CN107574204A

CN107574204A - 一种鹿骨肽螯合金属离子及其制备和应用

Info

Publication number: CN107574204A
Application number: CN201610494511.2A
Authority: CN
Inventors: 靳艳; 叶明亮; 晏嘉泽
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2016-06-29
Filing date: 2016-06-29
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明涉及一种鹿骨肽螯合金属离子的制备方法。本发明建立了以鹿骨为原料的鹿骨肽螯合金属离子的制备方法，利用本发明制备鹿骨螯合肽与铁、铜、锌、钙等金属离子螯合制备成为补充剂，促进金属离子在人体内的吸收，可应用于食品、保健品、药品等领域，具有广阔的应用前景。

Description

一种鹿骨肽螯合金属离子及其制备和应用

技术领域

本发明涉及鹿骨肽螯合金属离子，具体地说是一种鹿骨肽螯合金属离子的制备方法。

背景技术

金属离子在人体生理活动中发挥着重要的作用，当食物中的金属元素不足时会导致各种疾病，需额外补充满足人体生理需求。人体中金属元素的吸收是一个复杂的过程，不仅取决于宿主的生理、生物及激素情况，还受饮食及金属元素吸收情况的影响。绝大部分金属离子在人体小肠中被吸收，从消化系统到达小肠时pH从7急剧下降到5.5，当到达回肠末端时pH又逐渐升至7.5左右，因此金属离子在不同pH下的溶解度直接决定了其在人体的吸收情况。

鹿骨是我国传统中药，在我国有悠久使用历史，《中医大辞典》中记载鹿骨具有补虚羸，强筋骨的功效。鹿骨中的主要活性组分是蛋白质和钙，蛋白质和钙相辅相成使鹿骨发挥功效。鹿骨传统采用汤煎、浸酒或者直接服用，传统的水煎法和酒浸法获得的钙的含量非常低、直接服用时鹿骨的钙不溶解，钙的生物利用率更低，传统服用方式都无法最大程度发挥鹿骨生物功能。

本发明将鹿骨的蛋白质进行降解并富集具有螯合金属离子能力的肽，利用螯合肽与不同的金属离子螯合制备功能各异的金属离子补充剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种鹿骨肽螯合金属离子的制备方法，本发明通过酶解将鹿骨中蛋白质降解，利用固定化亲和色谱材料富集具有螯合功能的肽，螯合肽可与不同的金属离子反应制备成为具有不同功效的鹿骨肽螯合金属离子，可用作人体金属元素补充剂。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

将鹿骨脱脂、酶解，利用吸附材料富集具有螯合功能的肽，将螯合肽与不同的金属离子反应，制备成鹿骨肽螯合金属离子，用做人体金属元素补充剂。

以上所述的鹿骨肽螯合金属离子制备方法，将干燥鹿骨粉碎为100～500目的粉末，鹿骨粉末中加入水，鹿骨粉末质量与水的体积比为1:10～50(g：ml)，在90～100℃保温0.5～2小时；结束后用200～500目滤网过滤，沉淀用于酶解。

脱脂的鹿骨粉末与0.1M的HCI溶液混合，鹿骨粉末质量与HCI的体积比为1:5～50(g:ml)，鹿茸与溶液搅拌均匀后加入鹿骨质量0.1～5％的蛋白酶，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时；酶解结束后将pH调节至3～7，再加入鹿骨质量0.1～5％的蛋白酶，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时，酶解结束后将pH调节为7～8，以5000～10000g的速度离心10～30分钟，上清液冻干即为鹿骨酶解物。

将钛固定化亲和色谱(Ti-IMAC)材料与富集缓冲液按照1:5～20(g:ml)的比例混合，富集缓冲液的组成为含80％乙睛和6％三氟乙酸的水溶液，再按照Ti-IMAC：鹿骨酶解物＝5～50:1(g:g)的比例加入鹿骨酶解物，混合均匀后震荡0.5～2小时，再以10000～30000g的速度离心2～10分钟；离心所得沉淀中加入与富集缓冲液相同体积的冲洗缓冲液A，冲洗缓冲液A的组成为含50％乙睛、6％三氟乙酸、20mM NaCl的水溶液，混合均匀后震荡0.5～2小时，再以10000～30000g的速度离心2～10分钟；离心所得沉淀再次加入与冲洗缓冲液A相同体积的冲洗缓冲液B，冲洗缓冲液B的组成为含30％乙睛和0.1％三氟乙酸的水溶液，混合均匀后震荡0.5～2小时，再以10000～30000g的速度离心2～10分钟；离心所得的沉淀中加入与冲洗缓冲液B相同体积的10％氨水溶液，混合均匀后震荡0.5～2小时后超声15～60分钟，再以10000～30000g的速度离心2～10分钟，收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨螯合肽。

将鹿骨螯合肽溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，配置成为浓度为1～5％的溶液，加入金属离子溶液使其在反应体系中的浓度达到0.1～2mM，室温下搅拌反应1～2小时；反应结束后以10000～30000g的速度离心10～20分钟，收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨肽螯合金属离子。

所述蛋白水解酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等蛋白酶中的一种或几种组合。

所述的金属离子溶液为Fe²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺等，可分别制备成为鹿骨肽螯合铁、鹿骨肽螯合锌、鹿骨肽螯合钙。

与传统鹿骨制备服用方式相比，利用本发明制备的金属鹿骨螯合肽可显著提高金属离子的溶解度，进而提高金属离子在人体的生物利用率，作为膳食补充剂具有广阔的应用前景。

本发明具有如下优点：

1.所制备的金属螯合鹿骨肽具有很好的溶解性，可显著提高金属离子在人体中的生物利用率。

2.反应条件温和、方法简便可行。本发明通过酶解法制备鹿骨肽、利用固定化亲和色谱材料富集的螯合肽、金属离子溶液与螯合肽反应制备成具有不同功能的金属鹿骨螯合肽，反应条件温和、反应方法简单可行，可大规模生产。

3.具有良好的应用前景。本发明按照传统滋补保健品鹿骨的功效，将鹿骨蛋白与金属离子相螯合，通过本工艺制得的活性成分更容易被人体吸收、食用更方便，因此作为药品、功能食品、食品具有广泛的应用前景。

具体实施方式

实施例1

以新鲜梅花鹿鹿骨为原料，按照以下工艺制备：

将1公斤干燥鹿茸粉碎为100目的粉末，加入10升的水中加热至95℃保温1小时，结束后用200目滤网过滤，沉淀用于酶解。

脱脂的鹿骨粉末与5升0.1M的HCI溶液混合，搅拌均匀后加入1克胃蛋白酶，于40℃酶解2小时；酶解结束后将pH调节至7，再加入1克胰蛋白酶，在40℃反应5小时，反应结束后将pH调节至8，以5000g的速度离心30分钟，上清液冻干即为鹿骨酶解物。

将2.5公斤Ti-IMAC材料溶于12.5升含80％乙睛和6％三氟乙酸的水溶液中，加入上述鹿骨酶解物，混合均匀后震荡0.5小时，再以10000g的速度离心2分钟；离心所得沉淀中加入12.5升含50％乙睛、6％三氟乙酸、20mM NaCl的水溶液，混合均匀后震荡0.5小时，再以10000g的速度离心2分钟；离心所得沉淀中加入12.5升含30％乙睛和0.1％三氟乙酸的水溶液，混合均匀后震荡0.5小时，再以10000g的速度离心2分钟；收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨螯合肽。

将鹿骨螯合肽溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，配置成为浓度为1％的溶液，加CaCl₂溶液使其在反应体系中的浓度达到0.1mM，室温下搅拌反应1小时；反应结束后以10000g的速度离心20分钟，收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨肽螯合钙。

实施例2

以马鹿鹿骨为原料，按照以下工艺制备：

将1公斤干燥鹿茸粉碎为300目的粉末，加入20升的水中加热至100℃保温1小时，结束后用200目滤网过滤，沉淀用于酶解。

脱脂的鹿骨粉末与20升0.1M的HCI溶液混合，搅拌均匀后加入10克胃蛋白酶，于40℃酶解2小时；酶解结束后将pH调节至5，再加入10克菠萝蛋白酶，在50℃反应5小时，反应结束后将pH调节至8，以10000g的速度离心30分钟，上清液冻干即为鹿骨酶解物。

将5公斤Ti-IMAC材料溶于50升含80％乙睛和6％三氟乙酸的水溶液中，加入上述鹿骨酶解物，混合均匀后震荡1小时，再以20000g的速度离心10分钟；离心所得沉淀中加入50升含50％乙睛、6％三氟乙酸、20mM NaCl的水溶液，混合均匀后震荡0.5小时，再以10000g的速度离心2分钟；离心所得沉淀中加入50升含30％乙睛和0.1％三氟乙酸的水溶液，混合均匀后震荡0.5小时，再以10000g的速度离心2分钟；收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨螯合肽。

将鹿骨螯合肽溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，配置成为浓度为2％的溶液，加FeCl₃溶液使其在反应体系中的浓度达到1mM，室温下搅拌反应1小时；反应结束后以10000g的速度离心20分钟，收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨肽螯合铁。

实施例3

以马鹿鹿骨为原料，按照以下工艺制备：

将1公斤干燥鹿茸粉碎为500目的粉末，加入50升的水中加热至90℃保温2小时，结束后用200目滤网过滤，沉淀用于酶解。

脱脂的鹿骨粉末与50升0.1M的HCI溶液混合，搅拌均匀后加入50克胃蛋白酶，于40℃酶解2小时；酶解结束后将pH调节至5，再加入50克木瓜蛋白酶，在50℃反应10小时，反应结束后将pH调节至8，以10000g的速度离心30分钟，上清液冻干即为鹿骨酶解物。

将25公斤Ti-IMAC材料溶于500升含80％乙睛和6％三氟乙酸的水溶液中，加入上述鹿骨酶解物，混合均匀后震荡1小时，再以20000g的速度离心10分钟；离心所得沉淀中加入500升含50％乙睛、6％三氟乙酸、20mM NaCl的水溶液，混合均匀后震荡0.5小时，再以10000g的速度离心2分钟；离心所得沉淀中加入500升含30％乙睛和0.1％三氟乙酸的水溶液，混合均匀后震荡1小时，再以10000g的速度离心5分钟；收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨螯合肽。

将鹿骨螯合肽溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，配置成为浓度为5％的溶液，加Zn(O₂CCH₃)₂溶液使其在反应体系中的浓度达到2mM，室温下搅拌反应1小时；反应结束后以10000g的速度离心20分钟，收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨肽螯合锌。

实施例4

以新鲜梅花鹿鹿骨为原料，按照以下工艺制备：

脱脂的鹿骨粉末与5升0.1M的HCI溶液混合，搅拌均匀后加入1克胃蛋白酶，于40℃酶解2小时；酶解结束后将pH调节至7，再加入1克中性蛋白酶，在50℃反应5小时，反应结束后将pH调节至8，以5000g的速度离心30分钟，上清液冻干即为鹿骨酶解物。

将鹿骨螯合肽溶于pH7.0的磷酸缓冲液中，配置成为浓度为1％的溶液，加CuSO₄溶液使其在反应体系中的浓度达到1mM，室温下搅拌反应1小时；反应结束后以10000g的速度离心20分钟，收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨肽螯合铜。

本发明建立了以鹿骨为原料的鹿骨肽螯合金属离子的制备方法，利用本发明制备鹿骨螯合肽与铁、铜、锌、钙等金属离子螯合制备成为补充剂，促进金属离子在人体内的吸收，可应用于食品、保健品、药品等领域，具有广阔的应用前景。

Claims

1.一种鹿骨肽螯合金属离子的制备方法，其特征在于：将鹿骨脱脂、酶解，利用吸附材料富集具有螯合功能的肽，将螯合肽与人体所需的金属离子反应，制备成鹿骨肽螯合金属离子。

2.按照权利要求1所述的鹿骨肽螯合金属离子的制备方法，其特征在于：

(1)将干燥鹿骨粉碎为100～500目的粉末，鹿骨粉末中加入水，鹿骨粉末质量与水的体积比为1:10～50(g：ml)，在90～100℃保温0.5～2小时；结束后用200～500目滤网过滤，沉淀用于酶解；

(2)脱脂的鹿骨粉末与0.05～0.2M的HCl溶液混合，鹿骨粉末质量与HCI溶液的体积比为1:5～50(g:ml)，鹿茸与溶液搅拌均匀后加入鹿骨质量0.1～5％的蛋白酶A，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时；酶解结束后用0.1-0.5M HCl或NaOH将pH调节至3～7，再加入鹿骨质量0.1～5％的蛋白酶B，在20～80℃温度下酶解0.5～24小时，酶解结束后用0.1-0.5MHCl或NaOH将pH调节为7～8，酶解完成，以5000～10000g的速度离心10～30分钟，上清液冻干即为鹿骨酶解物；

(3)将钛固定化亲和色谱(Ti-IMAC)材料与富集缓冲液按照1:5～20(g:ml)的比例混合，富集缓冲液的组成为含60～90wt％乙睛和1～10wt％三氟乙酸的水溶液，再按照Ti-IMAC：鹿骨酶解物＝5～50:1(g:g)的比例加入鹿骨酶解物，混合均匀后震荡0.5～2小时，再以10000～30000g的速度离心2～10分钟；离心所得沉淀中加入与富集缓冲液相同体积的冲洗缓冲液A，冲洗缓冲液A的组成为含40～60wt％乙睛、1～10wt％三氟乙酸、10～50mM NaCl的水溶液，混合均匀后震荡0.5～2小时，再以10000～30000g的速度离心2～10分钟；离心所得沉淀再次加入与冲洗缓冲液A相同体积的冲洗缓冲液B，冲洗缓冲液B的组成为含10～40wt％乙睛和0.05～0.2wt％三氟乙酸的水溶液，混合均匀后震荡0.5～2小时，再以10000～30000g的速度离心2～10分钟；离心所得的沉淀中加入与冲洗缓冲液B相同体积的5～20wt％氨水溶液，混合均匀后震荡0.5～2小时后超声15～60分钟，再以10000～30000g的速度离心2～10分钟，收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨螯合肽；

(4)将鹿骨螯合肽溶于pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液中，配置成为质量浓度为1～5％的溶液，加入金属离子溶液使其在反应体系中的浓度达到0.1～2mM，室温下搅拌反应1～2小时；反应结束后以10000～30000g的速度离心10～20分钟，收集上清液，冷冻干燥即为鹿骨肽螯合金属离子。

3.按照权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶A和蛋白酶B分别为胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等蛋白酶中的一种或二种以上组合，且蛋白酶A和蛋白酶B所采用的蛋白酶不同。

4.按照权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述的金属离子为Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺等中的一种或二种以上，可分别制备成为鹿骨肽螯合铁、鹿骨肽螯合锌、鹿骨肽螯合钙、鹿骨肽螯合铜中的一种或二种以上。

5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的金属离子溶液的阴离子为Cl^-、O₂CCH₃ ^-、SO₄ ^2-中的一种或二种以上。

6.一种权利要求1-5所述制备方法获得的鹿骨肽螯合金属离子。

7.一种权利要求6所述的鹿骨肽螯合金属离子用做人体金属离子补充剂。