CN112641933A - 一种动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物加工技术领域，具体地说，涉及一种动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法。包括制备血红蛋白、制备血红蛋白多肽以及对血红蛋白多肽溶液进行处理等步骤，最后得到血红蛋白多肽粉。本发明设计可以保证血液原料的活性，提高血红蛋白多肽的产量，且可以提高产品的抗氧化性，进而延长成品的保存期限，同时可以提高冷冻的速度及效果，另外可以在保持血红蛋白多肽活性的前提下，快速完成血红细胞蛋白的冷冻操作，降低加工过程中血红蛋白多肽的失活率，提高药物成品的质量，保证血红蛋白多肽可以更好地发挥补血功效。
Description
技术领域
本发明涉及药物加工技术领域，具体地说，涉及一种动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法。
背景技术
动物类中药的有效成分以蛋白多肽为主，因此活性蛋白多肽具有重要的医疗保健价值。动物血红蛋白多肽应用到保健药品中，具有良好的补血及抗贫血功能。但是，动物血红细胞蛋白多肽在加工过程中，很多因素都会影响血液原料中血红蛋白多肽的含量及活性，从而导致成品药物中的血红蛋白多肽含量降低，导致成品药物的质量低下，无法有效发挥血红多肽的补血功效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，以解决上述背景技术中提出的问题，包括如下步骤：
S1、制备血红蛋白；
S2、制备血红蛋白多肽；
S3、对血红蛋白多肽溶液进行冷冻、干燥及粉化处理，得到血红蛋白多肽粉。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1中，制备血红蛋白的方法包括如下步骤：
S1.1、将新鲜动物血液与4％的柠檬酸钠抗凝剂按照体积比为6:1混合后过滤，将过滤后的血液按照体积比为1:1加入0.9％NaCl水溶液进行洗涤；
S1.2、将混合后的溶液转移至离心管中，设置温度为4℃、离心转速3000rpm、离心时间10min，弃上清液，反复洗涤两次、离心，后收集下层红细胞；
S1.3、将收集的红细胞用4～6倍体积冷生理盐水再洗涤2～3次后，在42℃下超声25min进行溶血处理，超声粉碎时加入适当体积的水，保持操作时溶液处于流动状态；
S1.4、将充分溶血的红细胞溶液置于离心机中，设置温度4℃、离心转速4200rpm、离心时间15min，取上层液得到血红蛋白。
作为本技术方案的进一步改进，所述S1.3中，进行溶血处理的操作过程中，超声波细胞破碎仪的功率为200W。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2中，制备血红蛋白多肽的方法包括如下步骤：
S2.1、称取一定的血红蛋白，用蒸馏水调节血红蛋白溶液浓度至8.5～9.0％；
S2.2、加入一定的以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶进行酶解，加入稀HCl调节pH为6.5，设定温度为50℃、水解时间4.5h；
S2.3、再加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，加入稀NaOH调节pH至9.0～9.5，设定温度为55～58℃，酶解4～6h；
S2.4、设定离心转速为8200rpm、冷冻离心15min，取上清液得到血红蛋白多肽溶液。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2.2中，加入以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶的含量为20000U/g。
作为本技术方案的进一步改进，所述S2.3中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
作为本技术方案的进一步改进，所述S3中，对血红蛋白多肽溶液进行处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的血红蛋白多肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体的75％；
S3.2、将预冷的血红蛋白多肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的血红蛋白多肽进行低温粉碎，用50～80目筛进行过筛，得到冻干血红蛋白多肽粉。
与现有技术相比，本发明的有益效果：该动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法中，通过选择合适配比的抗凝剂，可以保证血液原料的活性，其次通过合理合适配比多种蛋白酶并调节适宜的反应条件，提高蛋白质裂解的效率及效果，提高血红蛋白多肽的产量，且可以提高产品的抗氧化性，进而延长成品的保存期限，同时通过预冷、敲碎再进一步冷冻的方法，可以提高冷冻的速度及效果，另外通过设置多次的真空-升温循环，可以在保持血红蛋白多肽活性的前提下，快速完成血红细胞蛋白的冷冻操作，降低加工过程中血红蛋白多肽的失活率，提高药物成品的质量，保证血红蛋白多肽可以更好地发挥补血功效。
附图说明
图1为本发明的整体方法流程图；
图2为本发明中制备血红蛋白的方法流程图；
图3为本发明中制备血红蛋白多肽的方法流程图；
图4为本发明中对血红蛋白进行处理的方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
如图1-4所示，本实施例的目的在于，提供一种动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，包括如下步骤：
S1、制备血红蛋白；
S2、制备血红蛋白多肽；
S3、对血红蛋白多肽溶液进行冷冻、干燥及粉化处理，得到血红蛋白多肽粉。
本实施例中，S1中，制备血红蛋白的方法包括如下步骤：
S1.1、将新鲜动物血液与4％的柠檬酸钠抗凝剂按照体积比为6:1混合后过滤，将过滤后的血液按照体积比为1:1加入0.9％NaCl水溶液进行洗涤；
S1.2、将混合后的溶液转移至离心管中，设置温度为4℃、离心转速3000rpm、离心时间10min，弃上清液，反复洗涤两次、离心，后收集下层红细胞；
S1.3、将收集的红细胞用4～6倍体积冷生理盐水再洗涤2～3次后，在42℃下超声25min进行溶血处理，超声粉碎时加入适当体积的水，保持操作时溶液处于流动状态；
S1.4、将充分溶血的红细胞溶液置于离心机中，设置温度4℃、离心转速4200rpm、离心时间15min，取上层液得到血红蛋白。
其中，S1.1中，因钙是凝血反应中不可缺少的元素，而柠檬酸钠能与血液中的钙离子形成配位化合物，进而可以阻止血液凝结，便于对血液进行离心纯化，可以更好地保留细胞蛋白。
进一步地，S1.2中，经离心后使溶液分为上中下三层，其中上层为富含血小板的血浆层，中层为富含白细胞的外周血单核细胞层，下层为红细胞层。
进一步地，S1.3中，进行溶血处理的操作过程中，超声波细胞破碎仪的功率为200W，避免功率过大导致破碎过程中造成溶液溅出或产生泡沫。
本实施例中，S2中，制备血红蛋白多肽的方法包括如下步骤：
S2.1、称取一定的血红蛋白，用蒸馏水调节血红蛋白溶液浓度至8.5～9.0％；
S2.2、加入一定的以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶进行酶解，加入稀HCl调节pH为6.5，设定温度为50℃、水解时间4.5h；
S2.3、再加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，加入稀NaOH调节pH至9.0～9.5，设定温度为55～58℃，酶解4～6h；
S2.4、设定离心转速为8200rpm、冷冻离心15min，取上清液得到血红蛋白多肽溶液。
其中，S2.2中，加入以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶的含量为20000U/g。
其中，S2.3中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
具体地，以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶在中性条件下对蛋白进行水解，可以优化蛋白产品的后期风味、去除苦味、改善口感，进而可以支取风味良好的蛋白水解产品；以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶在碱性条件下具有较强的分解蛋白质的能力，可以将蛋白质分子肽链水解成多肽或氨基酸，较大程度地保留血红蛋白多肽的营养。
本实施例中，S3中，对血红蛋白多肽溶液进行处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的血红蛋白多肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体的75％；
S3.2、将预冷的血红蛋白多肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的血红蛋白多肽进行低温粉碎，用50～80目筛进行过筛，得到冻干血红蛋白多肽粉。
其中，S3.2中，将预冷的血红蛋白多肽敲碎，再进行进一步降温冷冻，可以提高冷冻的速度及全面性，便于强化血红蛋白多肽内部冷冻的效果，进而更好地保持血红蛋白多肽的活性。
实施例2
本实施例中对抗凝剂作出以下三组对比实验：
实验1
抗凝剂采用体积为血液体积10％的4％柠檬酸钠抗凝剂水溶液。
实验2
抗凝剂采用体积为血液体积6.25％的4％枸橼酸钠抗凝剂水溶液。
实验3
抗凝剂采用体积为血液体积11％的草酸盐抗凝剂溶液。
将上述三组实验与不使用抗凝剂在原料价格、溶液外观、溶液毒性、抗凝效果进行对比，具体如下表所示：
| 原料价格(元/吨) | 溶液外观 | 溶液毒性 | 抗凝效果 | |
| 实验1 | 4800 | 无色透明 | 无毒性 | 较佳，保养血液活性 |
| 实验2 | 5200 | 无色澄明 | 无毒性 | 较佳，保护血液因子 |
| 实验3 | 4500 | 绿色透明 | 浓度过高时有害 | 较佳，沉淀物较多 |
| 无抗凝剂 | 无 | 无 | 无 | 极差 |
由上表可以看出，本实施例的动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，通过选择抗凝剂种类与合理调配抗凝剂的配比，避免血液原料凝结，保持血液活性，保护血液中Ⅴ因子和Ⅷ因子的稳定性，保证原材料的高品质，从而便于制备出高质量、高纯度、高天然保真性的蛋白，进而可以更好地保留成品中血红蛋白多肽的高含量和活性。
实施例3
本实施例中对血红蛋白进行酶解的方法作出以下三组对比实验：
实验1
加入一定含量为20000U/g的以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶，加入稀HCl调节pH为6.5，在50℃下水解4.5h后，再加入一定含量为8500U/g的以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，加入稀NaOH调节pH至9.0～9.5，在55～58℃条件下酶解4～6h。
实验2
只加入一定含量为20000U/g的以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶，加入稀HCl调节pH为6.5，在50℃下水解4.5h。
实验3
只加入一定含量为8500U/g的以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，加入稀NaOH调节pH至9.0～9.5，在55～58℃条件下酶解4～6h。
将上述三组实验在多肽得率、DPPH清除性能、O2清除性能、总还原能力进行对比，具体如下表所示：
| 多肽得率 | DPPH清除性能 | O<sub>2</sub>清除性能 | 总还原能力 | |
| 实验1 | 15.36％ | 42.34％ | 44.25％ | 1.996％ |
| 实验2 | 11.45％ | 36.22％ | 17.16％ | 1.017％ |
| 实验3 | 13.99％ | 38.91％ | 43.69％ | 1.982％ |
由上表可以看出，本实施例的动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，通过选择并合理搭配多种蛋白水解酶，可以增强血液蛋白质的酶解效果，提高多肽得率，提高多肽粉成品中的多肽含量，同时提高成品的抗氧化能力，延长成品的保存期限，进而可以更好地保留成品中蛋白多肽的高含量和活性，提高成品的品质。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (7)
1.一种动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、制备血红蛋白；
S2、制备血红蛋白多肽；
S3、对血红蛋白多肽溶液进行冷冻、干燥及粉化处理，得到血红蛋白多肽粉。
2.根据权利要求1所述的动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S1中，制备血红蛋白的方法包括如下步骤：
S1.1、将新鲜动物血液与4％的柠檬酸钠抗凝剂按照体积比为6:1混合后过滤，将过滤后的血液按照体积比为1:1加入0.9％NaCl水溶液进行洗涤；
S1.2、将混合后的溶液转移至离心管中，设置温度为4℃、离心转速3000rpm、离心时间10min，弃上清液，反复洗涤两次、离心，后收集下层红细胞；
S1.3、将收集的红细胞用4～6倍体积冷生理盐水再洗涤2～3次后，在42℃下超声25min进行溶血处理，超声粉碎时加入适当体积的水，保持操作时溶液处于流动状态；
S1.4、将充分溶血的红细胞溶液置于离心机中，设置温度4℃、离心转速4200rpm、离心时间15min，取上层液得到血红蛋白。
3.根据权利要求2所述的动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S1.3中，进行溶血处理的操作过程中，超声波细胞破碎仪的功率为200W。
4.根据权利要求1所述的动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2中，制备血红蛋白多肽的方法包括如下步骤：
S2.1、称取一定的血红蛋白，用蒸馏水调节血红蛋白溶液浓度至8.5～9.0％；
S2.2、加入一定的以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶进行酶解，加入稀HCl调节pH为6.5，设定温度为50℃、水解时间4.5h；
S2.3、再加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶，加入稀NaOH调节pH至9.0～9.5，设定温度为55～58℃，酶解4～6h；
S2.4、设定离心转速为8200rpm、冷冻离心15min，取上清液得到血红蛋白多肽溶液。
5.根据权利要求4所述的动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2.2中，加入以壳聚糖为载体的固定化风味蛋白酶的含量为20000U/g。
6.根据权利要求4所述的动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S2.3中，加入以壳聚糖为载体的固定化碱性蛋白酶的含量为8500U/g。
7.根据权利要求1所述的动物血红蛋白多肽冷冻干燥粉化方法，其特征在于：所述S3中，对血红蛋白多肽溶液进行处理的方法包括如下步骤：
S3.1、将新制得的血红蛋白多肽溶液置于冷冻罐中预冷至-5～-8℃，溶液体积不超过罐体的75％；
S3.2、将预冷的血红蛋白多肽敲碎，轻微搅拌混匀，设置温度-32～-35℃，冷冻2～2.5h；
S3.3、将温度调整为-40～-70℃，冷冻30min后，将冷冻罐抽真空至10～20Pa；
S3.4、设定抽真空-升温循环，即当罐压达到10～20Pa后停止抽真空，缓慢升温使罐压回升，罐压升至90～100Pa后再度抽真空至10～20Pa，随后循环进行抽真空-升温操作，并关注罐温度；
S3.5、当罐温升至55～58℃时，停止循环，再次抽真空至罐压10～13Pa，干燥3～5h；
S3.6、当含水量达到5～8％后，将冻干的血红蛋白多肽进行低温粉碎，用50～80目筛进行过筛，得到冻干血红蛋白多肽粉。
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|---|---|---|---|---|
| CN113304244A (zh) * | 2021-05-26 | 2021-08-27 | 杭州佰倍优生物科技有限公司 | 一种用于预防和缓解贫血的血蛋白多肽制备方法 |
| CN113797320A (zh) * | 2021-11-01 | 2021-12-17 | 杭州佰倍优生物科技有限公司 | 一种用于改善贫血症状的多肽组合物及其制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN105331667A (zh) * | 2015-12-15 | 2016-02-17 | 石河子大学 | 一种以牛血红蛋白为原料制备血红蛋白多肽的方法 |
| CN109136315A (zh) * | 2018-06-11 | 2019-01-04 | 华南农业大学 | 一种亚铁血红素寡肽微胶囊粉及其制备方法 |
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2020
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