亮蓝G―250反应，以吸光度A₅₉₅nm作为纵坐标，以标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线，求得标准曲线方程(R²＝0.9997)。

未知样品蛋白质浓度测定：

测定方法同上，将所得谷蛋白配制成溶液，根据所测定的595nm的Ai，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(μg/mL)。

2.8水解度的测定(参照现有技术中的测试方法)

采用甲醛滴定法测定水解度，甲醛滴定法是根据-NH₃ ⁺和甲醛结合形成–NH-CH₂OH、-N-(CH₂OH)₂等羟甲基衍生物，从而使-NH₃ ⁺上的H⁺释放出来，这样用碱滴定游离出来的H⁺，从而可以计算水解度。

3结果分析

3.1DPPH·清除法测抗氧化能力结果与分析

采用消除DPPH·自由基法，观察谷蛋白被不同蛋白酶酶解后，对底物消除能力的强弱，来判断该物质抗氧化能力的大小。

由图1可知，新疆黑蜂蜂王浆中谷蛋白具有一定的抗氧化作用，但是在加入不同蛋白酶后，抗氧化能力有所增强。通过对其酶解后酶解产物的研究发现：随着蛋白质浓度的增加，酶的抗氧化能力增强，其对应的底物的消除率也相应增强；同时我们也发现，加入的酶种类的也会影响其消除率通过图示我们得知：加入胃+胰+胰凝蛋白酶三种蛋白酶的影响最大，消除能力最强，而加入胃蛋白酶的消除能力在上面几种酶解中最弱。故这几种蛋白酶对DPPH·消除能力大小为：胃+胰+胰凝蛋白酶>胃+胰蛋白酶>胰凝蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶。

由图2可知：当所有酶解产物浓度均稀释至0.01mg/mL时，其中蜂王浆中谷蛋白的各超滤肽段对DPPH·自由基清除能力随着蜂王浆蛋白分子量的增大而不断减弱。三种谷蛋白酶解物超滤分离出的三个肽段中对DPPH·自由基清除能力最强的为小于3kD的，其次为3-10kD的，最弱的为大于10kD的。说明了蜂王浆的多肽分子各超滤组分对DPPH·自由基清除能力从大到小的顺序为:分子量小于3kD的肽段＞分子量3～10kD的肽段＞分子量大于10kD的肽段。综合可知：经上面几种蛋白酶酶解后，胃+胰+胰凝蛋白酶酶解后的分子量小于3kD的黑蜂蜂王浆谷蛋白的肽段对DPPH·自由基清除能力最好。

3.2抑制亚油酸氧化法测抗氧化活性结果与分析

由表1可知，蜂王浆谷蛋白的酶解产物对亚油酸具有一定的抗氧化作用；与空白对照相比，相同浓度的酶解产物中，除谷蛋白外，其余样品均对亚油酸的氧化有一定的抑制作用，胃蛋白酶和胰蛋白酶共同酶解后的蛋白质随着时间的推移，抑制作用最强，而胃蛋白酶酶解的产物抑制作用最弱；酶解产物抗亚油酸氧化作用的强弱顺序为：胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用的酶解产物＞胰凝蛋白酶的酶解产物＞胰蛋白酶的酶解产物＞胃蛋白酶的酶解产物，这和上面清除DPPH·的强弱顺序一致。同时从实验所得数据来判断，不同肽段的酶解产物对亚油酸氧化的抑制效果不同，分子量越小的肽段抑制效果越明显。所以总体来说，分子量<3kD的蜂王浆谷蛋白肽段抑制亚油酸抗氧化的能力最强。但是我们也看出谷蛋白不但对亚油酸的氧化没有抑制作用，反而起着催化亚油酸氧化的作用，原因是谷蛋白中大量分子与酒精发生反应，使蛋白质变性，引起它在500nm处的吸光度增大，故为使其对亚油酸有抑制作用，我们应对蛋白质进行酶解，最好是使用小分子肽段。

表1：加入蜂王浆谷蛋白酶解产物的亚油酸-NH₄SCN-FeCl₂后反应体系吸

光度随时间的变化

3.3总抗氧化能力的测定的结果与分析

对总抗氧化能力的测定是利用抗氧化物质能使Fe³⁺还原成Fe²⁺，Fe²⁺可与菲林类物质形成稳定的络合物的性质，通过比色法可以测定样品抗氧化能力的强弱。测定管与对照管吸光度差值越大，抗氧化能力越强。考察各蜂王浆提取物在相同浓度下的总抗氧化能力，结果如图3。

由图3可知，在浓度均为0.01mg/mL的酶解产物，其ΔA520差值越大，总抗氧化能力越强。故总抗氧化能力的强弱顺序为：胃蛋白酶+胰蛋白酶作用的酶解产物＞胰凝蛋白酶酶解的酶解产物＞胰蛋白酶酶解的酶解产物＞胃蛋白酶酶解的酶解产物。同时将每一种酶解产物进行超滤，得到三个肽段的抗氧化能力也有所不同，分子量>10kD肽段总抗氧化能力最弱，比未进行分级的总抗氧化能力还弱，但是分子量<3kD肽段总氧化能力最强。综上所述，分子量小的肽段总抗氧化能力最强，具有很大的研究意义。

3.4蛋白质含量测定结果与分析

经过对提取到的谷蛋白进行测定，谷蛋白占总可溶性蛋白的量与理论值22.9％非常接近。

3.5水解度测定结果与分析

从表2所测数据可知谷蛋白中加入不同蛋白酶酶解后，其酶解产物的水解度分别为6.02％、8.53％、8.61％、8.75％、9.14％，测量结果显示，胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物的水解度最好，胰蛋白酶酶解产物的水解度最差。

表2：不同酶水解谷蛋白水解物的DH值

4结论

综合上，本实施例中最佳实验条下所提取谷蛋白占蜂王浆干重的19.2％，与理论值19.88±0.35非常接近。新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白具有一定的抗氧化作用，但是酶解后的产物抗氧化活性大大提升。实验结果表明，五种酶解产物中对DPPH·的清除能力最好的为胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝蛋白酶共同作用的，其次为胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用的，最不稳定的是胃蛋白酶酶解的产物。将酶解产物经过超滤分离为三个肽段后发现，抗氧化活性最强的是小于3kD的肽类物质，其次是3-10kD的肽类物质，大于10kD肽类的抗氧化活性很弱。四种蛋白酶酶解产物抑制亚油酸氧化能力和总抗氧化能力大小顺序是：胃+胰蛋白酶酶解产物＞胰凝蛋白酶酶解产物＞胰蛋白酶酶解产物＞胃蛋白酶酶解产物。超滤分离得到的肽段中，抑制亚油酸能力和总抗氧化氧化能力大小顺序为：3kD以下肽段的酶解产物＞3-10kD肽段的酶解产物＞10kD以上肽段的酶解产物。由此可知，蜂王浆谷蛋白中起主要抗氧化作用的是三种蛋白酶共同酶解且分子量小于3kD的肽类物质。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (3)

1.抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)制备新疆黑蜂蜂王浆冻干粉；在步骤(1)中新疆黑蜂蜂王浆冻干粉制备方法如下：

取新鲜黑蜂蜂王浆，用分析天平称重后，放入离心管中，然后将放有新鲜黑蜂蜂王浆的离心管置于-75～-85℃冰箱中，待新鲜黑蜂蜂王浆完全冻结后，用真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得新疆黑蜂蜂王浆冻干粉；

(2)脱脂和制备蜂王浆主蛋白；在步骤(2)中，采用一步法脱脂和制备水溶性总蛋白，具体步骤如下：

在蒸馏水中依次加入双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷和N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸，使双(2-羟乙基)氨基(三羟甲基)甲烷的浓度为0.3～0.5g/L、N,N-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸的浓度为0.1～0.2g/L，搅拌，调节溶液的pH为7，即得蜂王浆活化提取液；然后向蜂王浆活化提取液加入新疆黑蜂蜂王浆冻干粉，搅拌活化0.5～1h，再加入石油醚，每升蜂王浆活化提取液加入新疆黑蜂蜂王浆冻干粉4～7g，石油醚与蜂王浆活化提取液的体积比为1:1.5～2；振荡0.5～1h，过滤，滤渣为球蛋白制备原料；滤液静置分层，除去有机相；将水相用14K透析膜进行透析后，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后即得蜂王浆主蛋白冻干粉；

制备蜂王浆主蛋白的方法如下：将脱脂蜂王浆溶于蒸馏水中浸提、过滤，再将滤渣用蒸馏水在同样条件下重复浸提三次，然后合并滤液，所得滤液为蜂王浆水溶性总蛋白溶液，将蜂王浆水溶性总蛋白溶液用14K透析膜进行透析后，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结，用真空冷冻干燥机冷冻干燥后即得蜂王浆主蛋白冻干粉；滤渣为球蛋白制备原料；

(3)制备球蛋白及获得醇溶性蛋白制备原料；在步骤(3)中，采用如下方法制备球蛋白：

第二种方法：在温度为4℃的条件下，将脱脂和制备蜂王浆主蛋白后的滤渣用8～12倍体积的、NaCl浓度为1.5～2.5wt％、4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为0.3～0.6wt％、pH＝7的溶液溶解，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌0.5～1h，过滤，将滤液用透析膜透析，将保留液放入-75～-85℃冰箱中冻结后，真空冷冻干燥机冷冻干燥后所得干粉即为球蛋白，滤渣为醇溶性蛋白制备原料

(4)制备醇溶性蛋白及获得谷蛋白制备原料；在步骤(4)：将醇溶性蛋白制备原料用75wt％乙醇溶液浸提，用集热式恒温磁力搅拌器搅拌2h，过滤，重复三次，合并滤液，真空干燥除去乙醇及水，冷冻干燥得到醇溶性蛋白，滤渣为谷蛋白制备原料；

(5)制备谷蛋白；在步骤(5)中，采用如下方法提取谷蛋白：

第二种方法：向0.01mol/L的NaOH溶液中加入N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸，N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸的加入量为NaOH物质的量的二分之一，然后再加入谷蛋白制备原料浸提，过滤，将滤液用透析膜透析，保留液冷冻干燥即得谷蛋白；

(6)制备新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物：称取0.2500g谷蛋白溶于62.5mL超纯水中后，均分成五份：

第一份用精密酸度计调pH至2.0，加入0.0667g胃蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第二份用精密酸度计调pH至7.5，加入0.0333g胰蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第三份用精密酸度计调pH至8.5，加入0.0333g胰凝蛋白酶，然后放入37℃恒温回旋振荡器内震荡4h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内2h；

第四份先用精密酸度计调至pH至2.0，加入0.0667g胃蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，然后再用精密酸度计调pH至7.5，加入0.0333g胰蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h；

第五份先用精密酸度计调pH至2.0，加入0.1000g胃蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，之后用精密酸度计调pH至7.5，再加入0.1000g胰蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h，再用精密酸度计将pH调至8.5，最后加入0.1000g胰凝蛋白酶，放入37℃恒温回旋振荡器内震荡2h或放入谷蛋白批量酶解用实验装置内1h；

酶解结束后将上述五份溶液放置于数显式恒温水浴锅中沸水浴15min，使酶失活；分别用离心机离心，离心力为12000xg，在4℃下离心10min后得到酶解产物：第一份离心后得到酶解产物命名为胃蛋白酶酶解产物、第二份离心后得到酶解产物命名为胰蛋白酶酶解产物、第三份离心后得到酶解产物命名为胰凝蛋白酶酶解产物、第四份离心后得到酶解产物命名为胃+胰蛋白酶酶解产物、第五份离心后得到酶解产物命名为胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物；

将上述得到的酶解产物胃蛋白酶酶解产物、胰蛋白酶酶解产物、胰凝蛋白酶酶解产物、胃+胰蛋白酶酶解产物和胃+胰+胰凝蛋白酶酶解产物，用截留分子量为10kD和3kD的超滤管或截留分子量为10kD和3kD的蜂王浆酶解产物超滤装置进行超滤分离得到大于10kD的肽段、3kD-10kD的肽段、以及小于3kD的肽段；

(7)分离谷蛋白酶解产物中不同分子量肽段。

2.根据权利要求1所述的抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，其特征在于，所述谷蛋白批量酶解用实验装置包括谷蛋白存放容器(1-1)、谷蛋白酶解容器、微型泵(1-14)、酶解用蛋白酶存放容器(1-2)和谷蛋白酶解产物存放容器(1-17)，所述谷蛋白酶解容器包括壳体(1-3)、一级混合容器(1-4)、一级酶解管路(1-5)、一级酶解容器(1-6)、二级混合容器(1-7)、二级酶解管路(1-8)和二级酶解容器(1-9)，所述壳体(1-3)内设有保温腔，所述一级混合容器(1-4)、所述一级酶解管路(1-5)、所述一级酶解容器(1-6)、所述二级混合容器(1-7)、所述二级酶解管路(1-8)和所述二级酶解容器(1-9)分别设置在所述保温腔内；所述谷蛋白存放容器(1-1)的出液端和所述酶解用蛋白酶存放容器(1-2)的出液端分别与所述一级混合容器(1-4)的进液端流体导通连接，所述一级混合容器(1-4)的出液端与所述一级酶解容器(1-6)的进液端通过所述一级酶解管路(1-5)流体导通连接，所述一级酶解容器(1-6)的出液端与所述微型泵(1-14)的进液端流体导通连接，所述微型泵(1-14)的出液端与所述二级混合容器(1-7)的进液端流体导通连接，所述二级混合容器(1-7)的出液端与所述二级酶解容器(1-9)的进液端流体导通连接，所述二级酶解容器(1-9)的出液端与所述谷蛋白酶解产物存放容器(1-17)流体导通连接；所述一级酶解管路(1-5)和所述二级酶解管路(1-8)均为内壁上设有扰流片(1-18)的翅片管管路；所述保温腔的高温媒介进口与供热装置(1-16)的高温媒介出口流体导通连接；所述一级混合容器(1-4)内和所述二级混合容器(1-7)内设置有混合用搅拌桨(1-10)，所述混合用搅拌桨(1-10)与混合用电机(1-12)的输出轴传动连接；所述一级酶解容器(1-6)内和所述二级酶解容器(1-9)内均设有酶解用搅拌桨(1-11)，所述酶解用搅拌桨(1-11)与酶解用电机(1-13)的输出轴传动连接；所述酶解用蛋白酶存放容器(1-2)的出液端与所述二级混合容器(1-7)的进液端流体导通连接；所述一级酶解管路(1-5)上设有三个温度传感器(1-15)；在所述一级酶解管路(1-5)上，第一个温度传感器(1-15)设置在所述一级酶解管路(1-5)的进液口，第二个温度传感器(1-15)设置在所述一级酶解管路(1-5)终端的管内，第三个温度传感器(1-15)设置在所述一级酶解管路(1-5)的出液口；所述二级酶解管路(1-8)上设有三个温度传感器(1-15)；在所述二级酶解管路(1-8)上，第一个温度传感器(1-15)设置在所述二级酶解管路(1-8)的进液口，第二个温度传感器(1-15)设置在所述二级酶解管路(1-8)终端的管内，第三个温度传感器(1-15)设置在所述二级酶解管路(1-8)的出液口；所述保温腔内设有温度传感器(1-15)；所述一级酶解管路(1-5)为螺旋管路；所述二级酶解管路(1-8)为螺旋管路。

3.根据权利要求1所述的抗氧化活性新疆黑蜂蜂王浆谷蛋白酶解产物的制备方法，其特征在于，酶解产物超滤装置包括大于10kD的肽段分离系统和3kD-10kD的肽段分离系统，大于10kD的肽段分离系统包括酶解产物存放容器(1)、第一供液泵(2)、第一中空纤维超滤膜组件(3)、第一浓缩液稀释容器(5)、第二供液泵(8)、第一卷式超滤膜组件(6)和第一透出液存储容器(4)，所述酶解产物存放容器(1)的出液端与所述第一供液泵(2)的进液端流体导通连接，所述第一供液泵(2)的出液端与所述第一中空纤维超滤膜组件(3)的进液端流体导通连接，所述第一中空纤维超滤膜组件(3)的浓缩液出液端与所述第一浓缩液稀释容器(5)的进液端流体导通连接，所述第一浓缩液稀释容器(5)的出液端与所述第二供液泵(8)的进液端流体导通连接，所述第二供液泵(8)的出液端与所述第一卷式超滤膜组件(6)的进液端流体导通连接，所述第一卷式超滤膜组件(6)的透出液出液端与所述第一供液泵(2)的进液端流体导通连接；所述第一中空纤维超滤膜组件(3)的透出液出液端与所述第一透出液存储容器(4)的进液端流体导通连接；所述第一卷式超滤膜组件(6)的浓缩液出液端与大于10kD肽段存放容器(22)的进液端流体导通连接；所述第一卷式超滤膜组件(6)的透出液出液端设置有第一限流阀(7)；所述第一中空纤维超滤膜组件(3)的浓缩液出液端与所述第一浓缩液稀释容器(5)的进液端通过第一混流管(10)流体导通连接，所述第一混流管(10)为内壁上设有扰流片(11)的导流管，所述第一混流管(10)的进液端与第一蒸馏水供给装置(9)的出液端流体导通连接；所述第一浓缩液稀释容器(5)中设有搅拌桨，所述搅拌桨与搅拌电机的输出轴传动连接；

3kD-10kD的肽段分离系统包括第三供液泵(12)、第二中空纤维超滤膜组件(13)、第二浓缩液稀释容器(15)、第四供液泵(18)、第二卷式超滤膜组件(16)和第二透出液存储容器(14)，所述第一透出液存储容器(4)的出液端与所述第二供液泵(12)的进液端流体导通连接，所述第二供液泵(12)的出液端与所述第二中空纤维超滤膜组件(13)的进液端流体导通连接，所述第二中空纤维超滤膜组件(13)的浓缩液出液端与所述第二浓缩液稀释容器(15)的进液端流体导通连接，所述第二浓缩液稀释容器(15)的出液端与所述第四供液泵(18)的进液端流体导通连接，所述第四供液泵(18)的出液端与所述第二卷式超滤膜组件(16)的进液端流体导通连接，所述第二卷式超滤膜组件(16)的透出液出液端与所述第二供液泵(12)的进液端流体导通连接；所述第二中空纤维超滤膜组件(13)的透出液出液端与所述第二透出液存储容器(14)的进液端流体导通连接；所述第二卷式超滤膜组件(16)的浓缩液出液端与3kD-10kD的肽段存放容器(23)的进液端流体导通连接；在所述第二卷式超滤膜组件(16)的透出液出液端设置有第二限流阀(17)，通过所述第二限流阀(17)限制由所述第二卷式超滤膜组件(16)的透出液出液端流向所述第三供液泵(12)进液端的流量；所述第二中空纤维超滤膜组件(13)的浓缩液出液端与所述第二浓缩液稀释容器(15)的进液端通过第二混流管(20)流体导通连接，所述第二混流管(20)为内壁上设有扰流片(11)的导流管，所述第二混流管(20)的进液端与第二蒸馏水供给装置(19)的出液端流体导通连接。

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