CN103725742B - 一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法，包括：样品预处理、蜂王幼虫粉末脱脂、蜂王幼虫粉样品液配制、超声波处理蜂王幼虫粉样品液、蜂王幼虫粉样品液酶解反应、将酶解液置于沸水浴中加热20分钟灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，离心后取上清液、干燥上述上清液获得水解的蜂王胚胎肽粉。本发明制得的蜂王胚胎多肽能够用于制作改善人体机能的保健品，且更重要的是从水解的蜂王胚胎多肽中筛选得到对人体真正有效的生物活性多肽。

Description

一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法

技术领域

本发明涉及一种用酶解法制备蜂王胚胎肽的方法。

背景技术

蜂王幼虫又称蜂王胎或蜂皇胎，是蜜蜂受精卵经工蜂别喂饲新鲜王浆而生长发育成幼虫体，是从王台里的王浆表面取出的幼虫。蜂王幼虫以蜂王浆为食，幼虫本身有极丰富的营养，同时其体表也黏附着王浆。它是人工生产蜂王浆的副产品。蜂王幼虫是一个活的动物体，不但含有丰富的营养物质，还含有丰富的酶类和生物活性物质。蜂王幼虫不仅蛋白质含量高(占干物质的50％以上)，而且18种氨基酸齐全，富含8种人体必需氨基酸。天门冬氨酸及谷氨酸的含量较高，这两氨基酸对人体具有很好的健脑作用。此外，还含有牛黄酸。蜂王幼虫中含有大量人体必需的常量和微量元素(毫克／100克干物)：铜2.402，钾1489.3，钠81.5，锌11.5，镁152.5，铝78.3，硒18.1(微克／100克)，钙84.6，铁4.2，钼0.26(纳克／克)。蜂王幼虫含有丰富的维生素，尤其是维生素A、大大超过牛肉或鸡蛋，仅次于鱼肝油；维生素D的含量也很丰富，1g鲜幼虫含6100～7340国际单位，而被人们认为含维生素D极高的鱼肝油每1g仅含100～600国际单位。另外，蜂王幼虫中还含有高活性和高生物效能的混合激素，其中保幼激素和蜕皮激素比较丰富。在营养丰富的同时，蜂王幼虫中的胆固醇含量又比较低，研究表明蜂王幼虫胆固醇含量小于10mg／100g，与牛肉，牛乳及鸡蛋等食品相比其胆固醇含量极低，所以蜂王幼虫是一种低胆固醇类食品资源，极具开发价值。特别值得注意是含有较多的稀有微量元素硒、钴、铬等。蜂王幼虫中含有多种生物激素、酶类(超氧化物歧化酶5670微克／100克)等具有高度生物性的物质。蜂王幼虫是非常珍贵的天然产品，含有丰富的人体所需的蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、矿物元素等众多营养成分，在补充营养，调节免疫上都有重要的作用。

蜂王幼虫有抗疲劳作用。说明蜂王幼虫能明显提高小鼠的抗应激能力，表现出明显的抗疲劳作用。蜂王幼虫是一种营养十分丰富的天然物质，因而有促进生长的作用。蜂王幼虫能调节中枢神经系统功能，具有增强体力、安神镇静、振奋精神、改善睡眠、增强记忆能力的作用。适用于神疲健忘、失眠多梦、精神恍惚、心烦意乱等。蜂王幼虫改善心血管的功能，具有增强心脏收缩力、平衡血压、改善微循环、促进组织代谢、增加白细胞的作用。适用于气短心悸、气血不通、面色萎黄、脸色苍白、四肢无力。特别是具有护肝作用，能改善功能，恢复受损害的肝细胞。蜂王幼虫对消化系统有很好的调节作用，能增加食欲，帮助消化，通利大便，对于嗳酸腹胀，胃纳差，便秘有很好的改善作用，对慢性浅表性胃炎有辅助疗效。蜂王幼虫对内分泌系统有调节作用，能调整好月经、改善更年期不适，增强男女性欲。对男性精子数少、活动力差、液化时间延长的病人有明显改善作用。对于经期不准、量多、量少、更年期综合症、阳痿、早泄、女性排卵障碍、不孕不育等有辅助疗效。实践证明，蜂王幼虫能美容养颜、壮精血、健脾胃、益心智，是理气养血、补充营养最为理想的保健珍品，尤其适用于老人体弱、病后滋补、孕期调养和青少年发育迟缓。归纳起来，蜂王幼虫的作用主要包括：1，健脑益智作用；2，增强机体免疫力；3，抗肿瘤作用；4抗氧化作用与美容养颜；5，改善消化系统。

现在蜂王浆的单群浆蜂年产量已突破10kg，我国蜂王浆的年产量超过3000吨，按照每生产1kg蜂王浆，同时可生产蜂王幼虫0.2kg-0.3kg计算，全国年产蜂王幼虫可达600-900吨。然而，全国每年用于加工的蜂王幼虫只有50吨左右，剩下的被养蜂人直接处理掉了，这样的浪费太惊人了。

蜂王幼虫作为一种营养价值极为丰富的食源性资源，在营养、保健、美容方面具有很好的研发意义，但由于长期以来科研条件、技术条件、经济发展限制，目前的开发利用还远远不够，在科研投入方面力度也不够大，蜂王幼虫研究和产业开发尚未进入实际性的阶段。蜂王幼虫的开发利用势在必行。

生物活性肽是一类具有清除自由基、提高机体免疫能力、延缓衰老、降低血压等特殊功能的功能因子。这些肽在原蛋白质序列中并没有活性，当用体内肠道酶或体外酶作用蛋白质时，这些肽将从原来的序列中释放出来，并表现出特殊的活性，如免疫肽、酪蛋白磷酸肽、抗菌肽以及降血压肽等。

蜂王幼虫的产品主要有以下几种：冻干粉、蛋白提取物、新鲜幼虫炮制溶液。冻干粉是一种最常见的蜂王幼虫产品。有文献报道，以蜂王幼虫冻干粉为原料提取蜂王幼虫各种类型的蛋白质。目前，国内外对于利用蜂王幼虫这一来源广泛、价格低廉的蛋白质资源制备水解多肽的技术尚未见专利报道。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种使用蜂王幼虫制备蜂王胚胎肽的方法。

本发明是一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法，包括：

步骤1：样品预处理：将蜂王幼虫在存活期内-80℃迅速冷冻，并干燥，将干燥的蜂王幼虫样品研磨成粉；

步骤2：蜂王幼虫粉末脱脂：将预处理过的蜂王幼虫粉末样品放入超临界萃取装置脱脂，脱脂条件：萃取压力35MPa，萃取温度35℃，萃取时间200分钟，常压分离，收集脱脂后的蜂王幼虫蛋白用于进行酶解；

步骤3：蜂王幼虫粉样品液配制：以上述脱脂后的蜂王幼虫粉为原料，该原料中蛋白质的含量为在70％以上，将该蜂王幼虫粉原料按照料液比1∶10(w／v)加入去离子水50℃搅拌混匀4小时，获得蜂王幼虫粉样品液；

步骤4：超声波处理蜂王幼虫粉样品液：使用功率250W～1250W的脉冲超声波进行对蜂王幼虫粉样品液预处理，超声波处理时间30分钟，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4秒、间隙时间2秒；

步骤5：蜂王幼虫粉样品液酶解反应：将超声波处理后的脱脂蜂王幼虫粉样品液pH调至7.5～8.5，在恒温水浴中加热至40℃～60℃，按照酶与脱脂蜂王幼虫粉样品液质量比例0.02～0.04∶1加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和风味蛋白酶按照质量比例1∶1组成，水解度达到20％时停止反应；

步骤6：将酶解液置于沸水浴中加热20分钟灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，离心后取上清液；

步骤7：干燥上述上清液获得水解的蜂王胚胎肽粉。

所述蜂王幼虫为2～3日龄的蜂王幼虫。

本发明是一种用于测定酶解法制备的蜂王胚胎肽中多肽含量测定方法，利用10％三氯乙酸(TCA)沉淀水解液中大分子蛋白，经过离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm测定其OD值，继而配制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，测定标准肽数据，制作标准曲线，在曲线上查找样品中的多肽含量。

一种检测水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法包括自由基清除能力测定、超氧阴离子自由基清除能力测定和脂质体过氧化抑制能力测定。

所述自由基清除能力测定为测定水解蜂王胚胎肽酶解物样品溶液对DPPH自由基的清除除力。

所述超氧阴离子自由基清除能力测定采用核黄素-光-氮蓝四唑体系测定。

所述脂质体过氧化抑制能力测定方法是，在10m试管中加入0.2ml脂质体溶液，不同体积的样品和50mmol／LFeSO₄溶液50ul，再加入磷酸盐缓冲溶液至3mL不加样品的反应物管作为模型，不加FeSO₄溶液的试管作为空白，将反应物置于37℃水浴40分钟，最后加入10％三氯乙酸1ml，0.8％硫代巴比妥酸(TBA)1ml，混合均匀，置于沸水中15分钟，冰水冷却，在8000r／min下离心10分钟，取上清液在532nm处测定吸光度(A)，按照以下计算公式计算脂质过氧化的抑制率：脂质过氧化的抑制率(％)=(A模型一A样品)／(A模型一A空白)×100％。

本发明的有益技术效果在于：

1.本发明利用复合蛋白酶(Protamex)(中性蛋白酶∶风味蛋白酶=1∶1)来水解蜂王胚胎幼虫。中性蛋白酶作为一种内切蛋白酶，具有纯天然、安全无毒、水解能力强、作用范围广等；风味蛋白酶天然安全，可应用于各种动植物蛋白的水解，后期风味优化，去除苦味，改善口感，可以制取风味良好的动植物水解产品，提高产品质量，降低成本。在食品加工过程中添加合适的风味蛋白酶，使风味前体物水解，从而释放出风味物质，增强和改善食品的风味。该复合蛋白酶酶解既保证了蜂王胚胎幼虫可充分的水解，又能使得水解产物有适于食用的风味，而且保证天然、安全、无毒。

2.本发明利用生物酶解技术是利用不同蛋白酶的生物催化分解作用把大分子的蛋白质分子在一定程度上分解成肤类小分子物质，这样可以使营养物质更利于人体消化吸收，也可能提高其生物活性。用酶解液可进行生物活性研究或多肚分离纯化等研究，为进一步提高产品利用价值奠定基础。

3.本发明制备得到的蜂王胚胎肽粉游离氨基酸明显升高，特别是必需氨基酸的提高比例更大，必需氨基酸是人类自身不能合成的氨基酸，必需依靠从食物中获取，这样看来，本发明获得容易被吸收、抗氧化效果好的小分子蜂王胚胎多肽，大大提高了蜂王胚胎的营养价值。

4.本发明将超声波技术应用于蛋白酶解制备蜂王胚胎多肽，能够明显缩短脱脂蜂王胚胎幼虫蛋白酶解时间，使得有效小分子多肽得到充分的分解出来。

5.本发明是一种生物酶法，易通过对酶解过程的监控，使蜂王胚胎中小分子多肽有效的地释放出来，提高原料的利用率，提高了其保健医疗价值；

6.本发明所采用的原料来源广泛，价格低廉，经过本发明的技术转化可大大提高蜂王胚胎幼虫的附加值。

附图说明

图1：蜂王幼虫粉末脱脂用的超临界萃取装置。

1，钢瓶2，过滤器3，压缩机4，缓冲罐5，压力调节阀6，预热器

7，单向阀8，萃取釜9，减压阀10，采样瓶11，累加流量计

图2：Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线。

图3：蜂王胚胎肽对DPPH自由基清除能力和对照组BHT的对比。

图4：蜂王胚胎肽对超氧阴离子自由基(O₂·)清除能力和对照组BHT的对比。

图5：脂质体过氧化抑制能力测定。

图6：不同蛋白酶水解蜂王胚胎蛋白对多肽得率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

步骤1：样品预处理：采集2～3日龄的蜂王幼虫(蜂王胚胎，2～3日龄的蜂王幼虫未生长和呼吸率很相近，以后随着喂养条件变化他们开始向蜂王工蜂分化，这是选择2～3日蜂王幼虫的根据)适量，在蜂王幼虫存活期内-80℃迅速冷冻，用冷冻干燥机冷冻干燥，将干燥的蜂王幼虫样品研磨成粉。

步骤2：蜂王幼虫粉末脱脂：将预处理过的蜂王幼虫粉末样品放入如图1所示的超临界萃取装置脱脂，将蜂王幼虫粉装入萃取釜中，打开钢瓶，钢瓶1中的CO₂经过滤器2过滤后进入到压缩机3(隔膜式)，在压力达到所需压力后送至缓冲罐4，经过压力调节阀5由缓冲罐进入预热器6，将CO₂加热至所需温度，然后进入到萃取釜8中进行油脂的萃取。脱脂条件：萃取压力35MPa，萃取温度35℃，萃取时间200分钟，常压分离。收集脱脂后的蜂王幼虫蛋白用用于进行酶解。

步骤3：蜂王幼虫粉样品液配制：以上述脱脂后的蜂王幼虫粉为原料，该原料中蛋白质的含量为在70％以上，将该蜂王幼虫粉原料按照料液比1∶10(w／v)加入去离子水50℃搅拌混匀4小时，获得蜂王幼虫粉样品液；

步骤4：超声波处理蜂王幼虫粉样品液：使用功率250W～1250W的脉冲超声波进行对蜂王幼虫粉样品液预处理，超声波处理时间30分钟，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4s、间隙时间2s；

步骤5：蜂王幼虫粉样品液酶解反应：将超声波处理后的脱脂蜂王幼虫粉样品液pH调至7.5～8.5，在恒温水浴中加热至40℃～60℃，按照酶与脱脂蜂王幼虫粉样品液质量比例0.02～0.04∶1加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和风味蛋白酶按照质量比例1∶1组成，水解度达到20％时停止反应；

步骤5中，酶解过程水解度的测定采用pH-stat法：

水解度的计算公式如下：

$\mathrm{DH}(\%)=\frac{h}{h_{\mathrm{tot}}}\×100$

公式中，

h：为单位质量蛋白中被裂解的肽键数(mmol／g)；

h_tot：为单位质量原料蛋白中肽键的总数(mmol／g)；

$h_{\mathrm{tot}}=\frac{1}{M_{\mathrm{\α}}}\×100$

公式中：M_α为被水解蛋白中AA的平均分子量。

M_α＝∑p_i×M_i

式中：P_i为某种组成蛋白质的氨基酸含量；

Mi为某种组成蛋白质的氨基酸分子量。

由以上两式可知，某一特定的蛋白质其h_tot为一个固定值，可以计算出蜂王幼虫蛋白质的h_tot，其值为7.57。

当溶液pH≥6时，在蛋白水解过程中断裂的肽键量与加入碱量的定量关系如下：

$h=B\×N_b\×\frac{1}{\mathrm{\α}}\×\frac{1}{M_p}$

式中：B-NaOH消耗量，mL；

N_b-NaOH浓度，mol／L；

Mp-被水解的蛋白质量，g；

1／α-校正系数；

α-α-NH₂在蛋白底物中的平均解离度，可用下式计算而得：

$\mathrm{\α}=\frac{{10}^{\mathrm{pH}-\mathrm{pK}}}{1+{10}^{\mathrm{pH}-\mathrm{pK}}}$

其中，pH-对蛋白进行酶解时溶液的pH；

pK-NH₃+的解离常数；蛋白酶解条件不同，其α值就不同，具体换算如下表故水解度(DH)计算公式可演变成下式进行计算：

$\mathrm{DH}=\frac{B{\×N}_b}{\mathrm{\α}\×M_p\×h_{\mathrm{tot}}}\×100\%$

从上述推导公式可知，pH-stat法只需记录酶解过程中所消耗碱量就可以计算出蛋白质水解过程中DH值。

表1不同条件下校正系数1／α

从加入酶开始计算，每间隔10-12分钟检测一次水解情况，水解度达到20％时候停止水解。

步骤6：将酶解液置于沸水浴中加热20分钟灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，离心后取上清液；

步骤7：采用常规冷冻干燥方法，干燥上述上清液，并加入辅料，如按照上清液的10％-30％加入食用淀粉等，喷雾干燥获得淡黄色或白色粉末状的水解的蜂王胚胎肽粉。

为了测定蜂王幼虫(蜂王胚胎)水解肽中的多肽含量，了解此种方法水解蜂王幼虫蛋白的能力可利用以下方法测定水解物中多肽含量。

利用10％三氯乙酸(TCA)沉淀水解液中大分子蛋白，经过离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm测定其OD值，继而配制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，测定标准肽数据，制作Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线，如图2所示，在曲线上查找样品中的多肽含量。

多肽含量的具体测定程序如下，取2.5ml样品溶液加入2.5ml10％(W/V)的三氯乙酸(TCA)水溶液于漩涡混合仪上混合均匀静置10分钟然后在4000转/分钟下离心15分钟将上清液全部转移到50ml容量瓶中并用5％的TCA定容至刻度摇匀然后取6.0ml上述溶液置另一试管中加入双缩脲试剂4.0ml(样液:双缩脲试剂＝3:2V/V)于漩涡混合仪上混合均匀静置10分钟2000转/分钟离心10分钟取上清液于540nm下测定OD值对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/ml)进而可求得样品中多肽含量。

标准曲线制作步骤如下：取十个10ml的容量瓶用5％的TCA依次配制0.00.20.40.60.81.01.21.41.6和1.8mg/ml的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液然后分别取6.0ml标准溶液加入4.0ml双缩脲试剂于漩涡混合仪上混合均匀静置10分钟2000r/min离心10分钟取上清液于540nm下测定OD值(以第一管做空白对照)以肽的浓度为横坐标X(mg/ml)OD值为纵坐标Y制作标准曲线(图2)得到回归方程y＝0.3681x+0.0013，R²＝1。本实施例中，测定数据如下：OD₅₄₀＝0.634，按照公式Y＝0.3681X+0.0013计算的到多肽浓度为1.72mg/ml。

本发明的一种检测水解蜂王胚胎肽的抗氧化活性的方法，包括自由基清除能力测定、超氧阴离子自由基清除能力测定和脂质体过氧化抑制能力测定，其目的是检测水解蜂王胚胎肽抗氧化抗衰老的能力。

1、所述自由基清除能力测定为测定水解蜂王胚胎肽酶解物样品溶液对DPPH自由基(DPPH·)的清除除力，具体的测定方法是：

用32ml无水乙醇2mgDPPH粉末溶解，4℃避光保存。测定水解蜂王胚胎肽酶解物样品溶液对DPPH自由基(DPPH·)的清除除能力。按表2方法加样反应10分钟，5000r／min离心3分钟，取反应液各200ul于96孔板，并用酶标仪在517nm处测定其吸光值A；以BHT(2，6-二叔丁基对甲苯酚)做阳性对照。

表2

表中A为吸光值。

清除率按照以下公式计算：

清除率(％)=[1-(Ai-Aj)／A]×100％

注：公式中A为吸光值，A₀为阴性对照，空白样品吸光值；A_i为加入样品反应液后吸光值。

DPPH·是一种较为稳定的以氮为中心的芳香类自由基，研究抗氧剂样品直接捕获或与DPPH·相结合的行为，可推测抗氧化剂对芳香自由基的清除能力。BHT在抗氧化过程中既可以作为氢的给予体也可以作为自由基俘获剂。在食品加工中用作抗氧化剂。如图3所示，蜂王胚胎多肽清除DPPH·的能力很强，明显高于对照组BHT；在研究的浓度范围内，随着浓度的增大，其清除能力也逐渐增强，呈现较好的量效关系。因此，蜂王胚胎多肽具有较好的清除DPPH·能力。

2、所述超氧阴离子自由基清除能力测定采用核黄素-光-氮蓝四唑体系(NBT法)测定。采用核黄素-光-氮蓝四唑体系(NBT法)测定；的具体步骤，取0.5mL50mmol／LTris-HCl缓冲溶液(pH8.2)、0.4mL去离子水在2mL的管混匀后在37℃水浴20分钟，取出后立即加入0.1mL在37℃预热过的3mmol／L邻苯三酚，迅速摇摇匀后取200ul至96孔板反应3-5分钟，在325nm下测定反应前后吸光度。以BHT作为阳性对照。

清除率按照以下公式计算：

清除率(％)=(ΔA1-ΔA2)／ΔA1×100％

其中，ΔA1为邻苯三酚自氧化吸光值增加值，ΔA2为加入样品反应液后吸艽缢。

超氧阴离子自由基(O₂·)不仅具有重要的生物功能，也与多种疾病有密切的联系。它是基态氧接受一个电子后形成的第一个氧自由基，可经过一系列反应生成其他的氧自由基，因此具有特别重要的意义。如图4所示，在检测浓度范围内，蜂王胚胎肽对(O₂·)的清除率随着多肽浓度的增加而增高；在同一浓度下，其清除(O₂·)的能力大大高于BHT。因此，蜂王胚胎肽对具有较好的清除超氧阴离子的能力。

3、所述脂质体过氧化抑制能力测定，具体的测定方法是，在10m试管中加入0.2m1脂质体溶液，不同体积的样品和50mmol／LFeSO4溶液50ul，再加入磷酸盐缓冲溶液至3mL不加样品的反应物管作为模型，不加FeSO₄溶液的试管作为空白，将反应物置于37℃水浴40分钟，最后加入10％三氯乙酸1ml，0.8％硫代巴比妥酸(TBA)1ml，混合均匀，置于沸水中15分钟，冰水冷却，在8000r／min下离心10分钟，取上清液在532nm处测定吸光度(A)。

按照以下计算公式计算脂质过氧化的抑制率：

脂质过氧化的抑制率(％)＝(A模型一A样品)／(A模型一A空白)×100％

自由基学说认为人体的衰老和疾病都与脂质体的过氧化密切相关，而脂质体过氧化是由于自由基的攻击所造成的，要减轻或防止脂质体的过氧化必须使用抗氧化剂，因此蜂王胚胎肽对脂质体过氧化的的抑制活性能反应出样品的抗氧化活性。如图5所示，可以看出随着蜂王胚胎肽浓度增加，对脂质体过氧化的抑制能力也有所增加，当浓度达到250mg／ml，(w／v)时，抑制率达到最高，为60.71％对脂质体过氧化的抑制能力也反应了蜂王胚胎肽对自由基的清除能力。

以上结果表明，本发明制备的蜂王胚胎肽具有良好的抗氧化能力和清除自由基的能力，在食品工业和保健品行业中有良好的应用前景。

本发明中，水解酶的选择由为中性蛋白酶和风味蛋白酶按照质量比例1∶1组成的复合蛋白酶。

选用Trypsin(胰蛋白酶)，Pepsin(胃蛋白酶)，Papain(木瓜蛋白酶)，Flavourzyme(风味蛋白酶)，Alcalase(碱性蛋白酶)与Protamex(复合蛋白酶)做比较，Alcalase酶解蜂王胚胎蛋白质粗提液，在所选酶的最适酶解条件下，选取实验条件为料液比1∶50，酶用量4mg／ml，酶解时间4小时、酶解温度40℃，胃蛋白酶Pepsin酶解pH2.5，碱性蛋白酶Alcalase酶解pH8.0其余酶酶解pH7.0，对各种酶的酶解产物的活性与感官品质进行比较。

下表显示了在该条件下比较各蛋白酶对酶解产物的生物活性、多肤得率和感官评价的影响。

表3几种蛋白酶对蜂王胚胎蛋白粉的酶解效果

从上表可以看出，从酶解产物的风味来说，木瓜蛋白酶作用的酶解产物，风味太差，有腥味异味，胰蛋白酶和胃蛋白酶的酶解产物虽然腥味较大，但活性最高，复合蛋白酶和风味蛋白酶作用的酶解液风味最好。从酶解液的生物活性来看，胰蛋白酶作用的酶解液的DPPH·自由基的清除活性最高，而复合蛋白酶酶解液对O₂·自由基的清除活性和对脂肪酶抑制活性均最高。如图6所示，显示了不同蛋白酶作用下酶解蜂王胚胎蛋白质产生多肤的得率。如图6所示，同样的酶解时间下，复合蛋白酶酶解蜂王胚胎蛋白得到的多肽产率最高。因此本发明选用复合蛋白酶为酶解蜂王胚胎蛋白质的最适蛋白酶。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种酶解法制备蜂王胚胎肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)样品预处理：将蜂王幼虫在存活期内-80℃迅速冷冻，并干燥，将干燥的蜂王幼虫样品研磨成粉；

2)蜂王幼虫粉末脱脂：将预处理过的蜂王幼虫粉末样品放入超临界萃取装置脱脂，脱脂条件:萃取压力35MPa,萃取温度35℃,萃取时间200分钟，常压分离，收集脱脂后的蜂王幼虫蛋白用于进行酶解；

3)蜂王幼虫粉样品液配制：以上述脱脂后的蜂王幼虫粉为原料，该原料中蛋白质的含量为在70％以上，将该蜂王幼虫粉原料按照料液质量/体积比1:10加入去离子水50℃搅拌混匀4小时，获得蜂王幼虫粉样品液；

4)超声波处理蜂王幼虫粉样品液：使用功率250W～1250W的脉冲超声波进行对蜂王幼虫粉样品液预处理，超声波处理时间30分钟，对应一个脉冲的超声波发出时间2～4s、间隙时间2s；

5)蜂王幼虫粉样品液酶解反应：将超声波处理后的脱脂蜂王幼虫粉样品液pH调至7.5～8.5，在恒温水浴中加热至40℃～60℃，按照酶与脱脂蜂王幼虫粉样品液质量比例0.02～0.04:1加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和风味蛋白酶按照质量比例1:1组成，水解度达到20％时停止反应；

6)将酶解液置于沸水浴中加热20分钟灭酶，冷却至常温，将酶解液pH值调至7.0，离心后取上清液；

7)干燥上述上清液获得水解的蜂王胚胎肽粉。

2.根据权利要求1所述的酶解法制备蜂王胚胎肽的方法，其特征在于，所述蜂王幼虫为2～3日龄的蜂王幼虫。

3.一种用于测定权利要求1所述的方法制备的蜂王胚胎肽中多肽含量的方法，其特征在于，利用10％三氯乙酸沉淀权利要求1中步骤5)所得水解液中的大分子蛋白，经过离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm测定其OD值，继而配制Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，测定标准肽数据，制作标准曲线，在曲线上查找样品中的多肽含量。