CN117946207A - 一种含矿物质的高纯度胶原三肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于活性物质提取技术领域，具体涉及一种含矿物质的高纯度胶原三肽及其制备方法。本发明以水产加工副产物鱼皮或鱼鳞为原料，通过一步酶解法，并经两次纳滤，获得含矿物质元素、纯度高、羟脯氨酸含量高，无不良风味特别是无苦味的胶原三肽。

Description

一种含矿物质的高纯度胶原三肽及其制备方法
技术领域
本发明属于活性物质提取技术领域，具体涉及一种含矿物质的高纯度胶原三肽及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白参与细胞的增殖、分化、迁移和信号传递等生理生化行为，对组织细胞等起着支撑、修复、保护的作用，但其分子量大，需要被消化降解为游离氨基酸和低聚肽才能被吸收，且吸收形式为二肽和三肽。胶原三肽除易被吸收外，还具有促进皮肤生长修复、促进软骨生长修复、减轻动脉粥样硬化、促进矿物元素吸收、抗氧化等生理活性。研究报道，胶原蛋白水解物在消化后产生含羟脯氨酸的二肽和三肽经血液循环到达各组织中，对皮肤和关节细胞产生相应的生物活性，因此，羟脯氨酸含量也是评价胶原蛋白相关产品质量的一个重要指标。
目前有研究报道通过超声辅助酶解法、发酵法等制备胶原三肽，制备工艺复杂，原料的提取率低、利用率低，且三肽纯度较低，造成资源的浪费。另外，同时配合化工方法机械能提取胶原蛋白时，易产生污染，工艺复杂，成本较高，不利于胶原三肽的提取与使用。
例如，中国专利公开号为CN116162677A的发明专利公开了一种高纯度鱼皮胶原三肽的制备方法，具体的胶原三肽制备工艺为：鱼皮明胶溶胀：鱼皮明胶配成质量分数为5-10%的溶液，80-100℃加热10分钟。第一步酶解：中性蛋白酶添加量为5000-8000 U/g，50-65℃，酶解2-3 h。第二步酶解：木瓜蛋白酶添加量为2000-3000 U/g，50-65℃，酶解1.5-2 h。超滤：利用超滤膜对酶解液进行过滤，分离胶原三肽，超滤膜截留分子量为1-2 kDa，膜浓缩倍数为4-5倍。第一步纳滤：纳滤膜截留分子量为800-1000 Da，浓缩倍数为4-5倍。第二步纳滤：纳滤膜截留分子量为260 Da，浓缩倍数为3-4倍，浓缩后再加入1-2倍体积的水洗出游离氨基酸和盐。低温巴氏杀菌。冷冻干燥。可见，该制备方法的原料为鱼皮明胶，成本较高，且采用分步酶解法，工艺复杂，不利于工业化生产。另外，采用这种方法酶解液未经分离，直接过超滤膜，工业生产过程中容易造成超滤膜堵塞，减少超滤膜寿命，增加能耗。
因此，目前持续存在对高纯度胶原三肽及其高效制备方法的需求。
发明内容
为了解决现有技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种含矿物质的高纯度胶原三肽及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
在第一个方面中，本发明提供了一种含矿物质的高纯度胶原三肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）前处理：将清洗干净的鱼皮或鱼鳞加入3-8倍质量的碱溶液浸泡2-6 h，蒸馏水清洗至中性，得预处理鱼皮或鱼鳞，其中，碱溶液为质量浓度为0.2%-1%的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠中的一种；
（2）胶原蛋白的提取：将预处理鱼皮或鱼鳞与纯净水按照1：1-17混合，于85-100℃加热1-7 h，得胶原蛋白提取液；
（3）加入矿物质盐：将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至6-10，加入蛋白酶质量0.1-5%的矿物质盐，搅拌，混合均匀；
（4）酶解：加入鱼皮或鱼鳞质量1.5-5%的蛋白酶，调节温度至50-65℃，酶解3-8 h，得胶原三肽酶解液；
（5）灭酶：将酶解液于90-100℃，加热10-15 min，冷却至45-65℃；
（6）静置、分离：将酶解液放置30-50 min，分离残渣沉淀，得一级上清液，将残渣沉淀于4000-6000 r/min，离心20-30 min，得二级上清液，将一级上清液和二级上清液混合；
（7）脱色：将上清液混合液经活性炭纤维膜进行脱色；
（8）分离、纯化：用600-800 Da纳滤膜对脱色液进行分离，去除大分子肽及杂质，得到小分子肽溶液，再经截留分子量为200 Da的纳滤膜过滤，除去水分、一价盐及游离氨基酸；
（9）冻干：冷冻干燥，得胶原三肽粉末。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤（1）中，所述鱼皮或鱼鳞是来自罗非鱼的鱼皮或鱼鳞。
优选地，在步骤（1）中，将清洗干净的鱼皮或鱼鳞加入3-6倍质量的碱溶液浸泡2-5h，蒸馏水清洗至中性，得预处理鱼皮或鱼鳞，其中，碱溶液为质量浓度为0.4%-0.8%的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠中的一种。
更优选地，在步骤（1）中，将清洗干净的鱼皮或鱼鳞加入5倍质量的碱溶液浸泡4h，蒸馏水清洗至中性，得预处理鱼皮或鱼鳞，其中，碱溶液为质量浓度为0.6%的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠中的一种。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤（2）中，将预处理鱼皮或鱼鳞与纯净水按照1：5-10混合，于85-95℃加热1-5 h，得胶原蛋白提取液。
更优选地，在步骤（2）中，将预处理鱼皮或鱼鳞与纯净水按照1：8混合，于90℃加热2 h，得胶原蛋白提取液。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤（3）中，将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至7-10，加入蛋白酶质量0.5-3%的矿物质盐，搅拌，混合均匀，其中，矿物质盐为锌离子：镁离子：钙离子=1：3-6：20-80的盐酸盐组合。
优选地，在步骤（3）中，将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.5，加入蛋白酶质量1.5-3%的矿物质盐，搅拌，混合均匀，其中，矿物质盐为锌离子：镁离子：钙离子=1：3-5：20-50的盐酸盐组合。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤（4）中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶中的一种或几种组合。
优选地，所述蛋白酶选自碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶或中性蛋白酶的一种或多种。
优选地，在步骤（4）中，加入鱼皮或鱼鳞质量3-5%的蛋白酶，调节温度至55℃，酶解6 h，得胶原三肽酶解液。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤（5）中，将酶解液于90℃，加15 min，冷却至45℃。
作为可选的方式，在上述制备方法中，在步骤（6）中，将酶解液放置30 min，分离残渣沉淀，得一级上清液，将残渣沉淀于4000 r/min，离心20-30 min，得二级上清液，将一级上清液和二级上清液混合。
在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的制备方法制备得到的含矿物质的高纯度胶原三肽。
作为可选的方式，在上述高纯度胶原三肽中，以质量百分比计，所述胶原三肽的纯度高于75%，羟脯氨酸含量高于12%，且无苦腥味。
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明以水产加工副产物鱼皮或鱼鳞为原料，通过一步酶解法，并经两次纳滤，获得含矿物质元素、纯度高、羟脯氨酸含量高，无苦味等不良风味的胶原三肽。具体优势体现在以下方面：
（1）以鱼皮或鱼鳞为原料，通过一步酶解法靶向水解鱼皮或鱼鳞胶原蛋白，制备胶原三肽，工艺简单，易于工业化生产。
（2）向胶原蛋白提取液中加入矿物质（例如，锌离子、镁离子和钙离子）盐组合，作为酶激活剂，增加酶活性，提高酶解效果，且提供具有营养价值的矿物质元素。
（3）使用可重复使用的活性炭纤维膜代替活性炭粉进行脱色，减少固废及相应的处理费用，降低成本，并且实现脱色过程的流动性，连续化，提高生产效率。
（4）采用两次纳滤，获得目标分子量的胶原蛋白肽的同时，还起到除一价盐和浓缩的目的，提高胶原三肽纯度，增加产品市场竞争力。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
实施例1
（1）前处理：将清洗干净的鱼皮加入5倍质量的碱溶液浸泡4 h，蒸馏水清洗至中性，得预处理鱼皮。其中，碱溶液为质量浓度为0.6%的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠中的一种。
（2）胶原蛋白的提取：将预处理鱼皮与纯净水按照1:8混合，于90℃加热2 h，得胶原蛋白提取液。
（3）加入矿物质盐：将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.5，加入蛋白酶质量1.5%的矿物质盐，搅拌，混合均匀。其中，矿物质盐为锌离子：镁离子：钙离子=1：4：30的盐酸盐组合。
（4）酶解：加入鱼皮质量2.5%的碱性蛋白酶和1.5%的中性蛋白酶，调节温度至55℃，酶解6 h，得胶原三肽酶解液。
（5）灭酶：将酶解液于90℃，加热15 min，冷却至45℃。
（6）静置、分离：将酶解液放置30 min，分离残渣沉淀，得一级上清液，将残渣沉淀于4000 r/min，离心20 min，得二级上清液，将一级上清液和二级上清液混合。
（7）脱色：将上清液混合液经活性炭纤维膜进行脱色。
（8）分离、纯化：用纳滤膜（600-800 Da）对脱色液进行分离，去除大分子肽及杂质，得到小分子肽溶液，再经截留分子量为200 Da的纳滤膜过滤，除去水分、一价盐及游离氨基酸。
（9）冻干：冷冻干燥，得胶原三肽粉末。
实施例2
（1）前处理：将清洗干净的鱼皮加入5倍质量的碱溶液浸泡4 h，蒸馏水清洗至中性，得预处理鱼皮。其中，碱溶液为质量浓度为0.6%的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠中的一种。
（2）胶原蛋白的提取：将预处理鱼皮与纯净水按照1:8混合，于90℃加热2 h，得胶原蛋白提取液。
（3）加入矿物质盐：将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.5，加入蛋白酶质量1.5%的矿物质盐，搅拌，混合均匀。其中，矿物质盐为锌离子：镁离子：钙离子=1：4：30的盐酸盐组合。
（4）酶解：加入鱼皮质量2.5%的碱性蛋白酶和1.5%的木瓜蛋白酶，调节温度至55℃，酶解6 h，得胶原三肽酶解液。
（5）灭酶：将酶解液于90℃，加热15 min，冷却至45℃。
（6）静置、分离：将酶解液放置30 min，分离残渣沉淀，得一级上清液，将残渣沉淀于4000 r/min，离心30 min，得二级上清液，将一级上清液和二级上清液混合。
（7）脱色：将上清液混合液经活性炭纤维膜进行脱色。
（8）分离、纯化：用纳滤膜（600-800 Da）对脱色液进行分离，去除大分子肽及杂质，得到小分子肽溶液，再经截留分子量为200 Da的纳滤膜过滤，除去水分、一价盐及游离氨基酸。
（9）冻干：冷冻干燥，得胶原三肽粉末。
实施例3
（1）前处理：将清洗干净的鱼皮加入5倍质量的碱溶液浸泡4 h，蒸馏水清洗至中性，得预处理鱼皮。其中，碱溶液为质量浓度为0.6%的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠中的一种。
（2）胶原蛋白的提取：将预处理鱼皮与纯净水按照1：8混合，于90℃加热2 h，得胶原蛋白提取液。
（3）加入矿物质盐：将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.5，加入蛋白酶质量3%的矿物质盐，搅拌，混合均匀。其中，矿物质盐为锌离子：镁离子：钙离子=1：4：30的盐酸盐组合。
（4）酶解：加入鱼皮质量2.5%的碱性蛋白酶和1.5%的中性蛋白酶，调节温度至55℃，酶解6 h，得胶原三肽酶解液。
（5）灭酶：将酶解液于90℃，加热15 min，冷却至45℃。
（6）静置、分离：将酶解液放置30 min，分离残渣沉淀，得一级上清液，将残渣沉淀于4000 r/min，离心20 min，得二级上清液，将一级上清液和二级上清液混合。
（7）脱色：将上清液混合液经活性炭纤维膜进行脱色。
（8）分离、纯化：用纳滤膜（600-800 Da）对脱色液进行分离，去除大分子肽及杂质，得到小分子肽溶液，再经截留分子量为200 Da的纳滤膜过滤，除去水分、一价盐及游离氨基酸。
（9）冻干：冷冻干燥，得胶原三肽粉末。
实施例4
（1）前处理：将清洗干净的鱼皮加入5倍质量的碱溶液浸泡4 h，蒸馏水清洗至中性，得预处理鱼皮。其中，碱溶液为质量浓度为0.6%的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠中的一种。
（2）胶原蛋白的提取：将预处理鱼皮与纯净水按照1:8混合，于90℃加热2 h，得胶原蛋白提取液。
（3）加入矿物质盐：将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至8.5，加入蛋白酶质量1.5%的矿物质盐，搅拌，混合均匀。其中，矿物质盐为锌离子：镁离子：钙离子=1：5：40的盐酸盐组合。
（4）酶解：加入鱼皮质量2.5%的碱性蛋白酶和1.5%的中性蛋白酶，调节温度至55℃，酶解6 h，得胶原三肽酶解液。
（5）灭酶：将酶解液于90℃，加热15 min，冷却至45℃。
（6）静置、分离：将酶解液放置30 min，分离残渣沉淀，得一级上清液，将残渣沉淀于4000 r/min，离心20 min，得二级上清液，将一级上清液和二级上清液混合。
（7）脱色：将上清液混合液经活性炭纤维膜进行脱色。
（8）分离、纯化：用纳滤膜（600-800 Da）对脱色液进行分离，去除大分子肽及杂质，得到小分子肽溶液，再经截留分子量为200 Da的纳滤膜过滤，除去水分、一价盐及游离氨基酸。
各实施例三肽纯度、羟脯氨酸含量、脱色液吸光值及口感见表1。
本发明所涉及的酶均为市售蛋白酶。
本发明利用酸水解法羟脯氨酸试剂盒测定胶原三肽中羟脯氨酸含量。
使用高效液相色谱法（HPLC）测定胶原三肽纯度。
样品处理：将样品用流动相溶解，之后0.45 μm滤膜过滤后放入进样小瓶。
色谱条件：凝胶色谱柱为TSKgel，流动相：40%乙腈+60%超纯水+0.1%三氟乙酸溶液，真空泵脱气，紫外检测波长220 nm；柱温为30℃，流速1 mL/min，进样量为10 μL。使用不同分子量标准品确定三肽洗脱时间，用洗脱时间下的峰面积占总体出峰面积的比例表示三肽纯度。
使用酶标仪在550 nm处测定脱色液吸光值。
对比例1
将实施例1中步骤7改为向上清液中加入鱼皮质量4%的活性碳，45℃加热40 min进行脱色，其他条件同实施例1。
对比例2
删除实施例1步骤3，将胶原蛋白提取液调pH至8.5，不加入矿物质盐，直接加蛋白酶，其他条件同实施例1。
对比例3
将实施例1步骤3中矿物质盐组合改为钙离子的盐酸盐，其他条件同实施例1。
对比例4
将实施例1步骤3中矿物质盐组合改为锌离子：钙离子=1：30的盐酸盐组合，其他条件同实施例1。
对比例结果见表1。
表1 各实施例三肽纯度、羟脯氨酸含量、脱色液吸光值及口感
由表1可知，实施例1-4三肽纯度均高于75%，已公开中国发明专利CN114634549A和CN103243144B报道的胶原三肽制备方法得到的三肽纯度分别为32.8%和12.49%，因此，通过本发明的工艺制备的胶原三肽纯度显著提高。羟脯氨酸含量均大于12%，无苦腥味。对比例1使用活性炭粉进行脱色，三肽纯度低于实施例1，脱色液吸光值也略高，说明活性炭纤维膜吸附效果更好，脱色效果更佳。与实施例1相比，对比例2-4三肽纯度均降低，说明锌离子、镁离子、钙离子组合使用作为蛋白酶的激活剂，能够提高酶解效果。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (7)

1.一种含矿物质的高纯度胶原三肽的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）前处理：将清洗干净的鱼皮或鱼鳞加入3-8倍质量的碱溶液浸泡2-6 h，蒸馏水清洗至中性，得预处理鱼皮或鱼鳞，其中，碱溶液为质量浓度为0.2%-1%的氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠中的一种；
（2）胶原蛋白的提取：将预处理鱼皮或鱼鳞与纯净水按照1：1-17混合，于85-100℃加热1-7 h，得胶原蛋白提取液；
（3）加入矿物质盐：将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至6-10，加入蛋白酶质量0.1-5%的矿物质盐，搅拌，混合均匀；
（4）酶解：加入鱼皮或鱼鳞质量1.5-5%的蛋白酶，调节温度至50-65℃，酶解3-8 h，得胶原三肽酶解液；
（5）灭酶：将酶解液于90-100℃，加热10-15 min，冷却至45-65℃；
（6）静置、分离：将酶解液放置30-50 min，分离残渣沉淀，得一级上清液，将残渣沉淀于4000-6000 r/min，离心20-30 min，得二级上清液，将一级上清液和二级上清液混合；
（7）脱色：将上清液混合液经活性炭纤维膜进行脱色；
（8）分离、纯化：用600-800 Da纳滤膜对脱色液进行分离，去除大分子肽及杂质，得到小分子肽溶液，再经截留分子量为200 Da的纳滤膜过滤，除去水分、一价盐及游离氨基酸；
（9）冻干：冷冻干燥，得胶原三肽粉末。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤（1）中，所述鱼皮或鱼鳞是来自罗非鱼的鱼皮或鱼鳞。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤（2）中，将预处理鱼皮或鱼鳞与纯净水按照1：5-10混合，于85-95℃加热1-5 h，得胶原蛋白提取液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，将胶原蛋白提取液用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH至7-10，加入蛋白酶质量0.5-3%的矿物质盐，搅拌，混合均匀，其中，矿物质盐为锌离子：镁离子：钙离子=1：3-6：20-80的盐酸盐组合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤（4）中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶或胃蛋白酶中的一种或几种组合。
6.采用权利要求1至5中任一项所述的制备方法制备得到的含矿物质的高纯度胶原三肽。
7.根据权利要求6所述的高纯度胶原三肽，其特征在于：以质量百分比计，所述胶原三肽的纯度高于75%，羟脯氨酸含量高于12%，且无苦腥味。
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