CN105567775A - 鱼胶原肽螯合钙的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鱼胶原肽螯合钙的生产方法，以鱼骨、鱼皮、或鱼鳞为原料，通过前处理、蛋白酶解后，在梯度酸性pH条件下分别与钙进行螯合反应、再在碱性条件下通过离心、纳滤除去未螯合的钙，获得钙含量高的鱼胶原肽螯合钙。本发明提取工艺简便，成本低，适合工业化生产，制备的鱼胶原肽螯合钙具有良好的促钙吸收功能。
Description
技术领域
本发明涉及鱼胶原肽螯合钙的制备领域，尤其涉及一种利用鱼骨、鱼皮、或鱼鳞生产鱼胶原肽螯合钙的方法。
背景技术
人体内的钙主要存在于骨骼和牙齿，一小部分以游离或结合的状态分布于软组织、细胞外液及血液中，与骨骼、牙齿中的钙维持着动态平衡。钙是人体内第五大元素，也是人体必需的营养成分，主要通过饮食来摄入补充。然而，无论是发达国家还是发展中国家，缺钙现象普遍存在。由于人体摄入的钙90%在小肠内被吸收，肠道的碱性条件会使钙离子形成不溶性的钙盐发生沉淀，导致摄入体内的钙不能被机体有效的吸收。据报道，儿童长期缺钙将导致生长发育缓慢，严重时易患佝偻病，并伴有烦躁、抽筋等症状。中老年人和绝经期妇女缺钙容易引起骨质疏松、骨质增生、高血压、肥胖病以及大肠癌等各种急慢性疾病。为了有效预防缺钙引起的急慢性疾病，市场上已经涌现出大量的补钙制剂，主要成分以碳酸钙为主，也有部分是磷酸氢钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙和氨基酸螯合钙，然而有关肽螯合钙的产品比较少。
另一方面，我国鱼类年产量已经超过3000多万吨。随着我国居民的消费习惯的转变，鱼类加工产品的比例也在不断增加，在冷冻鱼片生产和鱼糜加工过程中，一般会产生大量包括鱼头、鱼骨、鱼皮、鱼鳞等下脚料，其重量约占原料鱼的40～55％。目前国内外针对这些鱼类加工下脚料主要用来生产鱼粉、鱼骨粉等低附加值产品，甚至还有一部分类似鱼鳞等被作为废弃物直接丢弃，这样不仅浪费资源，而且还会给环境造成严重污染。因此，利用鱼类加工下脚料生产胶原肽螯合钙，不仅可以减少水产加工企业的废弃物排放，也可以为补钙制剂提供更多的产品。
胶原肽及其螯合钙已经被证明具有抗氧化、促钙吸收等生理活性功能，利用鱼类加工下脚料制备胶原肽螯合钙已经引起广泛的关注。中国专利201110090611.6公开一种胶原三肽螯合钙及其制备方法，主要利用胶原三肽与氢氧化钙按比例混合，在水溶液中反应制备胶原三肽螯合钙；中国专利201410515456.1公开了一种钙螯合肽的制备方法，主要是先对胶原蛋白进行磷酸化、纯化，再将磷酸化的胶原蛋白进行酶解、钙螯合反应，最后还需通过无水乙醇沉淀制备成钙螯合肽。然而，由于蛋白酶解物通常都是多肽混合物，与钙螯合的pH不是唯一的，因此通过最适pH进行螯合获得肽-钙复合物中钙含量通常都较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺简便的鱼胶原肽螯合钙的生产方法，它是以鱼骨、鱼皮、或鱼鳞为原料，通过前处理、蛋白酶解后，在梯度酸性pH条件下分别与钙进行螯合反应、再在碱性条件下通过离心、纳滤除去未螯合的钙，获得钙含量高、具有良好的促钙吸收功能的鱼胶原肽螯合钙。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
它包括以下步骤：(1)原料预处理：将鱼骨、鱼皮、或鱼鳞中的一种用2-5倍原料重的含有氧化剂的氢氧化钙溶液浸泡24～48h后，用清水漂洗干净、磨碎；所述的氢氧化钙溶液中Ca(OH)2的浓度为0.1～0.4%(w/v)、氧化剂的浓度为0.5～1.0%(w/v)；(2)酶解：将步骤(1)磨碎的原料用80～100℃的热水加热30～60min，冷却至温度为40～50℃后，用氢氧化钙溶液调整pH，加入蛋白酶进行酶解一段时间，再升温至80～100℃加热5～30min进行灭酶；(3)钙螯合反应：当酶解液的温度下降至40～50℃，用食品级磷酸调整酶解液的pH至4.0，加入氯化钙后，酶解液的pH按4.5、5.0、5.5、6.0，间隔30～60min用氢氧化钙溶液提升0.5至6.0，使钙离子与胶原肽在梯度酸性pH下充分螯合；(4)去腥、除杂：将钙螯合后的鱼胶原肽溶液的pH用氢氧化钙溶液调整至7.5～8.5，加入活性炭吸附色素和气味，利用碟式离心机离心、陶瓷膜过滤除去活性炭和高分子物质，再通过纳滤膜过滤除去未螯合的钙和其他无机盐，收集纳滤截留浓缩液；(5)干燥：浓缩液通过冷冻干燥或喷雾干燥制备成鱼胶原肽螯合钙。
在步骤(1)中，所述的氧化剂为次氯酸钠、次氯酸钾、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾中的一种或组合。
在步骤(2)中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、胶原蛋白酶或胰蛋白酶；酶的用量为原料湿重的0.1～0.5%(w/w)。
在步骤(2)中，所述的酶解条件为：pH为8.5～9.5，酶解温度为40～50℃，酶解时间为4～6h。
在步骤(3)中，所述的钙螯合反应条件为：氯化钙浓度为0.5～1.0%(w/v)，反应温度为40～50℃，反应时间为30～60min。
在步骤(4)中，所述的陶瓷膜的孔径为50～200nm；所述的纳滤膜的截留分子量为200～400Da。
通常，蛋白质是由20多种氨基酸按照不同比例组成，蛋白质一级结构即氨基酸组成不是由固定的重复序列组成的，因此鱼皮、鱼鳞、鱼骨等经过蛋白酶酶解后，通常会获得寡肽混合物，而不同寡肽的等电点也存在一定程度的差异。因此，pH是寡肽与钙形成鳌合物的重要影响因素。在较低的酸性条件下，氢离子将与钙离子竞争供电子基团，不利于肽-钙鳌合物的生成，在碱性条件下，羟基与供电子基团争夺钙离子容易生成氢氧化钙沉锭。因此，本发明将鱼皮、鱼鳞、鱼骨等通过酶解获得胶原寡肽后，使其在酸性梯度pH条件下与钙离子进行充分螯合，再通过碱性条件沉淀去除未螯合的钙，保证制备的胶原肽螯合钙产品在小肠环境中能够保持溶解状态，有利于远端回肠的钙吸收率。因此本发明具有以下突出优点：
1、本发明利用鱼皮、鱼鳞、鱼骨制备的胶原肽分子量分布为200-3000道尔顿，有利于人体吸收。
2、本发明让钙离子在不同弱酸性pH条件下进行梯度螯合，可以获得钙含量高的胶原肽螯合钙。
3、本发明制备的产品去除了未螯合的钙离子，具有良好的促钙吸收功能。
下面结合附表和具体实施例对本发明作进一步的说明。
附图说明
图1为本发明第三个实施例的鱼胶原肽螯合钙分子量分布图谱；
图2为本发明第三个实施例的鱼胶原肽螯合钙的扫描电镜图谱；
表1为缺钙小鼠经鱼胶原肽螯合钙喂食后的股骨性质。
具体实施方式
实施例1
在1kg罗非鱼鱼骨中加入5L的含有0.75%过碳酸钠的0.4%Ca(OH)2溶液，在4℃下浸泡48h，利用自来水漂洗干净、适当沥干后，加入1L纯水（样品的最终体积约为2.0L），升温至100℃加热60min，冷却至50℃，用1%的Ca(OH)2溶液调整鱼鳞水溶液的pH至9.5后，加入5g碱性蛋白酶，在40℃下酶解4h，100℃加热5min灭酶，冷却至50℃，用1%的食品级磷酸调整酶解液的pH至4.0，加入10g氯化钙、搅拌，在搅拌过程中每隔30min，用0.1%Ca(OH)2溶液将蛋白酶解液的pH依次提高至4.5、5.0、5.5、6.0，使钙在这些pH下分别螯合30min，最后将溶液的pH调整至8.5，加入18g活性炭搅拌后静置30min，利用碟式离心机除去活性炭，然后利用孔径为200nm的陶瓷膜过滤、再通过截留分子量为200的纳滤膜脱盐，最后利用喷雾干燥机进行喷雾干燥，可以获得122g钙含量为6.71%(w/w)的鱼胶原肽螯合钙粉末。
实施例2
在1kg大黄鱼鱼鳞中加入2L的含有0.5%次氯酸钠的0.1%Ca(OH)2溶液，在4℃下浸泡24h，利用自来水漂洗干净、适当沥干后，加入1L纯水（样品的最终体积大约为1.8L），升温至100℃加热45min，冷却至45℃，用1%的Ca(OH)2溶液调整鱼鳞水溶液的pH至9.0后，加入0.3g胶原蛋白酶，在45℃下酶解5h，90℃加热15min灭酶，冷却至45℃，用1%的食品级磷酸调整酶解液的pH至4.0，加入13.5g氯化钙、搅拌，在搅拌过程中每隔30min，用0.1%Ca(OH)2溶液将蛋白酶解液的pH依次提高至4.5、5.0、5.5、6.0，使钙在这些pH下分别螯合30min，最后将溶液的pH调整至8.0，加入20g活性炭搅拌后静置30min，利用碟式离心机除去活性炭，然后利用孔径为100nm的陶瓷膜过滤、再通过截留分子量为300的纳滤膜脱盐，最后利用喷雾干燥机进行喷雾干燥，可以获得115g钙含量为6.86%(w/w)的鱼胶原肽螯合钙粉末。
实施例3
在1kg鲢鱼皮中加入4L的含有1.0%次氯酸钾的0.3%Ca(OH)2溶液，在4℃下浸泡36h，利用自来水漂洗干净、适当沥干后，加入1L纯水（样品的最终体积大约为2.5L），升温至100℃加热45min，冷却至40℃，用1%的Ca(OH)2溶液调整鱼鳞水溶液的pH至8.5后，加入0.1g胰蛋白酶，在40℃下酶解6h，80℃加热30min灭酶，冷却至40℃，用1%的食品级磷酸调整酶解液的pH至4.0，加入25g氯化钙、搅拌，在搅拌过程中每隔30min，用0.1%Ca(OH)2溶液将蛋白酶解液的pH依次提高至4.5、5.0、5.5、6.0，使钙在这些pH下分别螯合30min，最后将溶液的pH调整至7.5，加入25g活性炭搅拌后静置30min，利用碟式离心机除去活性炭，然后利用孔径为50nm的陶瓷膜过滤、再通过截留分子量为400的纳滤膜脱盐，最后利用冷冻干燥机进行喷雾干燥，可以获得145g钙含量为7.25%(w/w)的鱼胶原肽螯合钙粉末。
胶原肽螯合钙促钙吸收动物实验
利用实施例3制备的鱼胶原肽螯合钙进行动物实验。首先利用扫描电镜对鱼胶原肽螯合钙的微观结构进行观察，再用高效液相色谱对钙螯合鱼胶原肽的分子量分布进行测定。最后在SPF级KM小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2012-0005)进行动物实验。小鼠适应性饲喂用低钙饲料（钙含量为200mg/kg）喂养35天后，将小鼠称重、随机分成低钙组、CaCO3组、胶原肽螯合钙组等3组(每组10只)，在自由进食低钙饲料和去离子水的同时，低钙组、CaCO3组、胶原肽螯合钙组分别灌胃生理盐水、生理盐水溶解的碳酸钙（钙用量为100mg/kg小鼠体重）、生理盐水溶解的胶原肽螯合钙（钙用量为100mg/kg小鼠体重），连续灌胃4周后，对小鼠股骨的性质进行测定，详见表1。
表1小鼠股骨的性质
| 低钙组 | 胶原肽螯合钙组 | CaCO3组 | |
| 股骨长度 (mm) | 16.42±0.28b | 17.03±0.31a | 16.68±0.24b |
| 股骨重量 (mg) | 71.04±3.74c | 85.13±2.57a | 78.13±2.91b |
| 骨密度 (mg/cm2) | 53.0±9.0b | 74.0±6.0a | 74.0±11.0a |
| 股钙含量 (mg/g) | 220.92±4.27b | 246.29±7.11ba | 222.81±5.76b |
| 股胶原含量 (mg/g) | 19.11±1.46b | 25.22±1.20a | 21.40±1.25b |
由实施例1、实施例2、实施例3获得的3种鱼胶原肽螯合钙可知，产品中不仅含有丰富的钙，而且产品得率可以高达11.5-14.5%。由图1可知，获得的钙螯合鱼胶原肽的分子量主要分布在200～2000道尔顿，可以容易被人体所吸收。图2结果表明，在鱼胶原肽表面有很多嵌合的白色晶体，表明胶原肽通过离子键、吸附作用等与钙有机地结合在一起。当利用这些制备的鱼胶原肽螯合钙进行动物实验时，发现喂食鱼胶原肽螯合钙不仅与喂食CaCO3一样可以提高缺钙小鼠的股骨重量和骨密度，而且还可以明显促进缺钙小鼠的股骨长度、股钙含量和胶原含量的增加，这些结果表明本发明制备的鱼胶原肽螯合钙比碳酸钙更有利于促钙吸收，增加股骨中的胶原生长。
综上所述，本发明以鱼骨、鱼皮、或鱼鳞为原料，通过前处理、蛋白酶解后，在梯度酸性pH条件下分别与钙进行螯合反应、再在碱性条件下通过离心、纳滤除去未螯合的钙，获得钙含量高、具有良好的促钙吸收功能的鱼胶原肽螯合钙。本发明提取工艺简便，适合工业化生产。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
Claims (6)
1.一种鱼胶原肽螯合钙的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)原料预处理：将鱼骨、鱼皮或鱼鳞中的一种用2-5倍原料重、含有氧化剂的氢氧化钙溶液浸泡24～48h后，用清水漂洗干净、磨碎；所述的氢氧化钙溶液中Ca(OH)2的浓度为0.1～0.4%(w/v)、氧化剂的浓度为0.5～1.0%(w/v)；(2)酶解：将步骤(1)磨碎的原料用80～100℃的热水加热30～60min，冷却至温度为40～50℃后，用氢氧化钙溶液调整pH，加入蛋白酶进行酶解一段时间，再升温至80～100℃加热5～30min进行灭酶；(3)钙螯合反应：当酶解液的温度下降至40～50℃时，用食品级磷酸调整酶解液的pH至4.0，加入氯化钙后，酶解液的pH按4.5、5.0、5.5、6.0间隔30～60min用氢氧化钙溶液提升0.5至6.0，使钙离子与胶原肽在梯度酸性pH下充分螯合得到鱼胶原肽螯合钙溶液；(4)去腥、除杂：将钙螯合后的鱼胶原肽溶液的pH用氢氧化钙溶液调整至7.5～8.5，加入活性炭吸附色素和气味，利用碟式离心机离心、陶瓷膜过滤除去活性炭和高分子物质，再通过纳滤膜过滤除去未螯合的钙和其他无机盐，收集纳滤截留浓缩液；(5)干燥：浓缩液通过冷冻干燥或喷雾干燥制备成鱼胶原肽螯合钙。
2.如权利要求1所述的鱼胶原肽螯合钙的生产方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的氧化剂为次氯酸钠、次氯酸钾、过碳酸钠、过硼酸钠、过硼酸钾中的一种或组合。
3.如权利要求1所述的鱼胶原肽螯合钙的生产方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的蛋白酶为碱性蛋白酶、胶原蛋白酶或胰蛋白酶；酶的用量为原料湿重的0.1～0.5%(w/w)。
4.如权利要求1所述的鱼胶原肽螯合钙的生产方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的酶解条件为：pH为8.5～9.5，酶解温度为40～50℃，酶解时间为4～6h。
5.如权利要求1所述的鱼胶原肽螯合钙的生产方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的钙螯合反应条件为：氯化钙浓度为0.5～1.0%(w/v)，反应温度为40～50℃，反应时间为30～60min。
6.如权利要求1所述的鱼胶原肽螯合钙的生产方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述的陶瓷膜的孔径为50～200nm；所述的纳滤膜的截留分子量为200～400Da。
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