CN101168764A

CN101168764A - 一种采用谷朊粉生物酶法生产抗氧化活性肽的方法

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Publication number: CN101168764A
Application number: CNA2007101346492A
Authority: CN
Inventors: 张卫明; 杜风光; 史劲松; 史吉平; 朱昌玲; 孙达峰; 苏锋
Original assignee: SHANGHAI TIANZHIGUAN RENEWABLE ENERGY CO Ltd; NANJING INSTITUTE FOR COMPREHENSIVE UTILIZATION OF WILD PLANT CHINA CO-OP
Current assignee: SHANGHAI TIANZHIGUAN RENEWABLE ENERGY CO Ltd; NANJING INSTITUTE FOR COMPREHENSIVE UTILIZATION OF WILD PLANT CHINA CO-OP
Priority date: 2007-11-05
Filing date: 2007-11-05
Publication date: 2008-04-30

Abstract

本发明公开了采用谷朊粉生物酶法生产抗氧化活性肽的方法。该方法是将谷朊粉溶解于碱性溶液中，配制酶解底物；采用多种蛋白酶复合酶解法酶解底物；灭酶，分离，浓缩，干燥，收集产品。本发明采用了复合酶解法，生产出来的肽具有较高的抗氧化活性，且原料来源丰富、成本低、工艺简单、条件温和、不污染环境，便于工业化生产。

Description

一种采用谷朊粉生物酶法生产抗氧化活性肽的方法

技术领域

本发明涉及一种活性肽的生产方法，特别是一种以谷朊粉为原料，采用生物酶法生产抗氧化活性蛋白活性肽的生产。

背景技术

我国是小麦生产大国，小麦种植面积大，产量高。从95年起，每年小麦产量稳定在1.0亿吨，小麦生产出现了产区相对过剩、粮农卖粮难、库存积压的现象。小麦必须走深加工道路，向商品淀粉转化，进入工业生产领域。谷朊粉的生产是小麦深加工的必由之路，是小麦从商业用粮进入工业领域必经的环节，是小麦淀粉产业链的开端，其产业链的延伸将能够带动食品、化工、医药、纺织等相关行业的发展。目前，国内企业纷纷扩产或上马谷朊粉生产线，初步估计，2006年我国谷朊粉产量已达到15万吨。

谷朊粉是从小麦中分离出来的天然高蛋白聚合物，主要成分是醇溶性蛋白和麦谷蛋白，蛋白质含量在75～82％，氨基酸组成较齐全，是一种营养丰富、物美价廉的纯天然植物蛋白。

谷朊蛋白经特定的蛋白酶降解所形成的小分子肽类，不仅容易吸收，而且具有多种生理活性，可作为功能性食品、肽类药物进行开发。作为一种营养强化剂，肽优于氨基酸，较氨基酸吸收快速，是主动吸收，可以完整的形式被机体吸收。目前，相关理论研究，已揭示肽具有抗氧化、抗菌、降压等作用，我们的研究显示，谷朊粉降解产物同样具有较强的抗氧化作用。将谷朊粉蛋白水解成具有更高生物活性的多肽类物质，已经初步显现出在食品添加剂、天然日化等领域的应用前景。

通过生物技术手段将谷朊粉蛋白水解成具有更高生物活性的多肽类物质，从过去单一食品工业的应用，向美容、保健、医药等领域发展，有着广阔的应用前景。但国内该类技术才刚刚起步，大多没有进入产业化阶段，只是初步的理论探讨。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法。

本发明的是通过下列技术措施实现的：

一种采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，包括下列步骤：

a.将谷朊粉溶解于碱性溶液中，配制酶解底物；

b.采用多种蛋白酶复合酶解法酶解底物；

c.灭酶，分离，浓缩，干燥，收集产品。

所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其中配制酶解底物的方法是将水加热至40～60℃时，加入谷朊粉重量0.3～1.0％的碱，溶解搅拌均匀后，缓慢加入谷朊粉，不断搅拌，配制成谷朊粉浓度为8～16wt％的溶液。

所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其中碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的一种。

所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其中步骤b中酶解的方法是调节酶解液pH值为6.0～9.0，酶用量为谷朊粉重量的0.3～3.0％，温度40～65℃时搅拌反应4～9h。

所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其中组成复合酶的蛋白酶选自下列蛋白酶中的两种或多种：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶。组成复合酶的蛋白酶根据水解产物分子大小的要求，选择其中几类不同的酶组成，优选两类或三类不同的酶。复活酶中各种酶的用量比例可以是任意比例。

所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其中步骤c中灭酶的方法是当水解度达到15～35％时将温度升高到80～95℃，保温20min，再冷却至40℃。

所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其中步骤c中水解液分离方法采用碟片式离心机、板框压滤机、管式离心机单独或组合的方式。

所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其中步骤c中浓缩干燥的方法为水解分离液用真空吸入薄膜蒸发器中进行浓缩，直至浓缩液的可溶液固形物浓度达到20～35％，再采用冷冻干燥或离心喷雾干燥。

所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其中离心喷雾干燥时进风温度160～180℃，出风温度70～80℃。

以下对本发明技术方案作详细的说明：

1)、配料：采用成品谷朊粉，将水加热至40～60℃时，加入谷朊粉重量0.3～1.0％的碱，溶解搅拌均匀后，缓慢加入谷朊粉，不断搅拌，配制成谷朊粉浓度为8～16wt％的溶液。

2)、酶解：谷朊粉溶解过程中会使pH值不断下降，当pH值下降至8.5以下时，即可启动酶解反应。加热，溶液温度在40～65℃时，加入谷朊粉质量的0.3％～3.0％(w/w)复合酶进行水解，搅拌速度控制在60～80rpm。随着谷朊粉快速水解，体系pH逐步下降，则使用20％的碱液，调节酶解液pH值为6.0～9.0，反应时间4～9h。

3)、灭酶：当水解度达到15～35％时将温度升高到80～95℃，保温20min，再冷却至40℃。

4)、分离：分离时可以采用碟片式离心机、板框压滤机、管式离心机等及其不同类的两种组合。

5)、浓缩、干燥：水解分离液用真空吸入薄膜蒸发器中进行浓缩，直至浓缩液的可溶液固形物浓度达到20～35％，采用冷冻干燥或离心喷雾干燥的方法，得到产品谷朊蛋白活性肽粉末得到。离心喷雾干燥时进风温度160～180℃，出风温度70～80℃。

本发明中成品谷朊粉蛋白质含量≥75％，一般在75～82％。

在酶解步骤结束前，先要对水解液的水解度进行测定，测定水解度达到15～20％时，再进行下一步骤。

其中水解度(DH)的测定按照公式计算：DH＝h/h_fof×100％

式中h为水解后每g蛋白质裂解生成肽键的毫摩尔数，h_fof为每g原料蛋白质完全裂解生成肽键的毫摩尔数。对于某一特定的蛋白质而言，h是一个常数，谷朊粉蛋白为8.38mmol/g。所以只要测定水解后每g蛋白质被裂解的肽键数就可以计算相应的DH。又由于每裂解一个肽键.就生成一个新的-NH₂，所以只要测定蛋白质水解后生成的-NH₂量就可以求得h值，但原料中游离-NH₂的量应扣除。NH₂含量采用茚三酮法测定，原料N含量为凯氏定氮法测定数值。

本发明的有益效果：

本发明利用谷朊粉酶解，控制合适的水解度，生产出来的肽具有较高的抗氧化活性。本发明在酶解过程中，采用了复合酶解法，通过多种蛋白酶的有机结合，利用多种酶的不同特性的互补协同作用，较好地解决了单酶水解效率低，成本高的难题。特别是采用了动物类蛋白酶和微生物类蛋白酶进行酶解，其中微生物类蛋白酶具有水解能力强，效率高，且价廉的特性；而动物类蛋白酶具有水解产物生物活性强的特点。水解产物经浓缩喷雾干燥后，即成安全性高，具有高抗氧化生物活性的产品，本发明生产出来的抗氧化活性肽能应用于化妆品、健康食品添加剂、保健食品等领域，可作为功能性食品、肽类药物进行开发。本发明的技术方案，其原料来源丰富、价廉、工艺简单、条件温和、不污染环境，便于工业化生产。

具体实施方式

现在结合实施例对本发明作进一步的说明。

一般性说明：

本发明中肽的抗氧化性采用总抗、羟自由基清除能力指标进行评价。

总抗测定：用T-AOC试剂盒测定；

羟自由基清除率(IC50)为清除羟自由基50％消耗的水解肽浓度，具体方法如下：

羟自由基由fenton反应在弱碱性条件下产生。体系中含有3.0mL 100mmol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)，1.0mL 5.5mmol·L^-1FeSO₄，1.0mL6.5mmol·L^-1EDTA-2Na，1.0mL 0.2H₂O₂，1.0mL 10mmol·L^-1水杨酸钠和一定体积的样品溶液，总体积8.0mL，不足者加水补齐。37℃恒温1h，于510nm测定不加样管的吸光度A标和加样管的吸光度A样。加样管的吸光度用试样空白校正，试样空白管中含有3.0mL100mmol·L^-1磷酸盐缓冲液，1.0mL 5.5mmol·L^-1FeSO₄，6.5mmol·L^-1EDTA-2Na，1.0mL 10mmol·L^-1水杨酸钠和一定体积溶液，加水至8.0mL，吸光度为A样空白。按下式计算羟自由基清除率，

实施例1：以谷朊粉为原料生产抗氧化活性肽

量取500mL水，加热至40℃时，加入0.5g氢氧化钠，融化搅拌均匀后，在60～150rpm搅拌转速下慢慢加入50g谷朊粉，配制成10％(w/w)的谷朊粉酶解底物。当底物pH值下降至8.5～9.0时，温度55～60℃，加入1.0％(w/w)谷朊粉量的Alcalase 3.0T碱性蛋白酶和复合蛋白酶(重量比1∶1)进行水解，搅拌速度控制在60～80rpm，随着水解的进行，体系pH逐步下降，用20％的氢氧化钠溶液调整其pH值，使其维持在6.5～8.5之间，反应时间5h。对水解液的水解度进行测定，水解度达到15～20％时为合格，结束水解再进行下一步骤。水解结束后将温度升高到85℃左右，保温20min，再冷却至40℃。进行分离，分离时可采用碟片式离心机、板框压滤机、管式离心机等及其不同类的两种组合，水解分离液用真空吸入薄膜蒸发器中进行浓缩，直至浓缩液的可溶液固形物浓度达到20～35％，采用离心喷雾干燥的方法，得到产品乳白色谷朊蛋白活性肽粉末得到。离心喷雾干燥时进风温度160～180℃，出风温度70～80℃。

对实施例1产品性能的测定：测试蛋白水解液各项指标

采用实施例1生产谷朊粉活性肽粉进行测试：

蛋白含量97％；水解度19.52％；总抗2.86U/mg、羟自由基清除率(IC50)2.75mg。

并与其它物质抗氧化性特性的比较：

选取茶多酚、维生素C抗氧化性较好的物质与谷朊粉酶解肽进行对比，比较结果见下表。

其它物质的抗氧化性及比较结果

序号	名称	总抗氧化性U/mg		名称	羟自由基清除率(IC50)消耗水解液蛋白含量mg
序号	名称	总抗氧化性U/mg		名称	羟自由基清除率(IC50)消耗水解液蛋白含量mg	12	茶多酚(购买标准品99％)谷朊粉活性肽	9.02.86		维生素C谷朊粉活性肽	1.762.75

结果表明：在总抗活性方面，虽然与茶多酚有一定差距，但研究认为，谷朊粉酶解肽的抗氧化活性是显著的。谷朊粉酶解肽在羟基自由基清除率方面与维生素C相当。

实施例2

复合酶组成用胰蛋白酶、Alcalase 3.0T碱性蛋白酶(重量比1∶50)，其余制备过程同实验例1。

实施例3

复合酶组成用胰蛋白酶、复合蛋白酶(重量比1∶100)，其余制备过程同实验例1。

实施例4

复合酶组成用Alcalase 3.0T碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶(重量比30∶1)，其余制备过程同实验例1。

Claims

1.一种采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于包括下列步骤：

a.将谷朊粉溶解于碱性溶液中，配制酶解底物；

b.采用多种蛋白酶复合酶解法酶解底物；

c.灭酶，分离，浓缩，干燥，收集产品。

2.根据权利要求1所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于配制酶解底物的方法是将水加热至40～60℃时，加入谷朊粉重量0.3～1.0％的碱，溶解搅拌均匀后，缓慢加入谷朊粉，不断搅拌，配制成谷朊粉浓度为8～16wt％的溶液。

3.根据权利要求1或2所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的一种。

4.根据权利要求1所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于步骤b中酶解的方法是调节酶解液pH值为6.0～9.0，酶用量为谷朊粉重量的0.3～3.0％，温度40～65℃时搅拌反应4～9h。

5.根据权利要求1或4所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于组成复合酶的蛋白酶选自下列蛋白酶中的两种或两种以上：木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶。

6.根据权利要求1所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于步骤c中灭酶的方法是当水解度达到15～35％时将温度升高到80～95℃，保温20min，再冷却至40℃。

7.根据权利要求1所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于步骤c中水解液分离方法采用碟片式离心机、板框压滤机、管式离心机单独或组合的方式。

8.根据权利要求1所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于步骤c中浓缩干燥的方法为水解分离液用真空吸入薄膜蒸发器中进行浓缩，直至浓缩液的可溶液固形物浓度达到20～35％，再采用冷冻干燥或离心喷雾干燥。

9.根据权利要求8所述的采用谷朊粉酶法生产抗氧化活性肽的方法，其特征在于离心喷雾干燥时进风温度160～180℃，出风温度70～80℃。