CN117165646A - 一种胶原三肽组合物及其纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从胶原蛋白酶解液中提取胶原三肽(CTP)的工艺,包括如下步骤:对预处理后的胶原蛋白原料进行两次酶解,过滤,采用特定的磁性微球分离、分子印迹聚合微球介质固相萃取纯化。本发明可以获得高含量(最高可达到80%)的胶原三肽组合物产品(Gly‑X‑Y,包括Gly‑Pro‑Hyp在内)。本发明具有分离效率高、成本低、适合工业化规模生产等优点。研究得出,胶原三肽和弹性蛋白肽16:1到24:1的复配使用,可以显著地增加皮肤中弹性蛋白和胶原蛋白的含量,并显著增加透明质酸和羟脯氨酸的含量,同时降低MMP3的含量,抑制皮肤炎症因子。
Description
技术领域
本发明属于一种高纯度胶原三肽的提取及分离纯化方法,具体涉及一种利用鱼鳞或鱼皮酶解液中提取并分离得到高纯度胶原三肽的纯化方法。
背景技术
胶原蛋白是由甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等多种氨基酸构成的纤维性蛋白质,分子量较高,为300KDa(千道尔顿)左右。比大部分蛋白质(分子量通常低于100KDa)要高,难以被人消化、吸收,通常需要降解成分子量5000以下的低分子量胶原蛋白多肽进行使用。低分子量胶原蛋白多肽也称为胶原蛋白,低分子量胶原蛋白在人体内可以降解,以氨基酸的形式被吸收。
由于人工合成胶原蛋白肽成本昂贵,操作困难,因此目前低分子量胶原蛋白肽主要由蛋白质水解得到。小分子肽尤其是3个或3个以上的氨基酸脱水缩合形成的小分子量肽易于吸收。胶原蛋白肽通常具有独特的富含甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(或者甘氨酸-x-y)的重复序列结构。这种重复序列结构基本单元形成的小肽称为胶原三肽
(CTP),因此胶原三肽分子量通常约在200-300Da左右,其衍生物(例如未完全水解)最高不超过1000Da,由于分子量小,因此容易透过皮肤被吸收。由多个氨基酸连接导致分子量超过800或1000Da时,由于分子量变大而无法快速通过皮肤被吸收。因此,胶原三肽(甘氨酸-x-y)在医药、美容护肤品、保健品、食品等领域具有广泛的需求和价值。
目前胶原蛋白提取原料主要为动物的皮,例如牛皮、猪皮、鱼皮等脂肪含量较高的组织作为原料,通过酶水解在内的一系列处理而获得胶原三肽组合物。但是所得产物中三肽的含量非常低(另外现有技术中对于油脂的去除效果较差,导致残留油脂,进而影响胶原三肽的质量)。目前对胶原蛋白肽的提取制备已经开发了多种复合蛋白酶,应用较广的蛋白酶有碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶等。
然而由于酶解的特性,其并不能得到高产率的胶原三肽分子;加上胶原三肽分离提纯困难,成本较高,导致胶原三肽的最终提取率不高,且纯度较低。现有技术得到的多肽产品中胶原三肽衍生物含量通常在20%以下,无法进一步纯化得到更高纯度的产品,导致其应用受到限制。
因此,存在对制备高含量胶原三肽(甘氨酸-x-y)的高效分离提纯方法的需求。
CN 107532157 A公开了制备胶原三肽的方法,步骤属于常规步骤,但是其采用了特定的胶原酶,提取过程繁琐,且相比较市场的常见酶,操作不便。
CN 113789360 A涉及胶原三肽的提取方法及制备的胶原三肽。采用酶法对鱼皮进行提取,通过采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶以1:3比例混合酶解法对鱼皮进行胶原蛋白肽的提取制备,同时加以600W的超声波进行处理45min,使鱼皮中对胶原蛋白肽的提取率提高了15%~25%,但是该方法并不能获得高含量的胶原蛋白肽。
CN 108929381 A提供了一种皮肤紧急修复用胶原三肽及其制备方法,选用贻贝科动物明胶作为原料,通过双酶水解法制备胶原三肽,选自菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶和生姜蛋白酶。但是获得的三肽纯度并不高。
上述现有技术基本上是在沿用现有制备工序的情况下,通过改进胶原蛋白水解工序或者所用酶的组合对小分子多肽含量进行改进,通过使用新型酶或酶的组合,从而提高胶原蛋白水解物的小分子肽含量。
分子印迹聚合物是对目标分子具有特异性吸附能力的聚合物,目前分子印迹分离法已在固相萃取、分离纯化等领域广泛应用。然而目前尚未有分子印迹用于增强多肽分离的选择性吸附。
鉴于上述关于胶原三肽纯化的现有技术没有涉及到从酶解液中进行大规模分离批量处理得到高纯度产品的描述(大部分小分子多肽产品中胶原三肽含量不高,一般不超过20%)。因此,在面对成分复杂的酶解液时,现有技术难以通过离子交换、硅胶或膜过滤从中直接纯化分离得到高纯度的胶原三肽类物质(甘氨酸-x-y)。因此,基于胶原蛋白酶解液原料,开发成本低廉,适合工业化大批量分离纯化且产品纯度较高的胶原三肽提取分离技术具有重要的市场价值。
发明内容
针对现有技术中从胶原蛋白酶解液中提取胶原三肽(CTP)存在的分离效率低、产物纯度不高等问题,本发明提供了一种基于磁性微球多肽分离-固相特异性吸附萃取相结合的胶原三肽分离纯化工艺,以获得高含量的胶原三肽产品(Gly-X-Y,包括Gly-Pro-Hyp在内)。该方法具有分离效率高、原料易于获取、成本低、适合工业化规模生产等优点。
本发明的另一目的在于提供一种高含量或高纯度纯度的胶原三肽组合物产品,其具有不低于95%的小分子胶原肽(分子量不大于1KDa)含量;其中,所得组合物中胶原三肽(Gly-X-Y,X为Pro或Hyp,Y为其他氨基酸)具有不低于80%的含量。
本发明方法采用的主要步骤为:
对预处理后的胶原蛋白原料进行两次酶解,然后通过纳滤膜除去酶解不充分的大分子杂质,再采用特定的磁性微球分离、分子印迹聚合微球介质固相萃取相结合的手段进行纯化分离。具体包括:
1)将胶原蛋白原料进行粉碎、加热处理后,依次经酸性酶解、碱性酶解;所述酶解至少包括一种胶原蛋白酶;
2)酶解液经纳滤或超滤处理后,采用选自表面修饰或未修饰的聚甲基丙烯酸酯基磁性微球或PVA(聚乙烯醇)基磁性微球中的至少一种磁性微球填料介质进行非特异性吸附分离;优选地,采用上述两种微球的复合填料;进一步优选地,还采用硅胶或介孔二氧化硅进行预分离处理;
3)采用分子印迹法进行梯度固相萃取纯化:将经过非特异性吸附分离的小分子胶原肽上样于不同模板分子制备的分子印迹聚合物分离柱内进行特异性分离纯化,以得到高含量胶原三肽的组合物。其中,所述的不同模板分子选自:端基为Gly的三肽模板分子、端基为Gly的二肽模板分子、胶原三肽特征氨基酸。
其中,所述的胶原三肽特征氨基酸选自甘氨酸、羟脯氨酸中的至少一种,优选羟脯氨酸或两种均含。
其中,所述的分子印迹聚合物是以上述模板分子,在功能单体和交联剂存在下采用热聚合技术制备而成。分子印迹聚合物的制备方法是本领域熟知的。
其中,本发明所述的胶原蛋白原料优选自鱼鳞、脱脂鱼皮或二者混合物,也可选自带鳞鱼皮。考虑到原料成本及预处理工序操作成本,更优选采用鱼鳞尤其是淡水鱼鱼鳞。当采用二者混合物时,脱脂鱼皮含量不超过原料总重的50%(基于原料干重计)。
另外,鱼皮进行脱脂的方法也是现有技术已知的。
具体地,本发明的技术方案如下。
第一个方面,本发明提供一种高纯度的胶原三肽的分离纯化方法,包括以下步骤S1-S5:
步骤S1:对胶原蛋白原料预处理
所述胶原蛋白原料选自鱼鳞、脱脂鱼皮(不含鳞)或二者混合物(还可包括含鳞鱼皮)。优选成本低、含脂量低的鱼鳞例如淡水鱼鳞。采用二者混合物时,脱脂鱼皮含量优选不超过原料总重的30%(基于干重计)。
采用鱼鳞为原料时,可直接加水粉碎制浆,也可将鱼鳞洗净、烘干处理后粉碎并过筛(优选不低于40目)(以便于大规模制备时的原料分批保存),然后按照如下步骤进行预处理:
取粉碎后的鱼鳞粉在水中充分浸泡,浸泡温度为室温至50-60℃,然后捞出沥干水分;用相当于鱼鳞5-15倍重量的0.1-0.3M(优选0.1-0.2M)HCl溶液在室温下浸泡3-5h,然后用清水漂洗干净;将洗净的鱼鳞放入带有搅拌的加热釜,加入5-10倍质量的去离子水,在温度95-100℃及搅拌下加热处理6-8h,获得鱼鳞质胶液。
将所得鱼鳞质胶液进行趁热过滤,以去除固体杂质;将滤液冷却至室温备用,得到粗胶原蛋白胶液。
当采用脱脂鱼皮为原料时,按照如下步骤进行预处理:
将0.1-0.2M NaOH溶液浸泡处理并用有机溶剂浸泡除脂后的鱼皮,脱水烘干后粉碎并过筛(优选不低于20目)备用;
示例性地,脱脂步骤如下:用5-6倍鱼皮原料重的0.1-0.2MNaOH溶液在浸泡温度为25℃下浸泡5-10h去除杂蛋白和脂肪,水洗干净,再用5-10倍重的0.3-0.5M的HCl溶液在温度为25℃下浸泡2-3h,再用清水漂洗干净;用正己烷浸泡鱼皮5-6h去除脂肪,洗净后得到脱脂鱼皮。
步骤S2:复合酶解:将所得粗胶原蛋白胶液依次经酸性酶解、碱性酶解进行两次复合酶解,步骤如下:
1)首次酸性酶解:
将上述所得粗胶原蛋白胶液(优选控制固含量约5-15wt%)用盐酸溶液调节pH至6-6.8后,搅拌条件下加入木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混合酶进行酶解得到酸性酶解液,酶解温度为55-60℃,酶解时间5-10h;其中,木瓜蛋白酶的酶用量为40-60U/g(基于鱼鳞湿重计),风味蛋白酶的酶用量为20-30U/g(鱼鳞)。
2)二次碱性酶解:
将所得酸性酶解液用氢氧化钠溶液调节pH至7.4-7.6后,加入胶原蛋白酶和碱性蛋白酶的混合酶进行搅拌酶解,酶解温度为37-45℃,酶解时间6-12h;其中,胶原蛋白酶加酶量为40-50U/g(鱼鳞,湿重计,下同),碱性蛋白酶加酶量为20-30U/g(鱼鳞),所述胶原蛋白酶选自溶组织梭菌胶原蛋白酶或溶藻弧菌胶原蛋白酶中的至少一种;所述碱性蛋白酶选自Properase E或枯草杆菌碱性蛋白酶,优选Properase E碱性蛋白酶。
3)酶解后在100℃水浴加热条件灭酶10-15min,然后在4℃条件下用高速连续离心机高速离心(10-13K RPM)15-20min,取出上清液,得到酶解胶原肽粗溶液。
步骤S3:初步超滤分离:
将制得的酶解胶原肽粗溶液进行超滤过滤;其中酶解胶原肽溶液经截留分子量为2000-3000道尔顿(简称D或Dal)的超滤膜去除大分子杂质,得到超滤处理的酶解胶原肽溶液。
通过超滤处理,可以使得未完全水解的大分子胶原蛋白和水解程度较高的胶原肽分子分离;其中,将截留的未完全水解的大分子胶原蛋白回收并添加到前述酶解步骤的原料中继续酶解处理。
该步骤无需除盐或添加活性炭进行脱色脱腥处理。
步骤S4:基于磁性微球介质进行非特异性分离
1)将经过超滤处理的酶解胶原肽溶液适度浓缩后上样于去离子水冲洗平衡处理的分离柱,所述分离柱从上到下依次分段装填有介孔二氧化硅填料以及磁性微球填料,所述磁性微球填料由分段装填的聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料、PVA磁性微球填料组成(两种磁性微球装填的上下顺序没有限制;另外,也可以采用两种微球填料混合后装填的方式,即PMMA/PVA混合微球填料作为分离柱下段),其中上端介孔二氧化硅填料高度不超过总填料高度的30%,优选10-30%,且装填于上部;优选地,聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料、PVA磁性微球填料的用量为0.5-2:1,更优选1:1,即等量装填。
其中,所述聚甲基丙烯酸酯磁性微球优选聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球(PMMA),更优选表面氨基或羧基改性的微球(以增强与胶原三肽端基氨基酸残基的氢键键合能力),优选粒度10-50微米、孔径低于200nm的那些。
其中,所述聚乙烯醇磁性微球优选粒径20-50微米,表面羟值不低于10mmol/g的那些。
该步骤中,尽管聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料、PVA磁性微球填料可以混合装填,但是优选采用分段装填以便于后续再生处理阶段的填料分离。
其中,所述介孔二氧化硅粒径1-10微米,优选1-5微米。在经过该部填料时,相比较容易进入孔隙结构的胶原三肽,溶液中的大分子肽及盐类非肽组分更容易快速通过,从而与胶原三肽进行初步分开,利于后续微球填料进一步分离。
2)先用2-3柱体积的乙醇水溶液(体积分数10-20%)洗脱除盐及非肽类小分子杂质,然后依次用8-10倍柱体积的去离子水和稀氨水(3-8wt%)(3-5倍柱体积)作为洗脱液洗脱,直至洗脱液中基本不含多肽或氨基酸组分。收集、合并含胶原三肽组分的洗脱液,减压蒸发氨组分并浓缩,得到二氧化硅/磁性微球组合填料非特异性分离后的胶原三肽粗品溶液。
其余含大分子肽的洗脱液进行减压蒸发溶剂、浓缩后可以作为回收母液与下一批待分离原料混合以循环利用,减压浓缩的真空度例如可以为-0.9MPa或以上。
其中,根据HPLC检测洗脱液中胶原三肽组分(HPLC色谱分析方法及条件是已知的,本申请参照WO2016/076647)。具体地,基于胶原三肽标准品(甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸)的为胶原三肽标准品参考。该步骤中,取样干燥后液相色谱分析,所得胶原三肽产品纯度或含量在60%以上。
该步骤中,由于磁性微球表面富含的羟基、氨基等表面基团与胶原三肽类短肽的端基氨基酸残基产生的氢键键合等分子间作用力更强(越小的肽,其氨基、羧基等基团比例越高),以及小分子肽更容易进入微球的内部空隙,洗脱速率更慢,进而使得胶原三肽与大分子肽分离开来。例如,聚乙烯醇磁性微球的表面羟基越丰富,与胶原三肽类小肽的氢键键合力越强。
另外,相比直接使用非磁性微球,磁性微球具有更均匀的粒径分布以及孔道结构,且微球尺寸相对较大(相比较硅胶层析类),分离速率较快;同时磁性金属颗粒所带的金属螯合/配位作用力,以及微球表面富含的羟基、氨基、羧基等基团使得与不同大小的多肽分子作用力强弱不同,使得多肽分离相比较单纯的吸附层析分离更加高效、快速。
其中,聚乙烯醇或聚甲基丙烯酸酯磁性微球可按照本领域一般方法制备(磁性微球的制备为本领域已知技术),也可商购获得。
示例性地,PVA磁性制备流程如下:将聚乙烯醇在水中加热溶解,搅拌成均匀溶液;称取摩尔比为1:2的氯化亚铁、氯化铁混合原料溶解于适量去离子水中,搅拌均匀后加入到上述PVA溶液中,开启搅拌,加入适量液体石蜡或吐温搅拌均匀;水浴加热条件下分批加入浓氨水,加入完毕后继续搅拌反应;反应完毕后冷却至室温,离心或磁性分离微球,去离子水洗涤微球颗粒,真空干燥,得到表面包覆聚乙烯醇的磁性微球。
其中,表面修饰的聚甲基丙烯酸酯磁性微球也可以按照本领域已知的微球表面修饰方法进行,或进行商购获得。例如,表面氨基修饰的聚甲基丙烯酸酯磁性微球可按照如下方法制得:取聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球、低级烷基胺例如乙胺/二胺和丙烯酸酯类硅烷偶联剂分散于醇溶剂中,水浴搅拌加热反应6-12h,成微球后经洗涤即得。其中,例如,磁性微球与脂肪胺的质量比可以为10:1-3。
示例性地,取聚甲基丙烯酸甲酯磁性微、胺和丙烯酸酯偶联剂分散于甲醇中,搅拌反应12h,反应后分离微球,依次经醇、去离子水洗涤后得氨基修饰的聚甲基丙烯酸酯磁性微球,干燥后备用。
步骤S5:采用分子印迹法进行梯度固相萃取纯化
采用基于不同模板分子的分子印迹法对上述非特异性分离的胶原三肽粗品溶液进行进一步选择性纯化分离,该步骤包括将非特异性分离的胶原三肽粗品溶液真空浓缩后上样于含有基于不同模板分子制备的分子印迹聚合物分离柱内,然后进行洗脱。
其中,所述的不同模板分子包括:端基为甘氨酸(Gly)的胶原三肽模板分子、端基为甘氨酸(Gly)的二肽模板分子、胶原三肽特征氨基酸(甘氨酸、羟脯氨酸)模板分子中的至少两种,优选三种即全部。
具体地,所述端基为Gly的胶原三肽模板分子选自甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(Gly-Pro-Hyp)、甘氨酸-羟脯氨酸-脯氨酸(Gly-Hyp-Pro)中的至少一种,优选至少包含Gly-Pro-Hyp。
所述端基为甘氨酸(Gly)的二肽模板分子选自Gly-Pro、Gly-Hyp中的至少一种,优选至少包含Gly-Pro。
所述胶原三肽特征氨基酸为甘氨酸和/或羟脯氨酸,优选至少包含Hyp。
优选地,所述胶原三肽模板分子为Gly-Pro-Hyp和Gly-Hyp-Pro组合模板分子,其中Gly-Pro-Hyp模板分子的摩尔含量不低于50%(优选不低于60%),记为模板分子A。
优选地,所述二肽模板分子为Gly-Pro和Gly-Hyp组合模板分子;其中Gly-Pro模板分子摩尔含量不低于50%(优选不低于60%),记为模板分子B。
优选地,所述胶原三肽特征氨基酸为Gly和Hyp组合模板分子,其中Gly模板分子摩尔含量不低于30%,记为模板分子C。
其中,所述的分子印迹聚合物是以上述胶原三肽、二肽以及特征氨基酸为模板分子,在功能单体和交联剂存在下采用热聚合技术制备而成。分子印迹聚合物的制备可按照本领域一般方法进行,其制备方法是本领域熟知的。
具体地,分别以上述模板分子A、B、C为模板分子,采用丙烯酰胺类功能单体,在丙烯酸酯类交联剂和引发剂存在下进行热聚合反应得到相应的聚合物(可记为聚合物A、B、C),水解或洗脱去除聚合物中的模板分子从而得到所述胶原三肽衍生物分子印迹聚合物。
示例性地,将胶原三肽模板分子(A,B,C)在有机溶剂中搅拌混匀,加入功能单体丙烯酰胺或甲基丙烯酸;再加入交联剂(例如,N,N'-亚甲基双丙烯酰胺或乙二醇二甲基丙烯酸酯EGDMA),以及适量引发剂偶氮二异丁腈AIBN或过氧硫酸铵。超声混匀后在氮气气氛下密封反应体系,60℃下搅拌反应16-24h;反应结束后,过滤,依次用去离子水、丙酮充分洗涤,干燥,再将聚合物过筛控制粒径均匀度,然后依次用盐酸及饱和氯化钠溶液进行处理除去模板分子(模板分子A、B),并用乙腈-水溶液、无水甲醇充分浸泡洗涤残余模板分子、功能单体等有机物,最后将所得聚合物微球进行真空干燥,获得分子印迹聚合物。
具体地,采用分子印迹法进行梯度固相萃取纯化的步骤如下:
1)从上到下依次将模板分子A、B、C制备的分子印迹聚合物微球装柱(优选地,模板分子A、B制备的分子印迹聚合物装柱体积不低于总体积的50%),用去离子水平衡柱后,上样浓缩后的胶原三肽粗品溶液(优选控制肽含量不超过0.1g/ml);然后用1-3倍柱体积的去离子水洗脱除杂,除去不能特异性吸附的大分子肽等组分。
其中,该步骤所得除杂液经蒸发浓缩后可以作为母液循环利用于该步骤,或与上一步骤母液合并后作为原料循环利用。
其中,该步操作中多肽的量以不超过分子印迹聚合物的最大吸附量的50%为宜;优选地,分子印迹聚合物的实际加入量远超过理论用量。
2)然后依次采用5-10倍柱体积的去离子水、3-5倍柱体积的乙醇-水溶液(优选10-20%体积分数),以及1-5wt%的稀氨水充分洗脱至基本不含氨基酸及肽组分,合并收集的胶原三肽洗脱液。
3)洗脱液合并后经0.22μm滤膜过滤后,减压蒸发浓缩去除有机溶剂及氨组分并控制固含量浓度,然后进行喷雾干燥或冷冻干燥,得到具有高含量胶原三肽的组合物,其中,分子量不大于1KDa的小分子胶原肽含量不低于95%,胶原三肽含量不低于80%。经干燥处理、辐照灭菌后封装。
本发明以胶原三肽、二肽分子模板以及特征氨基酸分子印迹聚合物相结合的分子印迹方式,不仅能够实现胶原三肽及其衍生物的快速分离纯化,通过多层析的特异性吸附还能够显著提高包含胶原三肽在内的小分子肽的纯化效率。这种采用分段填料式的梯度固相萃取的手段,相比单一模板分子的分子印迹手段,使得填料体系中聚合物填料的胶原三肽分子特异性结合的位点分布更为广泛,填料聚合物上强下弱的特异性梯度吸附方式,不仅避免了分子印迹对于多肽分子吸附结合强度不足的问题,还更有利于胶原三肽分子的同步洗脱,使得胶原三肽组分相对集中地洗脱,利于提高所得胶原三肽的纯度。
第二个方面,本发明提供基于上述方法得到的胶原三肽组合物产品,其特征在于,胶原三肽含量不低于80%,且其中分子量大于1KDa的肽含量不超过5%。
第三个方面,本发明还提供所述胶原三肽组合物产品在美容领域、化妆品或皮肤护理领域、药品领域和食品领域中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果:
1)本发明对预处理后的胶原蛋白原料进行两次酶解之后,采用特定体系的磁性微球分离、分子印迹聚合微球介质固相萃取相结合的手段进行纯化分离,尤其是借助基于胶原三肽分子结构而设计特征氨基酸、二肽模板分子、三肽模板分子相结合的分子印迹手段,对于端基为甘氨酸且富含羟脯氨酸的胶原三肽具有优良的选择性。克服了现有纯化方法通过离子交换和柱层析色谱无法批量获得高纯度胶原三肽的弊端;本发明方法可以显著提高产品的分离效率和分离纯度,胶原三肽含量达到80%甚至85%以上。
2)本发明采用基于磁性微球的非特异性吸附分离,相比大分子肽,越小数目的小分子肽例如二肽及胶原三肽具有相对高比例的表面裸露氨基、羧基/羟基等端基基团,从而与磁性微球表面基团的氢键键合力越强,这种大、小肽分子与微球表面基团分子间作用力的不同,使得大批量的胶原三肽分离具有更显著的效果。
3)本发明通过不同分子印迹聚合物组合填料的梯度固相萃取,使得胶原三肽分子被分层式特异性吸附,显著提高了纯化效率;而不含胶原三肽特征氨基酸的其他肽分子尤其是相对大的肽片段容易被洗脱,从而容易与胶原三肽衍生物分离开来。
本发明发现,相同条件下,由胶原三肽分子形态的模板分子A制备的分子印迹聚合物对胶原三肽衍生物的选择性最高,结合力也最强(洗脱速率相对较慢),因此适合上层装柱;由二肽分子形态的模板分子B制备的分子印迹聚合物对胶原三肽衍生物的选择性和结合性次之,而由特征氨基酸(甘氨酸和/或羟脯氨酸)模板分子C制备的分子印迹聚合物对胶原三肽衍生物的选择性和结合性相对较差,易于洗脱,因此用于下层装柱。含有较多氨基酸残基的较大肽分子(1000D以上),与分子印迹聚合物组合填料的特异性吸附能力较差,易于洗脱,从而显著了降低分离纯化所得成品中1000D以上大分子肽的含量(一般不超过5%)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明,但这些实施方式并非对本发明的保护范围构成任何形式的限定。
制备例1
制备表面氨基修饰的聚甲基丙烯酸酯磁性微球
取聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球100g、乙二胺12g和30g三甲氧基甲硅烷基取代的丙烯酸酯偶联剂分散于1L甲醇中,密闭反应釜在45℃水浴温度下缓慢搅拌反应12h,反应后过滤分离微球,依次经甲醇、去离子水充分洗涤,得氨基修饰的聚甲基丙烯酸酯磁性微球,干燥后备用。
制备例2
制备分子印迹聚合物
1)将1mmol胶原三肽模板分子A(Gly-Pro-Hyp:Gly-Hyp-Pro摩尔比为8:2的组合模板分子)在50ml的DMSO和氯仿混合溶剂(等体积比)中搅拌混匀,加入10mmol功能单体丙烯酰胺以及40mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯,以及680mg偶氮二异丁腈。超声混匀后置换氮气气氛,密封反应体系,于60℃和200rpm下恒速搅拌反应24h;反应结束后,过滤,依次用去离子水、丙酮充分洗涤,干燥,再将聚合物过筛控制均匀度,然后依次用浓度5mol/L的盐酸水解多肽模板分子并用饱和氯化钠溶液浸泡洗涤进行脱除模板分子,再用30%体积分数的乙腈-水溶液、无水甲醇充分浸泡以洗涤残余模板分子、功能单体等有机物,最后将所得聚合物微球于50℃下进行真空干燥,获得平均粒径大小约为50μm的分子印迹聚合物。
2)除了将模板分子A替换为等摩尔量模板分子B
(Gly-Pro:Gly-Hyp=7:3摩尔比的组合模板分子)之外,采用上述步骤1)相同操作制备得到分子印迹聚合物B。
3)除了将模板分子A替换为等摩尔量模板分子C(Gly:Hyp=5:5摩尔比的组合模板分子),以及无需采用盐酸水解之外,采用上述步骤1)相同操作制备得到分子印迹聚合物C。
实施例1
制备高纯度胶原三肽,步骤如下:
步骤S1:对胶原蛋白原料预处理
将5kg的鱼鳞(来源鲤鱼)洗净,烘干并粉碎至约40目,在50L水中浸泡6h,浸泡温度50℃,然后过滤沥干水分;所得固体用30L浓度为0.2M的HCl溶液在室温下浸泡5h,然后用清水漂洗、过滤至干净;放入带有搅拌的加热釜,加入25kg去离子水,在温度100℃及密封搅拌条件下加热处理8h,获得鱼鳞质胶液。将所得鱼鳞质胶液趁热过滤去除固体鱼鳞残渣等杂质;将滤液冷却至室温,得到粗胶原蛋白胶液。
步骤S2:复合酶解:将所得粗胶原蛋白胶液依次经酸性酶解、碱性酶解,步骤如下:
1)取所得粗胶原蛋白胶液蒸发浓缩至约11kg,用盐酸调节溶液pH至6.5-6.6,搅拌条件下加入木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混合酶进行酶解得到酸性酶解液,酶解温度为55-56℃,酶解时间6h,得到酸性酶解液;其中,木瓜蛋白酶的酶用量为50U/g(基于鱼鳞湿重计,下同),风味蛋白酶的酶用量为25U/g。
2)将所得酸性酶解液用氢氧化钠溶液调节pH至7.5-7.6后,加入胶原蛋白酶(溶组织梭菌胶原蛋白酶)和碱性蛋白酶(Properase E)的混合酶进行搅拌酶解,酶解温度为40-42℃,酶解时间8h;其中,胶原蛋白酶加酶量为50U/g(鱼鳞),碱性蛋白酶加酶量为30U/g(鱼鳞)。
3)酶解后在100℃加热条件下灭酶15min,然后在4℃条件下分批用高速连续离心机高速离心(12000RPM)20min,取出并合并上清液,得到酶解胶原肽粗溶液。
步骤S3:将上述制得的酶解胶原肽粗溶液进行超滤过滤;其中酶解胶原肽溶液经截留分子量为2000D的超滤膜去除大分子杂质,得到超滤处理的酶解胶原肽溶液约9.8Kg。
步骤S4:基于磁性微球介质进行非特异性分离
1)取1L上述经过超滤处理的酶解胶原肽溶液分批上样于去离子水冲洗平衡处理的125cm分离柱,所述分离柱从上到下依次分段装填介孔二氧化硅填料(粒径约3-5微米)以及复合磁性微球填料,所述复合磁性微球填料由等重量比的上述制备例制得的氨基表面修饰的聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料(PMMA)、PVA磁性微球填料(粒径30-40微米)分上下两段装填组成(两种磁性微球装填的上下顺序没有限制,即聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料也可作为下段填料),其中上端介孔二氧化硅填料高度为总填料高度的五分之一。
2)先用2.5柱体积的乙醇水溶液(体积分数10%)洗脱以除去盐及非肽类小分子杂质,然后用8倍柱体积去离子水以及约3倍柱体积稀氨水(5wt%)分别作为洗脱液洗脱,洗脱流速为3BV/h;直至各自洗脱液中基本不含多肽或氨基酸组分。收集合并含胶原三肽组分的洗脱液,减压蒸发氨组分并浓缩,得到经过二氧化硅/磁性微球组合填料非特异性分离后的胶原三肽粗品溶液。
其余洗脱液进行减压蒸发溶剂、浓缩后作为回收母液与下一批待分离原料混合以循环利用,减压浓缩的真空度为-0.9MPa。
其中,基于胶原三肽标准品(甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸)的HPLC色谱为参照,由HPLC监测分析洗脱液中胶原三肽组分,进而收集含胶原三肽组分的洗脱液。HPLC色谱分析条件参照WO2016/076647(即流动相为10mM Tris-Cl,pH 7.4、5mM CaCl2,流速:0.5ml/min)。测得该步骤中,胶原三肽粗品溶液中胶原三肽相对含量在68%左右。
步骤S5:采用分子印迹法进行梯度固相萃取纯化,步骤如下:
1)按照从上到下的顺序依次将上述制备例中制备的分子印迹聚合物微球A、B、C填料装柱,装填高度约80cm(其中,分子印迹聚合物A、B、C装柱体积量比分别为4:4:2),用去离子水平衡柱后,将浓缩后的经非特异性分离的胶原三肽粗品溶液(含量约0.1g/ml)分批上样;然后用3倍柱体积的去离子水洗脱除杂。除杂液经蒸发浓缩后作为母液回收原料循环利用。
2)依次采用5倍柱体积去离子水、3倍柱体积的乙醇水溶液(20%体积分数)洗脱,最后用5wt%的稀氨水充分洗脱至基本不含氨基酸及肽组分,收集洗脱液组分。将洗脱液合并后经0.22μm滤膜过滤,减压蒸发浓缩,去除醇类溶剂及氨组分,得到纯化的胶原三肽溶液。进一步地,将所得浓缩液进行喷雾干燥,得到具有高含量胶原三肽的固体组合物。取样由HPLC含量分析,结果表明分子量1KDa以下的小分子胶原肽含量约96.4%,胶原三肽(Gly-X-Y)含量88.3%,其中甘氨酸-脯氨酸-羟脯氨酸(GPH)含量约18.7%。
实施例2
制备步骤S1-S3同实施例1(即采用实施例1步骤S3中的超滤处理的酶解胶原肽溶液)。步骤S4-S5如下:
步骤S4:非特异性分离
1)取1L经过超滤处理的酶解胶原肽溶液分批上样于去离子水冲洗平衡处理的125cm分离柱,所述分离柱从上到下依次分段装填介孔二氧化硅填料以及复合磁性微球填料,所述复合磁性微球填料由等重量比的氨基表面修饰的聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料(PMMA)、PVA磁性微球填料直接混合组成,其中上端介孔二氧化硅填料高度为总填料高度的30%。
2)先用2柱体积的乙醇水溶液(体积分数10%)洗脱除杂,然后用10倍柱体积去离子水洗脱,并用稀氨水(5wt%)洗脱至基本不含多肽组分,洗脱流速为2.5BV/h;收集合并含胶原三肽组分的洗脱液,减压蒸发醇溶剂、氨组分并浓缩,得到非特异性分离后的胶原三肽粗品溶液。其余洗脱液进行减压蒸发溶剂、浓缩后作为回收母液与下一批待分离原料混合以循环利用。
由HPLC取样分析,测得该步骤中胶原三肽含量约在69.6%(可能不同微球混合使得孔隙更小,以及混合微球填料的表面基团种类更加复杂,与多肽分子间吸附作用力增强,导致三肽纯度提高,但是也使得洗脱不完全导致额外增加产品柱损耗,同时导致两种微球的后期分离回收困难,因此该混合填料方式不是优选的方式)。
步骤S5:采用分子印迹法进行梯度固相萃取纯化,步骤如下:
1)按照从上到下的顺序依次将上述制备例中制备的分子印迹聚合物微球A、B、C填料装柱,装填高度约80cm(其中,分子印迹聚合物A、B、C装柱体积量比分别为5:3:2),用去离子水平衡柱后,将浓缩后的经非特异性分离的胶原三肽粗品溶液(约0.12g/ml)分批上样;然后用3倍柱体积的去离子水洗脱除杂。除杂液经蒸发浓缩后作为母液回收原料循环利用。
2)依次采用6倍柱体积去离子水、3.5倍柱体积的乙醇水溶液(20%体积分数)洗脱,最后用5wt%的稀氨水充分洗脱至基本不含氨基酸及肽组分,收集洗脱液组分。将洗脱液合并后经0.22μm滤膜过滤,减压蒸发浓缩,去除醇类溶剂及氨组分,得到纯化的胶原三肽溶液。将所得浓缩液进行喷雾干燥,得到具有高含量胶原三肽的固体组合物。取样经HPLC含量分析,结果表明胶原三肽(Gly-X-Y)含量86.8%,其中GPH含量约20.1%。
该结果表明,增加分子印迹聚合物微球A填料比例有利于一定程度上提高特异性吸附的GPH含量,但是其他填料B、C的相对比例降低,导致了总的胶原三肽吸附性能下降,反而不利于胶原三肽的总含量提高。
对比例
步骤S1-S2同实施例1(即采用实施例1步骤S2中的酶解胶原肽粗溶液)。其余步骤如下:
步骤S3:取1L酶解胶原肽粗溶液用活性炭脱色并过滤;然后滤液上大孔吸附树脂柱,先用3倍柱体积20%乙醇洗脱除盐及小分子有机杂质;然后用去离子水及5wt%氨水充分洗脱收集去离子水洗脱液及氨水洗脱液,然后蒸发浓缩;
步骤S4:将上述洗脱液进行纳滤过滤:先采用截留分子量为1000D的纳滤膜,透过液经截留分子量为200D的纳滤膜浓缩(进膜操作压力0.25MPa),得到胶原三肽溶液,经冷冻干燥得到鱼鳞胶原三肽组合物,其中胶原三肽(CTP)含量约70.1%(其中GPH含量约9.8%),产率(肽粉/鱼鳞,基于干重计)约为11.6%(相比实施例1下降约36%,可能由于活性炭脱色步骤损耗以及大孔树脂非特异性吸附损耗导致,以及纳滤膜步骤损耗)。
以上实施例并非限制本发明的技术方案,本领域的普通技术人员可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,这些修改或者替换并不脱离本发明技术方案的范围。
Claims (9)
1.一种从胶原蛋白酶解液中分离纯化胶原三肽的方法,所述胶原蛋白酶解液由胶原蛋白原料经预处理、复合酶酶解得到,所述酶解至少包括一种胶原蛋白酶;其特征在于,包括以下步骤:
1)胶原蛋白酶解液经纳滤或超滤处理后进行非特异性吸附分离,所述非特异性吸附分离采用选自聚甲基丙烯酸酯基磁性微球或聚乙烯醇基磁性微球中的至少一种填料介质进行;
优选地,所述非特异性吸附分离还采用二氧化硅进行预分离;
2)采用分子印迹法进行梯度固相萃取纯化:将经过非特异性吸附分离所得的胶原肽上样于不同模板分子制备的分子印迹聚合物分离柱内进行特异性分离纯化;其中,所述的不同模板分子选自:端基为Gly的三肽模板分子、端基为Gly的二肽模板分子、胶原三肽特征氨基酸模板分子中的至少两种;
其中,所述的胶原三肽特征氨基酸选自甘氨酸、羟脯氨酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括如下具体步骤S1-S5:
步骤S1:制备酶解胶原肽溶液:对胶原蛋白原料预处理,得到粗胶原蛋白胶液;其中,所述胶原蛋白原料选自鱼鳞、脱脂鱼皮或二者混合物;
步骤S2:将所得粗胶原蛋白胶液依次进行酸性酶解、碱性酶解行两次酶解,其中,所述酶解至少包括胶原蛋白酶;
步骤S3:将制得的酶解胶原肽粗溶液进行超滤过滤;其中酶解胶原肽溶液经截留分子量为2000-3000D的超滤膜过滤,得到超滤处理的酶解胶原肽溶液;
步骤S4:基于磁性微球介质进行非特异性分离
将经过超滤处理的酶解胶原肽溶液上样于分离柱,所述分离柱从上到下依次分段装填有介孔二氧化硅填料以及磁性微球填料,所述磁性微球填料由聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料、PVA磁性微球填料组成,其中上端介孔二氧化硅填料高度不超过总填料高度的30%;优选地,磁性微球填料中聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料、PVA磁性微球填料的质量用量为0.5-2:1;
步骤S5:梯度固相萃取纯化
采用基于不同模板分子制备的分子印迹聚合物对上述经过非特异性分离处理的胶原三肽粗品溶液进行选择性纯化分离,其中,所述的不同模板分子包括:端基为Gly的胶原三肽模板分子、端基为Gly的二肽模板分子、胶原三肽特征氨基酸模板分子;
其中,所述端基为Gly的胶原三肽模板分子选自Gly-Pro-Hyp、Gly-Hyp-Pro中的至少一种,所述端基为Gly的二肽模板分子选自Gly-Pro、Gly-Hyp中的至少一种,所述胶原三肽特征氨基酸模板分子选自甘氨酸、羟脯氨酸中的至少一种;
其中,分别以上述不同的模板分子,采用丙烯酰胺类功能单体在丙烯酸酯类交联剂和引发剂存在下进行热聚合反应得到相应的聚合物,去除聚合物中的模板分子从而得到相应的分子印迹聚合物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S4具体操作如下:
1)将经过超滤处理的酶解胶原肽溶液浓缩后上样于分离柱,所述分离柱从上到下依次分段装填有介孔二氧化硅填料以及磁性微球填料,所述磁性微球填料由分段装填的聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料、PVA磁性微球填料组成,其中上端介孔二氧化硅填料高度不超过总填料高度的30%,且装填于上部;聚甲基丙烯酸酯磁性微球填料、PVA磁性微球填料的用量为1:1;
其中,所述聚甲基丙烯酸酯磁性微球为聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球,粒度10-50微米;其中,所述聚乙烯醇磁性微球粒径20-50微米;所述介孔二氧化硅粒径1-10微米;
2)先用体积分数10-20%的乙醇水溶液洗脱除杂,然后依次用去离子水和3-8wt%的稀氨水作为洗脱液洗脱,至洗脱液中基本不含多肽或氨基酸组分,收集合并含胶原三肽组分的洗脱液,减压蒸发氨组分并浓缩,得到非特异性分离后的胶原三肽粗品溶液。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S5具体操作如下:
1)从上到下依次将胶原三肽模板分子、二肽模板分子、胶原三肽特征氨基酸模板分子制备的分子印迹聚合物微球装柱,其中,胶原三肽模板分子、二肽模板分子制备的分子印迹聚合物装柱体积不低于总装柱体积的50%;上样胶原三肽粗品溶液;用1-3倍柱体积的去离子水洗脱除杂;
2)依次用去离子水、10-20%体积分数的乙醇水溶液以及1-5wt%的稀氨水洗脱,至基本不含氨基酸及肽组分时合并胶原三肽洗脱液;
3)洗脱液经0.22μm滤膜过滤后,减压蒸发浓缩去除有机溶剂及氨组分,然后进行喷雾干燥或冷冻干燥,从而得到具有高含量胶原三肽的组合物,其中,胶原三肽含量不低于80%。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S2具体操作如下:
1)酸性酶解:将所得粗胶原蛋白胶液用盐酸溶液调节pH至6-6.8后,搅拌条件下加入木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的混合酶进行酶解得到酸性酶解液,酶解温度为55-60℃,酶解时间5-10h;其中,基于鱼鳞重量计,木瓜蛋白酶的酶用量为40-60U/g(鱼鳞),风味蛋白酶的酶用量为20-30U/g(鱼鳞);
2)将所得酸性酶解液用氢氧化钠溶液调节pH至7.4-7.6后,加入胶原蛋白酶和碱性蛋白酶的混合酶进行搅拌酶解,酶解温度为37-45℃,酶解时间6-12h;所述胶原蛋白酶选自溶组织梭菌胶原蛋白酶或溶藻弧菌胶原蛋白酶中的至少一种,所述碱性蛋白酶选自Properase E或枯草杆菌碱性蛋白酶中的至少一种;其中,胶原蛋白酶加酶量为40-50U/g(鱼鳞),碱性蛋白酶加酶量为20-30U/g(鱼鳞);
3)酶解后在100℃加热条件下灭酶10-15min,然后在4℃条件下用高速连续离心机高速离心15-20min,得到酶解胶原肽粗溶液。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述碱性蛋白酶选自Properase E碱性蛋白酶。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述步骤S1具体操作如下:
采用鱼鳞为原料,可直接加水粉碎制浆;也可将鱼鳞洗净、烘干处理后粉碎并过筛,然后按照如下步骤进行处理:取粉碎后的鱼鳞粉在水中充分浸泡,然后捞出沥干水分;用相当于鱼鳞5-15倍重量的0.1-0.3M浓度HCl溶液在室温下浸泡3-5h,然后用清水漂洗干净;将洗净的鱼鳞放入带有搅拌的加热釜,加入5-10倍质量的去离子水,在温度95-100℃及搅拌下加热处理6-8h,获得鱼鳞质胶液;将所得鱼鳞质胶液进行趁热过滤去除固体杂质;将滤液冷却至室温,得到粗胶原蛋白胶液。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法制备得到的胶原三肽组合物,其特征在于,组合物为固体形式,且其中胶原三肽含量不低于80%。
9.权利要求8所述的组合物在化妆品或皮肤护理领域、药品领域和食品领域中的应用。
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Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001061355A1 (en) * | 2000-02-18 | 2001-08-23 | Aspira Biosystems, Inc. | Molecular impriniting compositions and methods for binding and analyzing macromolecules |
US20030138649A1 (en) * | 2001-11-30 | 2003-07-24 | Qiao Tiecheng A. | Method for making biochip substrate |
CN101220128A (zh) * | 2008-01-31 | 2008-07-16 | 复旦大学 | 一种聚甲基丙烯酸甲酯复合微球及其制备方法和应用 |
CN101788541A (zh) * | 2009-01-24 | 2010-07-28 | 复旦大学 | 一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法 |
CN102485758A (zh) * | 2010-12-03 | 2012-06-06 | 江南大学 | 谷胱甘肽分子印迹聚合物及其制备和应用方法 |
CN103254355A (zh) * | 2013-06-06 | 2013-08-21 | 贵州大学 | 肌肽分子印迹聚合物、其制备方法及应用 |
CN107353336A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-17 | 兰溪市沉默生物科技有限公司 | 从深海鱼鱼皮中提取的胶原蛋白 |
CN107418897A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-12-01 | 内蒙古阜丰生物科技有限公司 | 一种有效利用谷氨酸发酵废弃菌体蛋白的工艺 |
CN107574207A (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-12 | 陈栋梁 | 一种高精氨酸混合肽的制备方法及其在结直肠癌治疗中的应用 |
CN109897101A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-18 | 卓康(福建)生物科技有限公司 | 一种胶原蛋白三肽及其生产方法和应用 |
CN110144377A (zh) * | 2019-07-15 | 2019-08-20 | 鲁东大学 | 一种贝类高f值寡肽的制备方法 |
CN116162677A (zh) * | 2023-02-16 | 2023-05-26 | 山东太爱肽生物科技股份有限公司 | 一种高纯度鱼皮胶原三肽的制备方法 |
-
2023
- 2023-08-25 CN CN202311081618.0A patent/CN117165646A/zh active Pending
Patent Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2001061355A1 (en) * | 2000-02-18 | 2001-08-23 | Aspira Biosystems, Inc. | Molecular impriniting compositions and methods for binding and analyzing macromolecules |
US20030138649A1 (en) * | 2001-11-30 | 2003-07-24 | Qiao Tiecheng A. | Method for making biochip substrate |
CN101220128A (zh) * | 2008-01-31 | 2008-07-16 | 复旦大学 | 一种聚甲基丙烯酸甲酯复合微球及其制备方法和应用 |
CN101788541A (zh) * | 2009-01-24 | 2010-07-28 | 复旦大学 | 一种分离富集和鉴定大分子量蛋白质的方法 |
CN102485758A (zh) * | 2010-12-03 | 2012-06-06 | 江南大学 | 谷胱甘肽分子印迹聚合物及其制备和应用方法 |
CN103254355A (zh) * | 2013-06-06 | 2013-08-21 | 贵州大学 | 肌肽分子印迹聚合物、其制备方法及应用 |
CN107574207A (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-12 | 陈栋梁 | 一种高精氨酸混合肽的制备方法及其在结直肠癌治疗中的应用 |
CN107418897A (zh) * | 2017-04-27 | 2017-12-01 | 内蒙古阜丰生物科技有限公司 | 一种有效利用谷氨酸发酵废弃菌体蛋白的工艺 |
CN107353336A (zh) * | 2017-07-27 | 2017-11-17 | 兰溪市沉默生物科技有限公司 | 从深海鱼鱼皮中提取的胶原蛋白 |
CN109897101A (zh) * | 2019-03-14 | 2019-06-18 | 卓康(福建)生物科技有限公司 | 一种胶原蛋白三肽及其生产方法和应用 |
CN110144377A (zh) * | 2019-07-15 | 2019-08-20 | 鲁东大学 | 一种贝类高f值寡肽的制备方法 |
CN116162677A (zh) * | 2023-02-16 | 2023-05-26 | 山东太爱肽生物科技股份有限公司 | 一种高纯度鱼皮胶原三肽的制备方法 |
Non-Patent Citations (6)
Title |
---|
ABUINE等: "Biological activity of peptides purified from fish skin hydrolysates", 《FISHERIES AND AQUATIC SCIENCES》, 23 May 2019 (2019-05-23), pages 10 * |
侯会卿;苏黎明;黄嫣嫣;金钰龙;赵睿;: "表面分子印迹材料和技术在分离分析中的应用进展", 色谱, no. 12, 8 December 2016 (2016-12-08) * |
刘克建;屈琦超;: "分子印迹技术在天然活性成分分离纯化中的研究进展", 食品工业科技, no. 22, 15 November 2018 (2018-11-15) * |
李亚楠 等: "胶原三肽生物活性及其应用研究进展", 《食品工业科技》, 12 October 2017 (2017-10-12), pages 334 * |
王婧: "用于药物成分分离的分子印迹聚合物微球的制备、性能及其检测应用研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库(电子期刊)工程科技I辑》, 15 June 2012 (2012-06-15), pages 014 - 220 * |
郭敏杰;高婷;樊志;么敬霞;夏建军;宓怀风;: "利用辅助识别聚合物链制备牛血清白蛋白分子印迹聚合物", 中国科学:化学, no. 03, 15 March 2010 (2010-03-15) * |
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