CN103626847A - 一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽及其制备方法。该锌螯合肽包含SEQIDNo.1和/或SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；其制备方法包括：以脱脂小麦胚芽为原料，经过蛋白质提取和酶法水解，得到含有锌螯合肽的酶解物，再依次采用固定化锌离子亲和层析，大孔吸附树脂和反相高效液相色谱进一步筛选、分离出目标产物。本发明的锌螯合肽金属螯合作用强，可作为运输锌等微量元素的载体，提高微量元素的吸收，特别是在与锌形成肽-锌螯合物生物后，其生物利用率高于无机锌，更易于消化吸收，并满足机体对蛋白质的需求，而其制备方法所采用的原料低廉，工艺简单，易于规模化实施。

Description

一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽及其制备方法

技术领域

本发明特别涉及一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽及其制备方法，属于小麦精深加工技术领域。

背景技术

锌是人体不可缺少的微量元素, 锌缺乏可导致儿童生长发育不良、智力发育落后、免疫力降低等。传统的锌补充剂是无机盐和简单有机酸盐类，如硫酸锌、葡萄糖酸锌、甘草锌、柠檬酸锌等。但是研究表明它们稳定性差，吸收利用率低，并且对肠胃刺激大，不可长期服用。近年来，金属螯合肽得到了国内外学者的广泛关注。锌可与金属螯合肽形成螯合盐，并能借助肽的吸收特点和机制以螯合盐整体的形式，促进微量元素的吸收，同时又能满足机体对蛋白质的需求。

小麦胚芽是面粉加工过程中的副产物，麦胚蛋白占小麦胚芽的30%左右，蛋白含量仅次于大豆，是优质的植物蛋白。麦胚蛋白中蕴藏着许多具有生物活性的氨基酸序列，用特定的蛋白酶水解可以释放出生物活性肽。已有研究者从麦胚蛋白水解物中分离得到抗氧化多肽、血管紧张素转化酶抑制肽和钙螯合肽。但是关于利用小麦胚芽制备锌螯合肽尚未有报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽，其金属螯合作用强，可作为运输锌等微量元素的载体，且其与锌形成的肽-锌螯合物生物利用率高于无机锌，更易于消化吸收，能满足机体对蛋白质的需求，从而克服现有技术中的不足。

本发明的另一目的在于提供一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其采用固定化锌离子亲和层析柱实现了对锌离子具有较强螯合作用的小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的精确有效制备。

为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：

一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽，包含SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，包括如下步骤：

(i) 将脱脂小麦胚芽粉碎成脱脂麦胚粉，而后制成脱脂麦胚蛋白粉；

(ii) 将脱脂麦胚蛋白粉溶于水配置成脱脂麦胚蛋白悬液，并调节pH值8.0-8.5，加入碱性蛋白酶，在50-60 ℃进行水解反应，同时维持反应体系的pH值保持恒定，水解反应完毕后，将酶解液于沸水中灭酶10 min以上，迅速冷却，在4 ℃以8000 r/min以上的速度离心30 min以上，收集上清液，微滤除去杂质，将滤液冷冻干燥得麦胚蛋白酶解物；

(iii) 将麦胚蛋白酶解物溶于水配置成样品溶液，并使样品溶液通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用水和含有0.1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液进行洗脱；

  (iv) 将步骤(iii)所获磷酸缓冲液洗脱液通过大孔吸附树脂DA201-C，用水洗去盐分，再用70 v/v % - 80 v/v %乙醇水溶液洗脱，并收集洗脱液；

 (v) 将步骤(iv)所获洗脱液在35-55 ℃进行旋转蒸发、冷冻干燥，得到肽粉；

    (ⅵ) 将步骤(v)所获肽粉以反相高效液相色谱分离纯化，其中色谱条件包括：检测波长为215 nm，采用10 v/v %的甲醇溶液作为洗脱液，收集与峰面积最大的峰对应的洗脱物冷冻干燥，获得所述麦胚蛋白源锌螯合肽。

进一步的，步骤(ii)包括：将脱脂麦胚蛋白粉溶于水形成浓度为5 w/v %-10 w/v %的脱脂麦胚蛋白悬浮液，用碱调节pH值至8.0-8.5，然后加入0.024 AU/g碱性蛋白酶，在50-60 ℃条件下进行水解反应200 min，同时用酸或碱维持反应体系的pH值恒定，水解反应完毕后，将酶解液于沸水浴灭酶10-15 min，迅速冷却，在4 ℃以8000-10000 r/min的转速离心30-60 min，收集上清液，将上清液以0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后，获得麦胚蛋白酶解物。

进一步的，步骤(iii)包括：将步骤(ii)所获麦胚蛋白酶解物溶于水形成浓度为10-20 mg/mL的样品溶液，再使样品溶液以1-2 mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱，并以水洗去未结合或弱结合的肽，而后以含有0.1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱出强结合肽；

进一步的，步骤(iv)包括：将步骤(iii)所获磷酸缓冲液洗脱液通过大孔吸附树脂柱，并记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样，然后用水以1-2 mL/min流速洗涤，当洗脱液的电导率与水一致时，再用70 v/v %-80 v/v %的乙醇水溶液以1-2 mL/min流速进行洗脱。

进一步的，步骤(v)包括：将步骤（iv）所获洗脱液在温度45-55 ℃下进行旋转蒸发，再将浓缩组分进行冷冻干燥。

    进一步的，所述固定化锌离子亲和层析柱包括Zn-IDA-壳聚糖柱，且不限于此。

进一步的，所述大孔吸附树脂包括DA201-C树脂，且不限于此。

进一步的，所述反相高效液相色谱柱包括Diamonsil C18柱，且不限于此。

进一步的，作为其中的一种实施方案，步骤（1）包括：将脱脂麦胚粉经超声波辅助碱提酸沉方法处理获得脱脂麦胚蛋白粉。与现有技术相比，本发明的优点至少在于：

（1）实现了小麦胚芽的进一步利用，且所获肽与锌形成的肽-锌螯合物天然无副作用，锌生物利用率高达44.19%，明显高于无机锌（23.05%），可促进锌在人体的吸收利用，同时补充了人体对蛋白质的需求，可用于食品、保健品等；

（2）采用固定化锌离子亲和色谱进行特异性分离，目的性明确，工作量小，分离效率高，实现了对锌离子具有较强螯合作用的小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的精确高效制备。

附图说明

图1为本发明一较佳实施例中固定化锌离子亲和层析柱的分离图谱；

图2为本发明一较佳实施例中大孔吸附树脂DA201-C的分离图谱；

图3为本发明一较佳实施例中反相高效液相色谱的分离图谱。

具体实施方式

如前所述，鉴于现有技术中的不足，本发明的一个方面旨在提供一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽，其包含SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，对锌等微量元素具有强的金属螯合作用，且其与锌形成的肽-锌螯合物生物利用率高于无机锌，更易于消化吸收，并能满足机体对蛋白质的需求。

本发明的另一个方面旨在提供一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法。在本发明的一典型实施方式中，该制备方法可包括如下步骤：

(i) 蛋白质提取步骤：

称取一定质量的脱脂麦胚溶于去离子水(10 w/v %-20w/v %), 用1 mol/L NaoH溶液调节pH至8.5-9.5，置于超声波药品处理机搅拌(低频，25-35 ℃，30-60 min),离心(3500-4500 r/min, 30 min), 将离心所得沉淀重复上述超声波辅助碱溶过程，合并两次上清液。用1mol/L HCl溶液调节上清液pH至4.0-4.5，充分搅拌，离心(3500-4500 r/min, 30 min), 弃去上清液收集沉淀。用60 v/v %乙醇溶液洗涤沉淀3次，离心(3500-4500 r/min, 30 min), 取沉淀，冷冻干燥后得脱脂麦胚蛋白粉。

前述脱脂小麦胚芽可由市售等途径获得，例如，可采用由益海嘉里（昆山）食品有限公司提供的相关产品，脱脂后的小麦胚芽蛋白质含量>30wt%。

前述冷冻干燥使用的实验器具亦可通过市售途径获得，比如，可采用美国LABCONCO美国公司销售的相关产品。

(ii) 酶解反应步骤：

在酶反应器中制备浓度为5 w/v %-10 w/v %脱脂麦胚蛋白质悬浮液，用1-2 mol/L NaOH溶液调节pH至8.0-8.5，然后加入0.024 AU/g碱性蛋白酶，在50-60℃条件下进行水解反应200 min，同时用1-2 mol/L NaOH溶液维持反应介质的pH值恒定，水解反应完毕后，酶解液于沸水中灭酶10 min，迅速冷却，以8000- 10000 r/min，4 ℃离心30-35 min，收集上清液。将上清液以0.45 μm微孔滤膜过滤，除去大分子物质，将滤液冷冻干燥，获得麦胚蛋白酶解物。

在本发明中，所述的蛋白酶可采用诺维信（中国）生物技术有限公司生产的碱性蛋白酶Alcalase 2.4L，当然亦可采用其它类似市售产品。

 (iii) 固定化锌离子亲和层析柱分离步骤：

将步骤(ii)中麦胚蛋白酶解物溶于双蒸水配置成样品溶液，并使样品溶液通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用双蒸水和含有0.1 mol/L的NaCl的磷酸缓冲液进行洗脱；

在本发明中，固定化锌离子亲和层析柱分离条件如下：色谱柱：1.6×30 cm；检测波长：220 nm；样品浓度：10-20 mg/mL；流速：1-2 mL/min。其分离图谱见图1。其中F1是双蒸水洗脱液；F2是磷酸缓冲液洗脱液。

所述固定化锌离子亲和层析柱为实验室采用如下的方法自制：取2 g壳聚糖溶解在100 mL 浓度为3wt%的CH₃COOH溶液中, 磁力搅拌至完全溶解。取250 mL三角瓶，加入液体石蜡(100 mL)与span80(1 mL)，充分混匀，边搅拌边缓慢加入壳聚糖溶液，待形成壳聚糖微球后滴入戊二醛至浓度为2%，在40℃恒温水浴振荡器中反应2 h。加入适量石油醚和2 mol/L的NaOH溶液，去除石蜡并沉淀壳聚糖微球，水洗并用布氏漏斗抽干。将得到的戊二醛交联湿状壳聚糖微粒加入50 mL NaBH₄与NaOH混合液（8.76 g NaOH + 0.75 g NaBH₄定容至100 mL）， 在室温下反应2 h，涮洗抽滤，将收集的壳聚糖微球定容到100 mL, 并加入适量的环氧氯丙烷溶液，在室温下反应2 h，水洗并用布氏漏斗抽干。按活化壳聚糖比例加入适量浓度的IDA溶液50 mL，在65 ℃水浴摇床中反应24 h，水洗并用布氏漏斗抽干。将制备好的IDA-壳聚糖填料装柱(1.6×30 cm)，用双蒸水流洗3个柱体积，接着用0.1 mol/L的ZnSO₄?7H₂O溶液流洗4个柱体积，使填料充分吸附Zn²⁺，再用双蒸水洗去未结合的Zn²⁺，得到固定化锌离子亲和层析柱。最后用0.05 mol/L pH6.0的磷酸缓冲液平衡层析柱。

在本发明中，所述壳聚糖购自无锡华盛环保科技有限公司，脱乙酰度＞90%；亚氨基二乙酸二钠（IDA）购自美国Sigma公司；其他试剂均为分析纯，购自于上海国药集团有限公司。

(iv) 大孔吸附树脂分离步骤

将步骤(iii)所获磷酸缓冲液洗脱液通过大孔吸附树脂柱，紫外检测器记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样，然后用双蒸水以1-2 mL/min流速洗涤，当洗脱液的电导率与双蒸水一致时，再用70 v/v %-80 v/v %的乙醇水溶液以1-2 mL/min流速进行洗脱。

在本发明中，大孔吸附树脂柱分离条件如下：色谱柱：2.6×30 cm；检测波长：220 nm；样品浓度：20-30 mg/mL；流速：1-2 mL/min。其分离图谱见图2。其中F21是双蒸水洗脱液；F22是70%-80%乙醇洗脱液。

所述大孔吸附树脂能通过分子间作用力吸附溶液中的多肽，使盐分与多肽实现分离，同时，本身的多孔性结构也使其具备一定的分子筛作用。由于该树脂与多肽之间为物理性吸附，被吸附的多肽较易洗脱，并具有成本低、效率高、树脂易回收再生等优点，因此大孔吸附树脂分离技术现已大量用于化工、食品、医药等领域。

所述大孔吸附树脂可采用江苏苏青水处理工程集团有限公司提供的DA201-C型产品。

(v) 蒸发浓缩步骤：

步骤(iv)得到的70%-80%乙醇洗脱液在温度45-55 ℃下进行旋转蒸发，将浓缩的组分进行冷冻干燥，得到肽粉。

前述旋转蒸发浓缩可通过上海亚荣生化仪器厂提供的RE-52A旋转蒸发器而实施，且不限于此。

冷冻干燥使用的设备如前面所述的设备。

(ⅵ) 反相高效液相色谱分离步骤：

将上述步骤(v)得到的肽粉采用反相高效液相色谱分离制备。收集峰面积最大的峰冷冻干燥。其分离谱图见图3，图中F223即峰面积最大的组分。

在本发明中，反相高效液相色谱分离条件如下：色谱柱：Diamonsil C18（5 μm，4.6×250 mm）；流速：1.0 mL/min；检测波长：215 nm；柱温：25 ℃；流动相：10 v/v %甲醇溶液。

冷冻干燥使用的设备如前面所述的设备。

(ⅶ) 质谱分析多肽氨基酸序列：

将步骤(ⅵ)得到的麦胚蛋白锌螯合肽F223使用超高分辨飞行时间质谱仪分析氨基酸序列，得到母离子m/z 1081 Da的氨基酸序列为NAPLPPPLKH（SEQ ID No.1）和母离子m/z 1221 Da氨基酸序列为HNAPNPGLPYAA（SEQ ID No.2）的两个肽段。

所述质谱仪是美国AB SCIEX公司生产的5800 MALDI TOF/TOF超高分辨飞行时间质谱仪，其具体步骤如下：麦胚蛋白锌螯合肽F223样品与等体积基质溶液（CHCA与0.1%三氟乙酸、50%乙腈水溶液配制而成，终浓度为0.5 g/L）均匀混合，点0.5 μL样品于MALDI靶板点样空中，自然干燥后再点0.5 μL CHCA（0.5g/L）溶液，室温下自然干燥。空白对照为点样空中未加样品，只加0.5 μL CHCA(0.5g/L)。质谱仪条件如下：OptiBeam同轴激光器，激光波长为355 nm，离子加速电压为20 kV，频率为1 kHz，正离子反射模式采集数据，质谱扫描范围为m/z 500-4000 Da。质谱分析后，将样品的一级质谱图与空白对照对比，选取有显著差异的肽段离子进行串联质谱分析。

本发明的麦胚蛋白源锌螯合肽制备方法，其特点在于采用亲和层析实现特异性分离，利用大孔吸附树脂有效脱盐，经反相高效液相色谱分离纯化得到的麦胚蛋白源锌螯合肽由两个氨基酸序列明确的肽段组成。

前述麦胚蛋白源锌螯合肽能够与微量元素锌形成肽-锌螯合物，可在制备微量元素添加剂、食品强化剂等之中应用。

作为较为优选的实施方案之一，前述肽-锌螯合物可按照如下方法制得：

准确称取一定质量前述麦胚蛋白源锌螯合肽，用少量水溶解，用酸或碱调至pH 值至6.0, 按肽:锌质量比4:1的比例加入锌溶液，在65 ℃下搅拌混合反应50 min，冷却，4000 r/min 离心20 min，除去上清液，用适量水洗涤、离心数次后，用95 v/v %乙醇洗涤抽滤2-3 次，抽干后于100 ℃左右烘干，所得白色粉末即为肽-锌螯合物，经动物试验发现，其在小鼠体内的吸收率锌生物利用率高达44.19%，明显高于无机锌制剂（23.05%），且未出现副作用。

最后应说明的是，以上实施方案仅用以说明本发明装置的技术方案，而非对其限制；尽管前述方案对本发明装置进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述方案所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明装置方案的精神和范围。

sequence table

 

<110> Jiangnan University

 

<120> Zinc-chelating peptides from wheat germ protein and its  preparation method

 

<160>  2

 

<210>  1

<211>  10

<212>  PTR

<213>  triticum germine

<400>  1

Asn Ala Pro Leu Pro Pro Pro Leu Lys His

1                5                  10

 

<210>  2

<211>  12

<212>  PTR

<213>  triticum germine

<400>  2

His Asn Ala Pro Asn Pro Gly Leu Pro Tyr Ala Ala

1                5                  10

Claims (9)

1.一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽，其特征在于，它包含SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

2.一种小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(i) 将脱脂小麦胚芽粉碎成脱脂麦胚粉，而后制成脱脂麦胚蛋白粉；

(ii) 将脱脂麦胚蛋白粉溶于水配置成脱脂麦胚蛋白悬液，并调节pH值8.0-8.5，加入碱性蛋白酶，在50-60 ℃进行水解反应，同时维持反应体系的pH值保持恒定，水解反应完毕后，将酶解液于沸水中灭酶10 min以上，迅速冷却，在4 ℃以8000 r/min以上的速度离心30 min以上，收集上清液，微滤除去杂质，将滤液冷冻干燥得麦胚蛋白酶解物；

(iii) 将麦胚蛋白酶解物溶于水配置成样品溶液，并使样品溶液通过固定化锌离子亲和层析柱，分别用水和含有0.1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液进行洗脱；

  (iv) 将步骤(iii)所获磷酸缓冲液洗脱液通过大孔吸附树脂DA201-C，用水洗去盐分，再用70V/V%-80 V/V %乙醇水溶液洗脱，并收集洗脱液；

 (v) 将步骤(iv)所获洗脱液在35-55℃进行旋转蒸发、冷冻干燥，得到肽粉；

    (ⅵ) 将步骤(v)所获肽粉以反相高效液相色谱分离纯化，其中色谱条件包括：检测波长为215 nm，采用10%（v/v）的甲醇溶液作为洗脱液，收集与峰面积最大的峰对应的洗脱物冷冻干燥，获得所述麦胚蛋白源锌螯合肽。

3.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤(ii)包括：将脱脂麦胚蛋白粉溶于水形成浓度为5 w/v %-10 w/v %的脱脂麦胚蛋白悬浮液，用碱调节pH值至8.0-8.5，然后加入0.024 AU/g碱性蛋白酶，在50-60 ℃条件下进行水解反应200min，同时用酸或碱维持反应体系的pH值恒定，水解反应完毕后，将酶解液于沸水浴灭酶10-15 min，迅速冷却，在4 ℃以8000-10000 r/min的转速离心30-60 min，收集上清液，将上清液以0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液经冷冻干燥后，获得麦胚蛋白酶解物。

4.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤(iii)包括：将步骤(ii)所获麦胚蛋白酶解物溶于水形成浓度为10-20 mg/mL的样品溶液，再使样品溶液以1-2 mL/min的流速通过固定化锌离子亲和层析柱，并以水洗去未结合或弱结合的肽，而后以含有0.1 mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱出强结合肽。

5.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤(iv)包括：将步骤(iii)所获磷酸缓冲液洗脱液通过大孔吸附树脂柱，并记录A_220nm，当A_220nm达到0.05时停止上样，然后用水以1-2 mL/min流速洗涤，当洗脱液的电导率与水一致时，再用70 v/v %-80 v/v %的乙醇水溶液以1-2 mL/min流速进行洗脱。

6.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于，步骤(v)包括：将步骤（iv）所获洗脱液在温度45-55 ℃下进行旋转蒸发，再将浓缩组分进行冷冻干燥。

7.根据权利要求2或4所述小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于，所述固定化锌离子亲和层析柱包括Zn-IDA-壳聚糖柱。

8.根据权利要求2或5所述小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂包括DA201-C树脂。

9.根据权利要求2所述小麦胚芽蛋白源锌螯合肽的制备方法，其特征在于，所述反相高效液相色谱柱包括DiamonsilC18柱。

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