CN103230020B - 一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法 - Google Patents

一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提高一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法。所述方法为：将原料蛋白与水混合细化处理并杀菌后，加入蛋白水解酶进行第一次水解，将第一次水解后分离的液体部分采用截留分子量为1000～6000Da超滤膜进行超滤，并将超滤膜非透过的大分子肽液和第一次水解分离的固相部分混合后加入蛋白水解酶进行第二次水解，并将两次水解超滤后的小分子低聚肽液经纯化后加入氢氧化钙或氯化钙螯合，完毕后定量的碳酸钠在pH为中性时完全反应，过滤除去沉淀，再依次经过纳滤膜脱盐、杀菌、浓缩、干燥后得到蛋白质短肽螯合钙产品。本发明大大提高了蛋白质短肽的得率和原料蛋白的利用率，降低生产成本，所得到的蛋白质短肽螯合钙产品质量好，生产安全性高。

Description

一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法
技术领域
本发明涉及一种螯合钙，具体是一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法。
背景技术
钙是人体含量最多的矿质元素之一，也是体内最活跃的元素，具有多种重要的生理功能，是维持神经和肌肉正常兴奋所必须的成分，也是保证骨骼生长和维持骨质硬度说必须的物质。然后，缺钙属于全球性的健康，最新《中国居民营养与健康状况调查》结果表明，我国约有97％的人群缺钙，大部分人属于一般性缺钙，少数人则属于严重缺钙,全国平均每人每日仅为391mg。缺钙的现象在儿童、妇女和老人中比较普遍，有资料表明，我国某些地区3岁以下儿童佝偻病的患病率平均为40％；全国有2亿妇女患有骨质增生及骨质疏松症，孕妇缺钙人数为监测对象的100％；我国80岁以上的老年人口约1900万，以及1.6亿的老年人都属于骨质疏松重度发生人群。
缺钙会给人体造成严重的危害，儿童长期缺钙将导致生长发育缓慢，身体矮小，牙齿不全，易患佝偻病，并有昼惊夜啼、烦躁多动和多汗、抽筋等症状。青年人缺钙将导致骨质钙化不良，骨骼软化，易弯曲，并可导致四肢、脊柱、胸廓和盆腔畸形，在压力作用下易发生病理性骨折。中老年人和绝经期的妇女缺钙易发生骨质疏松、骨质增生、背下部疼痛，易发生生理性骨折，并有高血压、肥胖病、大肠癌等疾病发生的可能。孕妇缺钙不利于胎儿正常生长、骨骼钙化、牙齿形成，孕妇妊娠、分娩、产后哺乳期中由于大量消耗钙，必须及时补充足够的钙。
目前，国内市场上口服钙剂品种繁多，但大体上分为有机钙和无机钙两种类型，有机钙主要有葡萄糖酸钙、乳酸钙、醋酸钙、柠檬酸钙、果糖酸钙、氨基酸钙、L-苏糖酸钙、三羟基丁酸钙等，其优点是溶度高，胃肠刺激小。无机钙：如磷酸钙、碳醋钙、氯化钙、氢氧化钙等，优点是含钙量较高，但水溶性不如有机钙，且胃肠反应较大，如恶心、呕吐、腹胀等。很多钙源都不同程度地存在着副作用，如氯化钙对胃肠有较大的毒副作用，只能通过注射方能用于应急状态下的补钙；醋酸钙的急性毒性较大，可引起高钙血症、痉挛、软组织及血管钙化、肾结石等病变；氧化钙的强碱性，使其具有明显的急性毒性；碳酸钙要消耗大量的胃酸而造成对胃肠道的损伤。
近几年来，国内学者关注螯合钙的研究，祝德义等(2005)对胶原多肽和Ca2+的结合行为进行了研究。结果表明：胶原多肽和Ca2+之间既有羧基与氨基的配位结合，又有羧基的离子键结合，还有一定吸附作用。菅景颖(2007)选用猪皮为原料，采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解提取胶原多肽，对影响酶作用的pH值、温度、酶浓度、底物浓度、时间等因素进行单因素和正交试验，得出水解的最佳工艺条件。并以葡萄糖酸钙、碳酸钙为阳性对照研究胶原多肽螯合钙在防治骨质疏松和壮骨方面的效果。结果表明：胶原多肽螯合钙无论是在对骨质疏松的防治中还是在促进骨骼生长、壮骨作用中，其效果均优于葡萄糖酸钙和碳酸钙，是一种优良的功能性补钙制剂。付文雯(2010年)以水解度和可溶性多肽得率为指标，通过对木瓜蛋白酶、A1398中性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶的水解效果进行比较。并选用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶来对牛骨进行分步酶解。复合酶解最佳工艺为t＝2：2，E/S＝2：2，T＝55℃，酶解顺序：先碱性蛋白酶后木瓜蛋白酶。经葡聚糖凝胶G-25分离，可将酶解液分成四个组分，分子量大概分布在117—81283Da之间，主要以4000Da左右的小肽为主。对以上四个组分分别进行收集，测其与钙的螯合率，发现分子量小于4000Da的小肽(主要是II，III，Ⅳ组分)螯合率明显高于81283Da的肽段(I组分)。
进一步研究发现，低分子短肽与钙的螯合物具有更好的溶解性、吸收性。中国专利申请号为201010220253.1，发明名称为一种胶原多肽螯合钙的制备方法，申请号200910063282.9,发明名称为一种由低值淡水鱼骨制备符合氨基酸螯合钙的方法，专利申请号201110412878.2，发明名称为一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法，及专利申请号201110412900.3的一种低分子量羊骨胶原多肽钙螯合物微胶囊的制备方法的发明专利中，分别公开了采用明胶、鱼骨、猪骨及羊骨胶原蛋白制备螯合钙的方法，专利申请号：CN201110295057.5一种鱼骨小分子多肽螯合钙及制备方法介绍了鱼骨蒸煮、捣碎、复合蛋白酶水解、离心分离、3ku的过滤膜超滤，与鱼骨粉与复合酸溶液鱼骨钙液螯合，干燥,得鱼骨小分子多肽螯合钙粉。
在现有公开的蛋白肽螯合钙制备方法中，都包括蛋白肽的制备方法，但存在以下不足：一是没有考虑到肽分子量大小对螯合钙性质的影响，如水溶解性，在蛋白肽螯合钙的制备中，分子量大的肽形成螯合钙后，其水溶解性降低，并出现沉淀，这样会影响螯合钙在体内的吸收，目前，在已有的蛋白肽制备方法中，蛋白肽，尤其是2肽、3肽等短肽的比例低，大分子量的肽比例比较高，影响了产品的水溶解性和螯合钙的生物利用率；其二，现有的蛋白肽的制备方法中，没有或很少考虑到蛋白肽的得率，蛋白短肽的制备率较低，这样会增加生产的原料成本，同样的蛋白原料在制备蛋白质短肽螯合钙的生产率也随之降低，产品成本高，增加了消费者的负担。
除此之外，在蛋白肽与钙的螯合过程中，为了提高螯合效率和提高螯合度，即单位重量螯合钙产品中螯合钙的量，除了蛋白肽的性质、螯合工艺中的温度、时间、pH等参数条件外，需要足够的可溶性钙才有利于提高产品中螯合钙的量。因此，在螯合反应中，为了提高螯合钙在产品中的比例，通常需要加入过量的可溶性钙，如氯化钙、氢氧化钙等。由于氯化钙、氢氧化钙对人体胃肠有比较严重的副作用，因此，在螯合反应完成后，需要去除溶液中多余的氯化钙、氢氧化钙。现有采用氯化钙或氢氧化钙制备螯合钙的方法中，均是采用无水乙醇进行沉淀，来除去多余的氯化钙或氢氧化钙，乙醇的浓度需要达到90％以上，才能将螯合反应溶液中的短肽螯合钙沉淀完全，沉淀的蛋白肽螯合钙需要反复用乙醇清洗，清洗干净的蛋白肽螯合钙经干燥得到蛋白肽螯合钙产品，沉淀和清洗用的乙醇经减压蒸馏回收乙醇。这样，在工业化生产中，需要使用大量的酒精，生产成本高，且存在有机溶剂易燃易爆的风险。
发明内容
本发明提供一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，该方法采用二次水解来得到高品质的蛋白质短肽水解液，然后采用过量的可溶性钙来进行螯合，生产的螯合钙产品中钙的含量高，并且采用有效的方法去除螯合过程中多余的氯化钙或氢氧化钙，产品质量好，生产安全性高，大大简化了工艺，节约了成本。
本发明的技术方案：
所述一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)将原料蛋白经过清洗、破碎后与水按重量比1:5～20混合，并将混合物送入胶体磨微细化处理使原料蛋白充分分散均匀形成蛋白质浓度为2％～10％原料液，并对其进行杀菌后加入蛋白水解酶进行第一次水解，第一次水解的条件为：温度30～60℃，pH2～10，时间1.0～6小时，蛋白水解酶与原料蛋白的质量比为1％～10％；
(2)将步骤(1)中第一次水解后的水解液经过离心、过滤后分离出未水解的固相部分和水解液液相部分，并将其分别收集起来；然后将收集的水解液液相部分采用截留分子量为1000～6000Da超滤膜进行超滤，将超滤膜非透过的大分子肽液和透过的小分子低聚肽液分别收集起来；
(3)将步骤(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超滤后收集的非透过的大分子肽液均匀混合形成第二次水解原料液，并加水控制二次水解原料液中蛋白质浓度在1％～10％之间，然后加入蛋白水解酶进行第二次水解，第二次水解的条件为：温度30～60℃，pH2-10，时间1～5小时，蛋白水解酶与二次水解原料液中蛋白质的质量比为1％～10％；
(4)将步骤(3)中二次水解后的水解液经过离心、过滤后采用截留分子量(molecular weight cutoff)为1000～6000Da的超滤膜超滤，将超滤膜透过的小分子低聚肽液收集起来并与步骤(2)中第一次水解液超滤后的透过的小分子低聚肽液一起依次经过纯化，得到分子量小的蛋白质短肽水解液；
(5)在步骤(4)中得到的蛋白质短肽水解液加入氢氧化钙(CaCl2)或氯化钙Ca(OH)2在温度为20-70℃、pH4.0-9.0的条件下螯合20-60min；
(6)测量出步骤(5)中螯合反应完毕后的螯合液中剩余游离钙离子的浓度，根据螯合液中剩余游离钙离子的浓度加入与螯合液中剩余的游离钙离子完全反应量的碳酸钠，在室温下充分搅拌5-15分钟，使碳酸钠与氯化钙或氢氧化钙充分反应形成碳酸钙沉淀，并将完全反应后的螯合液的pH调为中性，然后过滤去除碳酸钙沉淀；其中：定量加入碳酸钠的量也可以适当超过与氯化钙或氢氧化钙反应所需的量，超出量控制在以能完全与氯化钙或氢氧化钙反应为原则，过滤采用板框式过滤法进行过滤；
(7)将步骤(6)中完成反应且pH为中性的螯合液依次采用纳滤膜脱盐、杀菌、浓缩、干燥后得到蛋白质短肽螯合钙产品。
步骤(1)中所用的原料蛋白包括食品级的动物蛋白、植物蛋白或微生物蛋白。其中食品级植物蛋白包括大豆蛋白、玉米蛋白、豌豆蛋白等，食品级动物蛋白包括水生动物蛋白和陆生动物蛋白，食品级动物蛋白包括陆生动物蛋白和水生动物蛋白，包括蛋清蛋白、鸡肉蛋白、猪肉蛋白、牛肉蛋白、牛奶蛋白、昆虫蛋白以及鱼皮胶原蛋白、鱼骨胶原蛋白、鱼肉蛋白、牡蛎蛋白、海参蛋白、贝类蛋白等，微生物蛋白包括酵母蛋白、藻类蛋白等。
在步骤(1)和步骤(3)中所用的蛋白水解酶，包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一种或任意两种的混合物，任意两种混合的比例为1～3:3～1。
步骤(1)中，经胶体磨分散均匀的原料液体在70～100℃，10秒-15分钟时间的条件下采用常压杀菌法杀菌，或在105-121℃，2秒-30秒的条件下超高温短时杀菌法进行杀菌，然后采用板式冷却器冷却到30～60℃后再加入蛋白水解酶进行第一次水解。
步骤(2)和步骤(4)中的离心采用卧螺离心或沉降离心，离心分离出水解的蛋白肽液，再经板框式或滤袋式或滤芯式或陶瓷膜方式的过滤法进行过滤，得到透明度良好的蛋白肽溶液。
在步骤(5)中，螯合时使用的可溶性钙原料为氯化钙时，氯化钙与蛋白质短肽的质量比为1:1-1:3，反应完毕后的螯合液呈酸性，可以加入碱性物质比如氢氧化钠调节螯合液的pH，使其呈中性，产生的盐可以直接通过步骤(7)中的纳滤脱盐的方法脱掉；螯合中使用的可溶性钙原料为氢氧化钙时，氢氧化钙与蛋白质短肽的质量比为1:1-1:2，反应完毕后的螯合液呈碱性，含有少量的氢氧化钠，加入浓度为用浓度在1-3mol/L的盐酸调节螯合液的pH，使其呈中性，反应完毕后的钠盐可以通过步骤(7)中的纳滤脱盐将其脱掉。
在步骤(6)采用EDTA滴定法测定反应完毕的螯合液中游离钙的含量，根据螯合液中存在的游离钙含量，在螯合反应液中定量加入碳酸钠，使氯化钙或氢氧化钙与碳酸钠反应生成碳酸钙沉淀，并使用盐酸(HCl)调节其pH为中性。具体测定方法为：取定量的100ml反应完成的溶液，乙醇沉淀去除蛋白肽螯合钙，过滤去蛋白肽螯合钙，剩余溶液采用EDTA法测游离钙含量方法测定钙的含量。
在步骤(7)中，纳滤脱盐中采用纳滤膜截留分子量在100-300Da，纳滤一遍或多遍，直到氯化钠(NaCl)的含量达到产品要求为止。
在步骤(7)中的杀菌采用在70～100℃，10秒-15分钟时间的条件下常压杀菌法，或在105-121℃，2秒-30秒的条件下超高温短时杀菌法，然后采用板式冷却器冷却到40～60℃，之后采用真空浓缩，温度30～70℃，-0.1Mpa～-0.05Mpa，使浓缩液中固形物含量在20-40％，浓缩好的蛋白质短肽螯合钙液，采用喷雾干燥或冷冻干燥或真空干燥，控制产品中的水分在10％以内。
采用碳酸钠反应去除螯合反应溶液中氯化钙的化学反应如下：
CaCl2+Na2CO3→CaCO3↓+2NaCl
采用碳酸钠反应去除螯合反应溶液中氢氧化钙的化学反应如下：
Ca(OH)2+Na2CO3→CaCO3↓+2NaOH
NaOH+HCl→NaCl+H2O
上述反应中生成的NaCl通过纳滤法去除。
本发明的优点：
1.本发明采用两次水解来制备蛋白质短肽酶水解液，大大提高了蛋白质短肽的得率和原料蛋白的利用率，降低生产成本；
2.本发明采用两次水解来制备蛋白质短肽，提高了2肽、3肽等短肽的得率，普通工艺生成的蛋白肽中，分子量在580Da以下的短肽的比例一般在30％-40％，而采用本工艺生成的蛋白肽中，分子量在580Da以下的短肽的比例可以达到60％-70％，因此，采用本技术生成的蛋白质短肽螯合钙产品的水溶解性明显提高；
3.本发明采用适当过量的可溶性钙来进行螯合，可以使蛋白短肽与可溶性钙充分螯合，生产的螯合钙产品中的钙含量高；
4.本发明采用碳酸钠来去除螯合液中多余的氯化钙和氢氧化钙，可以快速、安全的除掉了螯合液中的氯化钙和氢氧化钙成分，同时，研究表明，添加的碳酸钠不会与已经与蛋白质短肽螯合的钙发生反应，所得到的蛋白质短肽螯合钙产品质量好，生产安全性高，由于省略乙醇沉淀和酒精回收工序，大大简化了工艺，节约了有机溶剂的使用成本，也提高了生产安全性。
具体实施例
工艺流程为：原料蛋白→加水混合→杀菌、冷却→第一次蛋白水解酶水解→第一次水解液分离→第一次分离液超滤→收集第一次水解液分离的固相部分和超滤非透过部分，进行第二次蛋白水解酶水解→第二次水解液分离→第二次分离液超滤→第一次和第二次超滤透过液合并→纯化(脱盐、脱色)→加入可溶性钙离子螯合→定量加入碳酸钠反应→调pH中性→去碳酸钙沉淀→纳滤脱盐→杀菌→浓缩→干燥
实施例一
一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于具体步骤如下：(1)将淡水白鲢鱼皮经清洗，破碎，与水按1:15混合，并将混合物送入胶体磨微细化处理使原料蛋白充分分散均匀，调整蛋白质浓度在5％，磨细并分散均匀的原料液体在85℃的条件下常压杀菌60秒，并采用板式冷却器冷却到50℃，加入原料液中蛋白质质量的3.0％添加碱性蛋白酶进行水解，酶水解条件为50℃，初始pH9.0，时间4小时。
(2)将步骤(1)中第一次水解后的水解液经过采用卧螺离心和板框过滤方式分离出未水解的固相部分和水解液液相部分，并将其分别收集起来；然后将收集的水解液液相部分采用截留分子量(molecular weight cutoff)为2000Da的超滤膜进行超滤，将超滤膜非透过的大分子肽液和透过的小分子低聚肽液分别收集起来；
(3)将步骤(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超滤后收集的非透过的大分子肽液均匀混合形成第二次水解原料液，测定分离成分中的蛋白质含量，再定量加水控制二次水解原料液中蛋白质浓度在5％，然后加入木瓜蛋白酶进行第二次水解，第二次水解的条件为：温度45℃，pH6.5，时间4小时，木瓜蛋白酶与二次水解原料液中蛋白质的质量比为1.5％；
(4)将步骤(3)中二次水解后的水解液经卧螺离心、板框过滤后，进一步采用截留分子量为2000Da的超滤膜超滤，将超滤膜透过的小分子低聚肽液收集起来并与步骤(2)中第一次水解液超滤后的透过的小分子低聚肽液一起依次经过树脂脱盐、活性炭脱色后，得到分子量小的蛋白质短肽水解液；
(5)在步骤(4)中得到的蛋白质短肽水解液加入CaCl2，使其在温度为50℃、pH6.0的条件下螯合50min，其中CaCl2与蛋白短肽的质量比为1:2；
(6)步骤(5)中螯合反应完毕后，采用EDTA法测游离钙含量，根据溶液中剩余游离钙的含量，计算碳酸钠的添加量，在溶液中加入计算好的与螯合液中剩余的游离钙离子完全反应的碳酸钠，在常温下反应10min，板框过滤去除碳酸钙沉淀，反应完毕后的螯合液呈弱酸性，可以加入氢氧化钠将其调整为中性，之后采用截留分子量为200Da的纳滤膜纳滤3遍脱盐，使产品中氯化钠的含量达到产品要求，脱盐后的螯合液在121℃的条件下高温杀菌2秒，并冷却到50℃，然后在温度为温度50℃的-0.1Mpa真空条件下，真空浓缩，使固形物含量达到35％，喷雾干燥，控制产品中的水分在10％以内，即得到蛋白质短肽螯合钙产品。
实施例二
一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)将食品级大豆分离蛋白经过清洗、破碎后与水按重量比1:15混合，并将混合物送入胶体磨微细化处理使原料蛋白充分分散均匀形成蛋白质浓度为6％原料液，将在121℃的条件下高温杀菌2秒，采用板式冷却器冷却到45℃后加入木瓜蛋白酶进行第一次水解，第一次水解的条件为：温度为50℃，pH6，时间6小时，蛋白水解酶与原料蛋白的质量比为4％；
(2)将步骤(1)中第一次水解后的水解液采用沉降离心机离心和板框过滤方式分离出未水解的固相部分和水解液液相部分，并将其分别收集起来；然后将收集的水解液液相部分采用截留分子量为4000Da超滤膜进行超滤，将超滤膜非透过的大分子肽液和透过的小分子低聚肽液分别收集起来；
(3)将步骤(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超滤后收集的非透过的大分子肽液均匀混合形成第二次水解原料液，测定混合物中的蛋白质含量，再定量加水控制第二次水解原料液中蛋白质浓度在3-5％，然后在调配好的第二次水解原料液中同时加入碱性蛋白酶和胃蛋白酶，第二次水解的条件为：温度45℃，pH9.5，时间5小时，碱性蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为1:1，且两种酶混合量与二次水解原料液中蛋白质的质量比为2.5％；
(4)将步骤(3)中二次水解后的水解液经过离心、过滤后采用截留分子量为4000Da的超滤膜超滤，将超滤膜透过的小分子低聚肽液收集起来并与步骤(2)中第一次水解液超滤后的透过的小分子低聚肽液一起依次经过树脂脱盐、活性炭脱色，得到分子量小的蛋白质短肽水解液；
(5)在步骤(4)中得到的蛋白质短肽水解液加入氢氧化钙在温度为60℃、pH6.0的条件下螯合60min，氢氧化钙与蛋白质短肽的质量比为1:1.5；
(6)步骤(5)中螯合反应完毕后采用EDTA法测游离钙含量，根据溶液中剩余游离钙的浓度，加入与螯合液中剩余的游离钙离子完全反应的碳酸钠，在常温下搅拌15min，使用碳酸钠与氯化钙或氢氧化钙充分反应形成碳酸钙沉淀，采用板框过滤去除碳酸钙沉淀，并用浓度在1-3mol/L的盐酸将反应完毕后螯合液的pH调为中性；
(7)将步骤(6)中过滤后且pH为中性的螯合液采用截留分子量为250Da的纳滤膜纳滤5遍脱盐，使产品中氯化钠的含量达到产品要求，脱盐后的蛋白短肽螯合钙液在115℃条件下高温杀菌6秒，并冷却到50℃，后再-0.1Mpa真空条件下浓缩，使固形物含量达到35％，冷冻干燥，控制产品中的水分在10％以内，即得到蛋白质短肽螯合钙产品。
实施例三
(1)将食品级蛋清蛋白粉与水按重量比1:12混合，并将混合物送入胶体磨微细化处理使原料蛋白充分分散均匀形成蛋白质浓度为8％原料液，并在110℃的条件下高温杀菌5秒之后冷却到50℃，再加入中性蛋白酶进行第一次水解，第一次水解的条件为：温度50℃，pH7，时间6小时，中性蛋白酶与原料蛋白的质量比为4％；
(2)将步骤(1)中第一次水解后的水解液经过卧螺离心机-管式离心机离心两次连续离心，板框过滤分离出未水解的固相部分和水解液液相部分，并将其分别收集起来；然后将收集的水解液液相部分采用截留分子量为5000Da超滤膜进行超滤，将超滤膜非透过的大分子肽液和透过的小分子低聚肽液分别收集起来；
(3)将步骤(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超滤后收集的非透过的大分子肽液均匀混合形成第二次水解原料液，测定混合原料物中的蛋白质含量，再定量加水控制二次水解原料液中蛋白质浓度在7.5％左右，同时计入中性蛋白酶、胃蛋白酶进行第二次水解，第二次水解的条件为：温度45℃，pH7，时间4小时，中性蛋白酶和胃蛋白酶的质量比为1:1，两种酶混合后的量与二次水解原料液中蛋白质的质量比为1％～10％；
(4)将步骤(3)中二次水解后的水解液经过采用沉降离心，板框过滤后采用截留分子量为5000Da的超滤膜超滤，将超滤膜透过的小分子低聚肽液收集起来并与步骤(2)中第一次水解液超滤后的透过的小分子低聚肽液一起依次经过纳滤脱盐、活性炭脱色，得到分子量小的蛋白质短肽水解液；
(5)在步骤(4)中得到的蛋白质短肽水解液加入氯化钙在温度为40℃、pH5的条件下螯合30min，其中CaCl2与蛋白质短肽的质量比为1:2.0；
(6)步骤(5)中螯合反应完毕后的螯合液采用EDTA法测游离钙含量，根据溶液中剩余游离钙的浓度，加入与螯合液中剩余的游离钙离子完全反应的碳酸钠，在常温下反应5min，使碳酸钠与氯化钙或氢氧化钙充分反应形成碳酸钙沉淀，通过板框过滤法去除碳酸钙沉淀，并用浓度在1-3mol/L的盐酸将反应液的pH调为中性，之后采用截留分子量为200Da的纳滤膜纳滤5遍脱盐，使产品中氯化钠的含量达到产品要求，脱盐后的螯合液在110℃的条件下高温杀菌15秒杀菌，并冷却到50℃后在-0.1Mpa真空条件下浓缩，使固形物含量达到30％，喷雾干燥，控制产品中的水分在10％以内，即得到蛋白质短肽螯合钙产品。
采用以上实施例分子量在580Da以下的短肽的比例可以达到60％-70％，明显提高了蛋白质短肽螯合钙产品的水溶解性。

Claims (8)

1.一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)将原料蛋白经过清洗、破碎后与水按重量比1:5～20混合，并将混合物送入胶体磨微细化处理使原料蛋白充分分散均匀形成蛋白质浓度为2％～10％原料液，并对其进行杀菌后加入蛋白水解酶进行第一次水解，第一次水解的条件为：温度30～60℃，pH2～10，时间1.0～6小时，蛋白水解酶与原料蛋白的质量比为1％～10％；
(2)将步骤(1)中第一次水解后的水解液经过离心、过滤后分离出未水解的固相部分和水解液液相部分，并将其分别收集起来；然后将收集的水解液液相部分采用截留分子量为1000～6000Da超滤膜进行超滤，将超滤膜非透过的大分子肽液和透过的小分子低聚肽液分别收集起来；
(3)将步骤(2)中第一次水解后收集的未水解的固相部分和超滤后收集的非透过的大分子肽液均匀混合形成第二次水解原料液，并加水控制第二次水解原料液中蛋白质浓度在1％～10％之间，然后加入蛋白水解酶进行第二次水解，第二次水解的条件为：温度30～60℃，pH2-10，时间1～5小时，蛋白水解酶与二次水解原料液中蛋白质的质量比为1％～10％；
(4)将步骤(3)中第二次水解后的水解液经过离心、过滤后采用截留分子量为1000～6000Da的超滤膜超滤，将超滤膜透过的小分子低聚肽液收集起来并与步骤(2)中第一次水解液超滤后的透过的小分子低聚肽液一起依次经过纯化，得到分子量小的蛋白质短肽水解液；
(5)在步骤(4)中得到的蛋白质短肽水解液加入氢氧化钙或氯化钙在温度为20-70℃、pH4.0-9.0的条件下螯合20-60min；螯合时使用的可溶性钙原料为氯化钙时，氯化钙与螯合液中蛋白质短肽的质量比为1:2；螯合中使用的可溶性钙原料为氢氧化钙时，氢氧化钙与蛋白质短肽的质量比为1:1-1:2，完全反应后，并用浓度在1-3mol/L的盐酸将反应液的pH调为中性；
(6)测量出步骤(5)中螯合反应完毕后的螯合液中剩余游离钙离子的浓度，根据螯合液中剩余游离钙离子的浓度加入与螯合液中剩余的游离钙离子完全反应量的碳酸钠，在室温下充分搅拌5-15分钟，使碳酸钠与氯化钙或氢氧化钙充分反应形成碳酸钙沉淀，并过滤去除碳酸钙沉淀，之后调整反应完毕的螯合液的pH呈中性；
(7)将步骤(6)中去除碳酸钙沉淀沉淀且pH为中性的螯合液依次采用纳滤膜脱盐、杀菌、浓缩、干燥后得到蛋白质短肽螯合钙产品。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所用的原料蛋白包括食品级的动物蛋白、植物蛋白或微生物蛋白。
3.根据权利要求1所述的一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于：在步骤(1)和步骤(3)中所用的蛋白水解酶，包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶中的任意一种或任意两种的混合物，任意两种混合的比例为1～3:3～1。
4.根据权利要求1所述的一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，经胶体磨分散均匀的原料液体在70～100℃，10秒-15分钟时间的条件下采用常压杀菌法杀菌，或在105-121℃，2秒-30秒的条件下超高温短时杀菌法进行杀菌，然后采用板式冷却器冷却到30～60℃后再加入蛋白水解酶进行第一次水解。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于：步骤(2)和步骤(4)中的离心采用卧螺离心或沉降离心，离心分离出水解的蛋白肽液，再经板框式或滤袋式或滤芯式或陶瓷膜方式的过滤法进行过滤，得到透明度良好的蛋白质短肽溶液。
6.根据权利要求1所述的一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于：在步骤(6)采用EDTA滴定法测定反应完毕的螯合液中游离钙的含量，根据螯合液中存在的游离钙含量，在螯合反应液中定量加入碳酸钠，使氯化钙或氢氧化钙与碳酸钠反应生成碳酸钙沉淀，并使用盐酸调节其pH为中性。
7.根据权利要求1所述的一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于：在步骤(7)中，纳滤脱盐中采用纳滤膜截留分子量在100-300Da，纳滤一遍或多遍，使产品中氯化钠的含量达到产品要求为止。
8.根据权利要求1所述的一种蛋白质短肽螯合钙的制备方法，其特征在于：在步骤(7)中的杀菌采用在70～100℃，10秒-15分钟时间的条件下常压杀菌法，或在105-121℃，2秒-30秒的条件下超高温短时杀菌法，然后采用板式冷却器冷却到40～60℃，之后采用真空浓缩，温度30～70℃，-0.1Mpa～-0.05Mpa，使浓缩液中固形物含量在20-40％，浓缩好的蛋白质短肽螯合钙液，采用喷雾干燥或冷冻干燥或真空干燥，控制产品中的水分在10％以内。
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