CN109371089A - 一种小分子肝肽的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种小分子肝肽的提取方法，包括以下步骤：步骤一、将动物肝脏搅碎，加入纯化水，搅拌均匀，升温至54～58℃，加入脂肪酶和中性蛋白酶，搅拌酶解25‑35min，得第一酶解液；步骤二、向所述第一酶解液中加入风味蛋白酶、鸡肠消化道蛋白酶和酶激活剂，搅拌均匀，降温至15～20℃，酶解提取2～3次，每次酶解时间为1～1.5h，合并各次提取液，得第二酶解液；步骤三、将所述第二酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，浓缩，冻干，得小分子肝肽冻干粉。本发明制备的肝肽产品的纯度高，肽分子量为180～500道尔顿的肽含量可达到99％以上，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物肽分离技术领域，尤其涉及一种小分子肝肽的提取方法。
背景技术
肝脏是动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面起着去氧化、储存肝糖、分泌性蛋白质的合成等作用。牛肝、猪肝、鸡肝等动物肝脏含有丰富的蛋白质、糖类、矿物质和维生素等营养物质。肝脏多肽可以作为一种良好的医药化工原料和功能性食品，据报道，肝脏多肽具有天然的生物活性，能够提高机体的免疫力，还具有抗氧化，促进凝血以及抑制肿瘤生长等功能。
小分子肽是多肽的一种分类，分子量段一般在1000道尔顿以下，也称作小肽、低聚肽或小分子活性肽，一般由2～6个氨基酸组成，相比于分子量较大的蛋白，其具有不需要消化、直接吸收，吸收时不需要消耗人体能量、不会增加人体胃肠功能负担的优点，此外其还具有载体的功能，能将人体内的其它营养载在其本体上，输送到人体的细胞、组织内，因此，受到了越来越多的关注。但是，现有的小分子多肽的提取工艺存在蛋白提取效率较低，提取的小分子肽中杂质含量较多以及产品分子量分布广的缺陷。因此，研究一种蛋白提取效率高、小分子肽含量高的肝肽提取工艺对实现动物肝脏中多肽的综合开发具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有小分子肝肽提取工艺中蛋白提取效率低以及提取的小分子多肽含量较低以及产品分子量分布广的问题，本发明提供一种小分子肝肽的提取方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种小分子肝肽的提取方法，包括以下步骤：
步骤一、将动物肝脏搅碎，加入纯化水，搅拌均匀，升温至54～58℃，加入脂肪酶和中性蛋白酶，搅拌酶解25-35min，得第一酶解液；
步骤二、向所述第一酶解液中加入风味蛋白酶、鸡肠消化道蛋白酶和酶激活剂，搅拌均匀，降温至15～20℃，酶解提取2～3次，每次酶解时间为1～1.5h，合并各次提取液，得第二酶解液；
步骤三、将所述第二酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，浓缩，冻干，得小分子肝肽冻干粉。
相对于现有技术，本发明提供的小分子肝肽的提取方法，首先加入脂肪酶和内切酶中性蛋白酶进行初步酶解，获得初步酶解液，然后向初步酶解液中加入风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶进行深度酶解，通过两次酶解可对肽链进行更高效、更广谱地酶剪切，得到分子量分布较为集中的小分子量的肝肽，提高小分子肝肽的提取率；本发明中加入的酶激活剂可提高风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶的活性，从而达到在较低温度下提取小分子肝肽的目的，既保证了肝脏蛋白的充分酶解，又保证了不影响小分子肝肽的生物活性；通过多次低温提取，可进一步提高小分子肝肽的提取率。本发明提供的小分子肝肽的提取方法可操作性强，酶解得到的小分子肝肽分子量小，活性高，小分子肝肽的提取率(小分子肝肽占肝脏中总蛋白质的含量)可达到87％以上，产品中分子量在500～180的小分子肽的含量可达到99％以上。
本发明中加入的鸡肠消化道蛋白酶是取自鸡肠消化道的蛋白酶，由多种蛋白酶组成，鸡对食物有强于一般动植物的消化吸收能力，因此可以对肝脏蛋白进行更高效的酶解，对肽链的多个位点进行更加高效、广谱地酶切，经鸡肠消化道蛋白酶分解的蛋白，可以产生大量、种类繁多的小分子量的多肽，提高小分子肝肽的收得率。
本发明中所述中性蛋白酶为枯草杆菌中性蛋白酶，所述脂肪酶由假丝酵母菌发酵得到。
优选的，步骤一中，所述纯化水的加入量为原料重量的5～6倍。
优选的，步骤一中，所述脂肪酶的加入量为原料重量的0.8～1.2％，所述中性蛋白酶的加入量为原料重量的1～1.5％。
加入脂肪酶和中性蛋白酶进行初步酶解，有利于第二次低温酶解的进行，优选的脂肪酶和中性蛋白酶的加入量既保证高效酶解，还能避免蛋白酶的浪费。
优选的，步骤二中，所述鸡肠消化道蛋白酶制备方法包括如下步骤：将鸡肠洗净，制成浆状，加入鸡肠重量8～12倍量的0.9wt％的氯化钠溶液，4～6℃超声提取1～2h，离心分离，取上清液，透析除盐，冷冻干燥，得鸡肠消化道蛋白酶。
0.9wt％的氯化钠溶液可促进蛋白质的溶解，同时盐离子还可以与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变形的优点。
优选的鸡肠消化道蛋白的提取方法提取效率高，还能最大限度地保持鸡肠消化道蛋白酶的活力。
优选的，步骤二中，所述酶激活剂为维生素B1和硫酸镁的混合物；其中，所述维生素B1和硫酸镁的质量比为1:10～15。
优选的维生素B1和硫酸镁的质量比可使酶激活剂在用量较小的情况下，最大限度的提高风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶的酶活性，提高酶解效率。
优选的，步骤二中，所述酶激活剂的加入量为所述风味蛋白酶和所述鸡肠消化道蛋白酶总重量的0.5～1％。
维生素B1和硫酸镁的混合物能提高风味蛋白酶和鸡肠蛋白酶的活性，使风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶即使在低温条件下也具有较高的酶活性，不但保证肝脏蛋白的充分酶解，还尽量避免了由于温度对小分子肝肽活性的影响。
酶激活剂的加入量过小不能有效提高风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶的活性，用量过多会抑制风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶的活性。
优选的，步骤二中，所述风味蛋白酶的加入量为原料重量的0.3～0.5％，所述鸡肠消化道蛋白酶的加入量为原料重量的1.5～2％。
风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶协同作用，可提高蛋白转化为多肽的转化率，提高小分子肽的收得率，同时还能缩短酶解时间。同时，风味蛋白酶还可将苦味肽上的疏水氨基酸切除，脱除苦味，使产品口感更好，充分满足食品和保健品原料的要求。
优选的风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶的加入量既保证高效酶解，还能避免蛋白酶的浪费。
可选的，步骤三中，将所述第二酶解液加热升温至90～95℃，保温10～15分钟进行酶灭活。
优选的，步骤三中分离纯化的具体步骤为：将灭活后的酶解液依次经卧螺离心机和三相离心机离心，收集上清液，将所述上清液经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤。
卧螺离心机适合粘稠液体的过滤，比板框过滤机效率更高，通过卧螺离心机初步过滤除去不溶物，然后通过三相离心机除去酶解液中的油脂和其它悬浮物，可以提高过滤效率，提高小分子肝肽的纯度。
将分离以后得到的酶解液进一步经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤，可以除去酶解液中掺杂的单个氨基酸、盐类物质和少量活性较低的大分子蛋白和多肽，进一步提高小分子肝肽产品的纯度，获得分子量分布范围集中的小分子肝肽，使分子量为180～500道尔顿的肽含量达到99％以上，同时避免由于多肽中由于盐类物质的存在而造成的小分子肝肽口感较差问题的出现，还能更好使滤液浓缩，节省后续工序浓缩时间，降低能耗。
优选的，步骤三中，所述冻干的具体步骤为：将浓缩液于-43～-47℃预冻1.25～1.35h，得预冻粉；将所述预冻粉于真空度为0.1～0.13mbar，温度为-20～-42℃的条件下，冻干7.8～8.3h，得第一冻干粉；将所述第一冻干粉解冻后，于真空度为0.15mbar～0.25mbar，温度为-10℃～-30℃的条件下，再次冻干2.5-3.5h，得小分子肝肽冻干粉。
通过上述冻干方法可以更好地保持小分子肝肽的活性，提高储存稳定性，延长储存期限。
本发明还提供了一种小分子肝肽，由上述的小分子肝肽的提取方法制得。
本发明采用脂肪酶和内切酶中性蛋白酶进行初步酶解，获得初步酶解液，然后向初步酶解液中加入风味蛋白酶和鸡肠消化道蛋白酶进行深度低温酶解，并结合离心技术、纳滤技术，使产品99％以上为二肽到五肽的小分子肽，无单个氨基酸和盐分，无五肽以上分子量多肽；制备的小分子肝肽产品能完全溶于水，口感好，无异味，无苦味，能更方便的添加在食品、固体饮料、液态饮品、保健品和药品中，使人体更好的吸收。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种小分子牛肝肽的提取方法：
步骤一、选取新鲜牛肝1000g，搅碎，加入5000ml纯化水搅拌均匀，升温至54℃，加入8g脂肪酶和10g中性蛋白酶，以68r/min的速度搅拌酶解25min，得第一酶解液；
步骤二、向所述第一酶解液中加入3g风味蛋白酶、15g鸡肠消化道蛋白酶和酶激活剂90mg，搅拌均匀，降温至15℃，以68r/min的速度搅拌酶解，反复提取2次，每次酶解1.5h，过滤，合并各次提取液，得第二酶解液；
步骤三、将所述酶解液升温至90℃，灭酶15分钟；灭酶后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3600r/min；再用三相离心机过滤纯化，得纯化液；
步骤四、将所述纯化液依次经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；
步骤五、将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩，将浓缩液于-43℃预冻1.35h，得预冻粉；将所述预冻粉于真空度为0.1mbar，温度为-20℃的条件下，冻干8.3h，得第一冻干粉；将所述第一冻干粉解冻后，于真空度为0.15mbar，温度为-10℃的条件下，再次冻干3.5h，得小分子肝肽冻干粉。
其中，酶激活剂为维生素B1和硫酸镁的混合物；其中，所述维生素B1和硫酸镁的质量比为1:10。
所述鸡肠消化道蛋白酶的制备方法包括如下步骤：将鸡肠洗净，用组织捣碎匀浆机制成浆状，加入鸡肠重量8倍量的0.9wt％的氯化钠溶液，4℃超声提取2h，采用高速离心机以8000r/min的转速进行离心分离，取上清液，采用超滤装置透析除盐，于-20℃冷冻干燥，得鸡肠消化道蛋白酶。
本实施例小分子肝肽的提取率可达到87.16％，第二酶解液中相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子肽在提取的多肽中占比达到88.2％，分子量在500-180道尔顿的小分子肽在提取的多肽中占比可达到69.4％，制备得到的小分子肝肽冻干粉中相对分子质量500～180道尔顿的小分子肽含量为99.2％。
实施例2
一种小分子猪肝肽的提取方法：
步骤一、选取新鲜猪肝10Kg，搅碎，加入55L纯化水搅拌均匀，升温至56℃，加入100g脂肪酶和120g中性蛋白酶，以68r/min的速度搅拌酶解30min，得第一酶解液；
步骤二、向所述第一酶解液中加入40g风味蛋白酶、180g鸡肠消化道蛋白酶和酶激活剂1.76g，搅拌均匀，降温至18℃，以68r/min的速度搅拌酶解，反复提取3次，每次酶解1h，过滤，合并各次提取液，得第二酶解液；
步骤三、将所述酶解液升温至92℃，灭酶12分钟；灭酶后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3600r/min；再用三相离心机过滤纯化，得纯化液；
步骤四、将所述纯化液依次经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；
步骤五、将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩，将浓缩液于-45℃预冻1.35h，得预冻粉；将所述预冻粉于真空度为0.11mbar，温度为-30℃的条件下，冻干8h，得第一冻干粉；将所述第一冻干粉解冻后，于真空度为0.2mbar，温度为-20℃的条件下，再次冻干3h，得小分子肝肽冻干粉。
其中，酶激活剂为维生素B1和硫酸镁的混合物；其中，所述维生素B1和硫酸镁的质量比为1:12。
所述鸡肠消化道蛋白酶的制备方法包括如下步骤：将鸡肠洗净，用组织捣碎匀浆机制成浆状，加入鸡肠重量10倍量的0.9wt％的氯化钠溶液，5℃超声提取1.5h，采用高速离心机以8000r/min的转速进行离心分离，取上清液，采用超滤装置透析除盐，于-20℃冷冻干燥，得鸡肠消化道蛋白酶。
本实施例小分子肝肽的提取率可达到88.08％，第二酶解液中相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子肽在提取的多肽中占比达到87.5％，分子量在500-180道尔顿的小分子肽在提取的多肽中占比可达到69.8％，制备得到的小分子肝肽冻干粉中相对分子质量500～180道尔顿的小分子肽含量为99.1％。
实施例3
一种小分子鸡肝肽的提取方法：
步骤一、选取新鲜鸡肝100Kg，搅碎，加入600L纯化水搅拌均匀，升温至58℃，加入1.2Kg脂肪酶和1.5Kg中性蛋白酶，以68r/min的速度搅拌酶解35min，得第一酶解液；
步骤二、向所述第一酶解液中加入500g风味蛋白酶、2Kg鸡肠消化道蛋白酶和酶激活剂25g，搅拌均匀，降温至20℃，以68r/min的速度搅拌酶解，反复提取3次，每次酶解1.5h，过滤，合并各次提取液，得第二酶解液；
步骤三、将所述酶解液升温至95℃，灭酶10分钟；灭酶后用卧锣离心机过滤去除酶解残渣，卧螺离心机的转速为3600r/min；再用三相离心机过滤纯化，得纯化液；
步骤四、将所述纯化液依次经纳滤膜为0.2纳米的纳滤机过滤，留取未透过部分，然后用纳滤膜为0.5纳米的纳滤机再次过滤，留取透过液；
步骤五、将所述透过液用双效浓缩器进一步浓缩，将浓缩液于-47℃预冻1.25h，得预冻粉；将所述预冻粉于真空度为0.13mbar，温度为-42℃的条件下，冻干7.8h，得第一冻干粉；将所述第一冻干粉解冻后，于真空度为0.25mbar，温度为-30℃的条件下，再次冻干2.5h，得小分子肝肽冻干粉。
其中，酶激活剂为维生素B1和硫酸镁的混合物；其中，所述维生素B1和硫酸镁的质量比为1:15。
所述鸡肠消化道蛋白酶的制备方法包括如下步骤：将鸡肠洗净，用组织捣碎匀浆机制成浆状，加入鸡肠重量12倍量的0.9wt％的氯化钠溶液，6℃超声提取1h，采用高速离心机以8000r/min的转速进行离心分离，取上清液，采用超滤装置透析除盐，于-20℃冷冻干燥，得鸡肠消化道蛋白酶。
本实施例小分子肝肽的提取率可达到89.21％，第二酶解液中相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子肽在提取的多肽中占比达到89.7％，分子量在500-180道尔顿的小分子肽在提取的多肽中占比可达到70.3％，制备得到的小分子肝肽冻干粉中相对分子质量500～180道尔顿的小分子肽含量为99.7％。
对比例1
本对比例提供一种小分子肝肽的提取方法，提取方法与实施例4相同，不同的是步骤二为：向所述第一酶解液中加入2.5Kg风味蛋白酶和酶激活剂25g，搅拌均匀，降温至20℃，以68r/min的速度搅拌酶解，反复提取3次，每次酶解1.5h，过滤，合并各次提取液，得第二酶解液。
本对比例中酶激活剂与实施例3相同。
本对比例中小分子肝肽的提取率为73.23％，第二酶解液中相对分子质量在1000道尔顿以下的小分子肽在提取的多肽中占比达到72.8％，分子量在500-180道尔顿的小分子肽在提取的多肽中占比可达到51.6％。
普通工艺制备的蛋白肽中，分子量在500道尔顿以下的短肽比例一般在30-40％，通过本发明提供的采用特定的靶向酶分步水解的方法，提高了二肽至五肽的收得率，本发明工艺得到的酶解液中分子量在180-500道尔顿的短肽在提取的多肽中的比例可达69％以上，最终产品中分子量在180-500道尔顿的短肽的比例可达99％以上。且生产周期短，生产成本低，制备过程不产生任何有毒有害物质，制备的肝肽产品能完全溶于水，口感好，无异味，无苦味，可广泛应用于食品、保健品、药品等领域，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种小分子肝肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将动物肝脏搅碎，加入纯化水，搅拌均匀，升温至54～58℃，加入脂肪酶和中性蛋白酶，搅拌酶解25-35min，得第一酶解液；
步骤二、向所述第一酶解液中加入风味蛋白酶、鸡肠消化道蛋白酶和酶激活剂，搅拌均匀，降温至15～20℃，酶解提取2～3次，每次酶解时间为1～1.5h，合并各次提取液，得第二酶解液；
步骤三、将所述第二酶解液加热升温进行酶灭活，分离纯化，浓缩，冻干，得小分子肝肽冻干粉。
2.如权利要求1所述的小分子肝肽的提取方法，其特征在于，步骤一中，所述纯化水的加入量为原料重量的5～6倍；和/或
所述脂肪酶的加入量为原料重量的0.8～1.2％，所述中性蛋白酶的加入量为原料重量的1～1.5％。
3.如权利要求1所述的小分子肝肽的提取方法，其特征在于，步骤二中，所述鸡肠消化道蛋白酶制备方法包括如下步骤：将鸡肠洗净，制成浆状，加入鸡肠重量8～12倍量的0.9wt％的氯化钠溶液，4～6℃超声提取1～2h，离心分离，取上清液，透析除盐，冷冻干燥，得鸡肠消化道蛋白酶。
4.如权利要求1或3所述的小分子肝肽的提取方法，其特征在于，步骤二中，所述酶激活剂为维生素B1和硫酸镁的混合物；其中，所述维生素B1和硫酸镁的质量比为1:10～15。
5.如权利要求4所述的小分子肝肽的提取方法，其特征在于，步骤二中，所述酶激活剂的加入量为所述风味蛋白酶和所述鸡肠消化道蛋白酶总重量的0.5～1％。
6.如权利要求5所述的小分子肝肽的提取方法，其特征在于，步骤二中，所述风味蛋白酶的加入量为原料重量的0.3～0.5％，所述鸡肠消化道蛋白酶的加入量为原料重量的1.5～2％。
7.如权利要求1所述的小分子肝肽的提取方法，其特征在于，步骤三中，将所述第二酶解液加热升温至90～95℃，保温10～15分钟进行酶灭活。
8.如权利要求1所述的小分子肝肽的提取方法，其特征在于，步骤三中分离纯化的具体步骤为：将灭活后的酶解液依次经卧螺离心机和三相离心机离心，收集上清液，将所述上清液经截留分子量为180-500道尔顿的纳滤膜纳滤。
9.如权利要求1所述的小分子肝肽的提取方法，其特征在于，步骤三中，所述冻干的具体步骤为：将浓缩液于-43～-47℃预冻1.25～1.35h，得预冻粉；将所述预冻粉于真空度为0.1～0.13mbar，温度为-20～-42℃的条件下，冻干7.8～8.3h，得第一冻干粉；将所述第一冻干粉解冻后，于真空度为0.15～0.25mbar，温度为-10～-30℃的条件下，再次冻干2.5-3.5h，得小分子肝肽冻干粉。
10.一种小分子肝肽，其特征在于，所述小分子肝肽由权利要求1-9任一项所述的小分子肝肽的提取方法制得。
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