CN102871121B - 一种海洋骨胶原肽钙螯合物生物补钙剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种海洋骨胶原肽钙螯合物的制备方法，包括酶解、螯合和沉淀步骤，其中：酶解步骤包括在鱼骨中加入碱性蛋白酶酶解，然后加入木瓜蛋白酶酶解，制成骨胶原肽；螯合步骤包括在骨胶原肽溶液中加入钙源进行螯合反应；沉淀步骤包括将螯合液用无水乙醇进行沉淀，得海洋骨胶原肽钙螯合物。本发明的海洋骨胶原肽钙螯合物的制备方法。以三文鱼、鮟鱇鱼等海洋鱼产品加工废料杂鱼骨为原料制得无腥味淡黄色粉末状鱼骨胶原肽，并将其与氯化钙螯合。产品在偏酸性条件下溶解为淡黄色液体，通过傅里叶红外光谱对螯合物进行结构鉴定，钙离子与多肽中-COOH和氨基结合形成配位键，说明生成了一种新型的海洋骨胶原肽钙螯合物。本发明采用鱼产品加工废料鱼骨制备骨胶原肽，充分利用资源，且原料安全无毒，制备过程无有害物质参加和产生，且工艺简单、成本低廉，可用补钙类保健品及药品的制备。

Description

一种海洋骨胶原肽钙螯合物生物补钙剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种海洋骨胶原肽钙螯合物生物补钙剂的制备方法，属于现代食品加工和生物技术领域。

背景技术

钙是人体生命活动所必需的矿物元素，是机体新陈代谢的源泉。钙也是人体中含量最丰富的矿物元素，对维持人体的循环、呼吸、内分泌及骨骼等系统的正常生理功能具有不可替代的作用。我国居民的膳食组成以植物性食物为主，其植酸盐、纤维素、草酸等含量较高，居民的钙吸收率偏低，尤其孕产妇、老年人、儿童缺钙现象更为严重。人体缺钙会导致骨质疏松、佝偻病、易过敏等严重后果。近年来，随着人们对健康及营养问题关注度增加，补钙成为了热门话题。

骨骼中的钙以羟基磷酸钙的形式与骨胶原粘合而固定下来的。骨骼中若无骨胶原，羟基磷酸钙只能以分子和颗粒的形式堆积，则不能称之为骨骼。此外，骨骼中如果没有足够的胶原或其合成速度小于降解速度，骨钙则进入血浆，导致血钙浓度升高而排出体外，从而引起骨质疏松等疾病。所以，在补钙的同时应补充骨胶原，以促进钙的吸收和固定。

CN101731666A公开一种鱼骨生物活性多肽钙粉，包括将鱼骨研磨成鱼骨泥；加入复合蛋白酶酶解，离心；将上清液超滤、浓缩、干燥成鱼骨蛋白多肽粉；将离心所得沉淀物烘干得可溶性钙；将所得鱼骨蛋白多肽粉和所得可溶性钙混合。然而，该技术仅仅是将骨胶原肽与钙源简单混合。

现代研究已经证实，骨的生长除了需要钙以外，还需要有蛋白质。骨胶原蛋白不仅能够增加骨的韧性，还可以与钙结合，避免骨钙的流失。生物体内许多具有抗氧化活性的物质属于蛋白质和肽类，胶原肽(胶原多肽)是各种动物胶原蛋白(皮、骨、关节等)经蛋白酶等降解处理后得到的相对分子量在20kDa以下的产物，其消耗吸收性不仅能够大大提高，同时还具有胶原蛋白的功能特性。研究发现，胶原肽具有减缓动脉硬化发生、抗氧化、降血压、改善骨质疏松、促进皮肤胶原代谢等功能。

CN102241733A公开了一种鹿骨胶原多肽螯合钙，采用酶水解及超声辅助法提取鹿骨中的胶原蛋白，得到胶原蛋白水解成胶原多肽，和鹿骨钙或无机钙源进行化学螯合，经过冷冻干燥制得。

CN102429236A公开了一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法，包括制备猪骨泥；接种粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种，发酵培养，离心，上清液制得骨胶原多肽，分离出的骨泥渣制得可溶性的骨钙；将骨胶原多肽和可溶性骨钙螯合，制得猪骨胶原多肽钙螯合物补钙剂。

CN102429891A公开了一种低分子量羊骨胶原多肽钙螯合物微胶囊的制备方法，包括制备羊骨粉，添加胃蛋白酶酶解，添加木瓜蛋白酶酶解，离心，上清液得骨胶原多肽；加入氯化钙或可溶性羊骨钙螯合反应，制备低分子量羊骨胶原多肽钙螯合物微胶囊。

上述方法均采用陆地动物的骨源制作螯合补钙剂，其应用范围比较局限，一是因为陆地动物易患疾病，特别是微生物感染疾病，如猪瘟、猪肺疫、猪丹毒、链球菌病、副伤寒、乙型脑炎等；羊的细菌病，包括肉毒梭菌中毒症、弯曲菌病、沙门氏菌病、链球菌病、羊猝疽、肠毒血症，羊的病毒病，包括口蹄疫、绵羊痘、梅迪一维斯纳病等；鹿的坏死杆菌病等等。造成骨源的污染性和带菌性，特别是病死的动物。二是出于宗教原因，很多地区的人们不能接受陆地动物来源的食料等等。

海洋骨胶原肽(MOP)是一种低聚肽，因此也称海洋骨胶原低聚肽，具有多种生理功能，能保护胃黏膜以及抗溃疡，促进皮肤胶原代谢，抑制血压上升，促进钙离子吸收和降低血清中胆固醇含量等，且其在钙离子吸收过程中，不需要VD的参与，就能促进钙的吸收。海洋骨原肽是从海洋鱼骨中酶解提取的小分子低聚肽，可直接被机体肠道吸收和利用。

“海洋骨胶原肽对去卵巢大鼠体重以及胰腺细胞凋亡和组织病变的影响”(朱翠凤等，《中国老年学杂志》2007年6月第27卷，P1046-1049)中研究了从三文鱼等海洋水产品骨头和残余肌肉中通过体外酶解法水解提取的低聚活性肽混合物具有非常好的水溶性和抗氧化、提高免疫力等功能。研究显示，海洋骨原肽可能明显增加去卵巢大鼠股骨的骨密度和骨矿物质含量。其作用机制可能是由于海洋骨原肽可能促进成骨细胞的增殖和分化，促进骨形成，对增加骨量有协同作用；同时，海洋骨原肽可能抑制破骨细胞的增殖和分化，减少骨吸收和骨量丢失，抑制骨吸收。

“海洋鱼骨胶原低聚肽改善骨质疏松的效果观察”(潘兴昌等，《预防医学情报杂志》2011年5月第27卷第5期，P393-395)中研究了胶原肽能够促进钙质吸收、增加骨密度，对骨代谢具有有益作用，海洋鱼胶原低聚肽能够促进人体骨胶原蛋白的合成，与骨细胞和钙、磷等矿物质共同促进新骨形成，增加骨钙沉积。

目前，现有技术中还没有关于海洋骨胶原肽与钙络合形成的螯合物的技术。由于海洋骨胶原肽具有很多利用骨质的优势，因此本发明将提出一种海洋骨胶原肽与钙螯合形成螯合物的技术，不仅能使钙离子在海洋骨胶原肽的粘合下沉积在骨骼中，而且能促进游离钙离子的吸收，从而有效预防和改善因缺钙而引起的骨质疏松、佝偻病及过敏等健康问题。

发明内容

本发明在于弥补现有技术中的不足，提出一种海洋骨胶原肽钙螯合物补钙剂的制备方法，利用海洋骨胶原肽与可溶性钙源螯合成一种新型的功能性补钙食品。该补钙剂制备过程安全，在偏酸性条件下溶解性较好，无毒副作用，而且由于海洋骨胶原肽的存在，还具有抑制血压上升和促进皮肤胶原代谢等功能。

为了实现上述目的，本发明提供一种海洋骨胶原肽钙螯合物的制备方法，本发明的方法包括酶解、螯合和沉淀步骤，其中：酶解步骤包括在鱼骨中加入碱性蛋白酶酶解，然后加入木瓜蛋白酶酶解，制成骨胶原肽；螯合步骤包括在骨胶原肽溶液中加入钙源进行螯合反应；沉淀步骤包括将螯合液用无水乙醇进行沉淀，得海洋骨胶原肽钙螯合物。

在实现本发明制备方法的一个具体的实施方案中，本发明的方法包括如下步骤：

(1)原料预处理：将鱼骨绞碎，加入碱水进行乳化，

(2)酶解：加入碱性蛋白酶，在55℃，pH＝8.5条件下，酶解2～3h，然后温度降至40℃，调节pH＝6.5，加入木瓜蛋白酶，在60℃下反应1.5～2h，灭酶4～5min，制成骨胶原肽，

(3)螯合：在骨胶原肽溶液中加入钙源，使骨胶原肽与钙源质量比为5∶1～3∶1，调节反应液pH值为4～7，温度保持在40℃～70℃下反应40～80min，

(4)乙醇沉淀：将反应液冷却，加入无水乙醇进行沉淀，得海洋骨胶原肽钙螯合物沉淀液，

(5)沉淀收集：将沉淀液液过滤，收集沉淀，获得海洋骨胶原肽螯合钙。

本发明的方法中，步骤(1)的原料预处理，可以加入5～8倍体积的pH8.5～9.5的碱水，在40～50℃下进行乳化。乳化的作用是便利于后面的酶解处理，提高酶解效率。

本发明的方法中，步骤(2)的酶解，加入碱性蛋白酶时，原料与碱性蛋白酶的质量比可以为500∶1～500∶1.5；加入木瓜蛋白酶时，原料与加入木瓜蛋白酶的质量比可以为500∶2～500∶3。

本发明的方法中，步骤(3)的螯合，钙源优选选自氯化钙或氢氧化钙。其他钙源也是可以的，只要是可溶性钙，例如硫酸钙。

本发明的方法中，步骤(4)的乙醇沉淀，可以是加入螯合液2～4倍体积的无水乙醇进行沉淀。

本发明的方法中，步骤(5)的沉淀收集，可以将收集的沉淀用无水乙醇洗涤，获得海洋骨胶原肽螯合钙。

本发明的方法中，在螯合步骤之后，进行乙醇沉淀步骤之前，可以将螯合液在45℃～55℃下进行浓缩，以便更有利于随后的乙醇沉淀效果。

在实现本发明制备方法的另一个具体的实施方案中，其他步骤与上一个实施方案一致，只是将酶解后得到的骨胶原肽，干燥制成海洋骨胶原肽粉，然后再将此海洋骨胶原肽粉重新配制成多肽溶液，用配置的多肽溶液与钙源进行螯合反应、沉淀，得海洋骨胶原肽钙螯合物沉淀物。

这个实施方案的一个优选具体步骤包括如下：

原料预处理：称取一定量的新鲜鱼骨，用清水反复清洗。清洗干净后绞碎，加入5-8倍体积的碱水(pH8.5-9.5)，在40-50℃下进行乳化。

酶解：将乳化后的原料移入酶解罐，加热至55℃，调节pH＝8.5。加入碱性蛋白酶，原料与酶以500∶1-500∶1.5的质量混合。55℃，pH＝8.5的条件下，酶解2-3h。然后温度降至40℃，调节pH＝6.5，加入木瓜蛋白酶，原料与酶以500∶2-500∶3的质量比混合。温度调至60℃，反应1.5-2h。100℃灭酶4-5min。

喷雾干燥：将鱼骨胶原肽澄清液蒸发浓缩至固形物含量为30-50％。使用离心式喷雾干燥机干燥鱼骨胶原肽。得到淡黄色粉末状海洋骨胶原肽。

多肽溶液的配制：称取一定量的海洋骨胶原肽，加入蒸馏水，海洋骨胶原肽与蒸馏水以2∶100-6∶100的质量比混合，制备得到浓度为2％-6％的多肽溶液。

螯合钙离子：称取一定质量的氯化钙，使混合溶液中多肽与氯化亚铁的质量比为5∶1-3∶1。加入酸调整pH值为4-7，搅拌使其充分溶解，将反应液置于密闭反应器中，40℃-70℃下反应40-80min。

浓缩：反应液静置冷却，置于真空浓缩设备中，在45℃-55℃下利用真空浓缩设备对反应液进行浓缩。

产品纯化及干燥：在按照1∶4-1∶2的体积比向浓缩液中加入无水乙醇，放置在室温中沉淀4-6h，真空抽滤收集沉淀并，用无水乙醇洗涤除去游离钙离子，通过干燥得到海洋骨胶原肽钙螯合物固体粉末。

本发明的鱼骨可以来源于任何海洋鱼类的骨头，例如三文鱼，鮟鱇鱼等。

溶解性实验表明，海洋骨胶原肽微溶于中性水溶液，在偏酸性条件下溶解度增加。溶液澄清透明，呈淡黄色。

对本发明海洋骨胶原肽螯合钙离子前后的红外光谱进行谱图对比，傅里叶红外光谱分析表明：3066mc^-1处出现吸收峰(OH与NH伸缩振动频率重叠)，同时在925mc^-1一处有吸收峰，说明含有-COOH结构；1315mc^-1处，出现吸收峰(偏磷酸盐PO₂反对称伸缩)；1085mc^-1处出现强吸收峰。螯合物傅里叶红外光谱图3066mc^-1处吸收峰变窄，且925mc^-1处吸收峰消失，说明钙离子与海洋骨胶原肽在-COOH位置结合。3200-3000mc^-1有宽吸收峰，而螯合后此处吸收峰变窄，并向高波位移动，且在1085mc^-1处出现强吸收峰，说明Ca²⁺与氨基结合。这个实验不仅验证说明制备海洋骨胶原肽钙螯合物工艺的可行性，而且证明制备的螯合物是不同于海洋骨原肽的一种新物质。

因此，本发明还提供一种通过本发明方法或任一种优选方法制备而成的海洋骨胶原肽钙螯合物。

由于海洋骨原肽主要是鱼骨胶原蛋白的酶水解产物，因此本发明的海洋骨胶原肽钙螯合物易于吸收和利用，能够为机体骨骼胶原蛋白的更新提供优质而且必需的氮源营养物质。与陆生动物来源的骨胶原蛋白肽相比，海洋骨原肽具有来源安全的特点，无疯牛病、口蹄疫、寄生虫传染等危害，同时可以避免一些宗教习惯和生活习俗的限制。

营养和功能上，由于海洋骨原肽来源于海洋鱼骨，在功能肽结构组成以及氨基酸序列上均具有陆生动物不可比拟的优势。特别是，海洋鱼骨胶原低聚肽具有促进钙质吸收、增加骨密度，能够促进人体骨胶原蛋白的合成，可以改善骨质疏松。将海洋鱼胶原低聚肽与钙质进行螯合，可以充分利用海洋骨原肽自身的优势，可以进一步促进骨细胞和新骨形成，增加骨钙沉积。

通过对骨质疏松患者的研究发现，食用本发明海洋骨胶原肽钙螯合物营养制剂的患者在试验结束后，自觉症状和体征均有不同程度的改善或消失，在改善骨质疏松的效果方面，优于陆生动物来源蛋白肽或水解物的钙螯合产品，也优于单纯补充钙剂。

本发明的海洋骨胶原肽钙螯合物可以按照常规技术制备成口服液、片剂、胶囊、口服颗粒剂等剂型。

附图说明

图1是本发明方法制备的海洋骨胶原肽钙螯合物的海洋骨胶原肽螯合钙离子前后的红外光谱的谱图对比，横坐标是红外波长，纵坐标是透光率。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。

实施例1

原料预处理：称取1.0kg新鲜三文鱼骨，用清水反复清洗。清洗干净后绞碎，加入7倍体积的碱水(pH＝9)，在50℃下进行乳化。

酶解：将乳化后的原料移入酶解罐，加热至55℃，调节pH＝8.5。加2.2g碱性蛋白酶，混合均匀。55℃，pH＝8.5的条件下，酶解3h。然后温度降至40℃，调节pH＝6.5，加入5.0g木瓜蛋白酶，混合均匀。温度调至60℃，反应2h。100℃灭酶5min。

喷雾干燥：将鱼骨胶原肽澄清液蒸发浓缩至固形物含量为30-50％。使用离心式喷雾干燥机干燥鱼骨胶原肽。得到淡黄色粉末状海洋骨胶原肽。

多肽溶液的配置：称取4.0g的海洋骨胶原肽于反应器中，加入100mL蒸馏水搅拌溶解，得浓度为4.0％重量百分比的多肽溶液。

钙离子螯合：称取1.0g氯化钙固体，溶解于多肽溶液中，使其浓度达到1.0％重量百分比。，搅拌溶解。加入盐酸调节pH为6，将反应液置于60℃反应罐中，反应1h。

浓缩：反应液静置冷却，置于真空浓缩设备中，利用真空浓缩设备在45℃-55℃下浓缩反应液。

产品纯化及干燥：向浓缩液中以1∶3的体积比加入无水乙醇，进行乙醇沉淀，静置4h，并用无水乙醇洗涤。在50℃下真空干燥30min，得到海洋骨胶原肽钙螯合物原粉。

试验表明，所得海洋骨胶原肽钙螯合物原粉呈淡黄色粉末状。不溶于中性水溶液中，片酸性条件下溶解度逐渐增加。

实施例2

原料预处理：称取2.0kg金枪鱼骨，用清水反复清洗。清洗干净后绞碎，加入7倍体积的碱水(pH＝9)，在50℃下进行乳化。

酶解：将乳化后的原料移入酶解罐，加热至55℃，调节pH＝8.5。加入5.0g碱性蛋白酶，混合均匀。55℃，pH＝8.5的条件下，酶解3h。然后温度降至40℃，调节pH＝6.5，加入10.0g木瓜蛋白酶，混合均匀。温度调至60℃，反应2h。100℃灭酶5min。

钙离子螯合：称取1.5g氢氧化钙固体，溶解于多肽溶液中，使其浓度达到1.5％重量百分比。，搅拌溶解。加入盐酸调节pH为6，将反应液置于60℃反应罐中，反应1h。

浓缩：反应液静置冷却，置于真空浓缩设备中，利用真空浓缩设备在45℃-55℃下浓缩反应液。

产品纯化及干燥：向浓缩液中以1∶3的体积比加入无水乙醇，进行乙醇沉淀，静置4h，并用无水乙醇洗涤。在50℃下真空干燥30min，得到海洋骨胶原肽钙螯合物原粉。

实施例3

将实施例1制备的海洋骨胶原螯合钙粉通过傅里叶红外光谱仪，扫描的红外光谱。

海洋骨胶原肽钙螯合物傅立叶红外光谱检测分析结果，傅里叶红外光谱分析表明：3066mc^-1处出现吸收峰(OH与NH伸缩振动频率重叠)，同时在925mc^-1一处有吸收峰，说明含有-COOH结构；1315mc^-1处，出现吸收峰(偏磷酸盐PO₂反对称伸缩)；1085mc^-1处出现强吸收峰。螯合物傅里叶红外光谱图3066mc^-1处吸收峰变窄，且925mc^-1处吸收峰消失，说明钙离子与海洋骨胶原肽在-COOH位置结合。3200-3000mc^-1有宽吸收峰，而螯合后此处吸收峰变窄，并向高波位移动，且在1085mc^-1处出现强吸收峰，说明Ca²⁺与氨基结合。这个实验不仅验证说明制备海洋骨胶原肽钙螯合物工艺的可行性，而且证明制备的螯合物是不同于海洋骨原肽和氯化钙的一种新物质。

Claims (3)

1.一种海洋骨胶原肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)原料预处理：将鱼骨绞碎，加入5～8倍体积的pH8.5～9.5的碱水，在40～50℃下进行乳化；

(2)酶解：按原料与碱性蛋白酶的质量比为500∶1～500∶1.5的比例加入碱性蛋白酶，在55℃，pH＝8.5的条件下，酶解2～3h，然后温度降至40℃，调节pH＝6.5，按原料与木瓜蛋白酶的质量比为500∶2～500∶3的比例加入木瓜蛋白酶，在60℃下反应1.5～2h，灭酶4～5min，制成骨胶原肽溶液；

(3)螯合：在骨胶原肽溶液中加入钙源，使骨胶原肽与钙源质量比为5∶1～3∶1，调节反应液pH值为4～7，温度保持在40℃～70℃下反应40～80min，所述钙源选自氯化钙或氢氧化钙；

(4)乙醇沉淀：将反应液冷却，加入无水乙醇进行沉淀，得海洋骨胶原肽钙螯合物沉淀液；

(5)沉淀收集：将沉淀液过滤，收集沉淀，获得海洋骨胶原肽钙螯合物。

2.如权利要求1所述的一种海洋骨胶原肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)的乙醇沉淀中，加入螯合液2～4倍体积的无水乙醇进行沉淀，步骤(5)的沉淀收集中，将收集的沉淀用无水乙醇洗涤，获得海洋骨胶原肽钙螯合物。

3.如权利要求1-2任一项所述的一种海洋骨胶原肽钙螯合物的制备方法，其特征在于，在螯合步骤之后，进行乙醇沉淀步骤之前，将螯合液在45℃～55℃下进行浓缩。

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