CN105154510A

CN105154510A - 一种活性纳米硒脑肽的制备工艺

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Publication number: CN105154510A
Application number: CN201510628006.8A
Authority: CN
Inventors: 陈石良; 时亚文
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2015-09-29
Filing date: 2015-09-29
Publication date: 2015-12-16

Abstract

本发明涉及一种活性纳米硒脑肽的制备工艺，步骤如下：（1）将猪脑组织匀浆，脂肪酶酶解脱脂，复合酶水解，超滤，得到脑肽液；脂肪酶添加量为所述脑浆液重量的0.05-0.15%，复合酶添加量为所述脱脂脑蛋白液重量的0.2-2.0%；（2）向脑肽液中加入亚硒酸钠溶液和抗坏血酸溶液，在40-55℃下搅拌反应1-2小时，得到反应液；（3）将反应液进行喷雾干燥，得到成品。本发明以酶解方式对脑蛋白水解物进行脱脂，不仅脱脂效果好，避免了环境污染，而且保证了小分子肽的生物活性和产品安全性；同时，以酶解后的小分子脑肽作为介质模板，吸附和稳定纳米硒，将活性脑肽与纳米硒结合起来，使脑肽与纳米硒的生理功能相互促进，协同增效，所得产品具有更好的治疗失眠、头痛以及记忆力减退等多种疾病的功效。

Description

一种活性纳米硒脑肽的制备工艺

技术领域

本发明涉及一种脑蛋白粉制备方法，尤其涉及一种从猪脑组织中提取的活性纳米硒脑肽的制备工艺。

背景技术

哺乳动物脑组织是与人脑组织较亲和的组织，其所含有的各种蛋白质、肽类、神经生长因子、磷脂、粘多糖等可为人脑组织利用。利用酶工程技术，从动物脑组织中可获取含有大量小分子肽、氨基酸、辅酶体等物质，业内把它称之为脑蛋白水解物或脑肽。据研究报道，目前在哺乳动物脑组织中已发现30多种活性肽，脑肽的功能主要表现为调节功能和营养功能两方面，调节功能包括改善睡眠和提高记忆力，主要表现为缩短入睡期，延长睡眠时间，提高记忆，增加智力。营养功能包括它所含有8种人体必需氨基酸，且能透过血脑屏脑，直达脑组织，为大脑提供营养，被誉为脑动力素。近年来，奥地利及日本等国以动物脑组织为原料相继开发出了治疗脑功能性疾病的营养补充剂或药品，如奥地利依比威(Ebewe)药厂生产的脑活素注射液已有多年的历史，临床应用最为广泛。脑活素临床上可用于神经系统疾病特别是阿尔茨海默氏病(AD)的治疗，能明显延缓老年痴呆病变的进展，改善痴呆症状。研究表明，脑活素含有75%的游离氨基酸和25%的小分子肽，脑活素的药理作用与其含有的小分子肽类的生物活性密切相关。

大量科学研究表明，自由基是人类衰老和患病的根源。机体自身及外界环境因素往往使人体产生过多的自由基，自由基攻击生命大分子，造成组织细胞损伤。脑是最易受自由基攻击的部位，因为脑在氧化代谢过程中产生的毒性自由基比其他任何组织器官要多。硒作为重要的抗氧化剂和自由基清除剂，在体内通过谷胱甘肽过氧化物酶特异性地催化还原型谷胱甘肽与过氧化物（毒性自由基）的氧化还原反应，把有毒的氧自由基变成无毒物质，从而起到保护脑细胞免受损害，维护大脑的健康。研究表明，凡患有老年性痴呆症、脑中风、失眠、记忆力减退的人，其血硒的含量比正常人的血硒水平要低，这表明其抗氧化和对自由基损害的防御能力下降，脑组织容易受到自由基毒性的损害。因此，硒是一种重要的抗脑衰老元素，适当从体外补充硒，可使体内的硒含量维持在正常水平，不仅能改善睡眠，提高记忆力，增强智力，而且可以改善整个身体的机能状态，延缓机体衰老的进程。关于硒的日摄入量，我国科技工作者杨光圻教授和陈孝曙教授经过多年的研究分析，得出结论：人体对硒的生理需要量为40μg/日，界限中毒剂量为800μg/日，建议膳食硒补充量为50-250μg/日，最高安全摄入量为400μg/日，此数据为国际组织FDA/WHO/IAEA所采用。1998年中国营养学会已将人体必需的微量元素硒列为15种每日膳食营养素之一，并推荐成年人每日膳食硒补充量为50微克。与无机硒及有机硒相比，纳米硒具有毒性小，易于吸收，高效高活性等优势。因此，纳米硒的应用前景和市场潜力十分巨大。

国内已有不少利用动物脑组织提取制备脑蛋白水解物或脑肽的报道，如中国专利号ZL200710118548公开了一种脑肽及其制备方法及其用途；中国专利号ZL201210253341公开了一种提取鱼脑油、鱼脑肽的方法。国内也有大量的以多（聚）糖或蛋白质或多肽为介质制备单质纳米硒的专利技术报道，如中国专利号ZL97107038公开了一种活性红色单质硒的制备方法，专利号ZL02138643公开了甲壳素纳米硒及其制备方法，专利号ZL200410093254公开了一种纳米硒溶胶的制备方法，专利号ZL200510086601公开了活性蛋白复合型纳米硒的制备及液相保存技术，专利号ZL200510086602公开了液相多、聚糖纳米硒及其制备方法与保存。现有的技术方案只是制备单一功能的动物脑蛋白水解物或某种形态的单质纳米硒，而将纳米硒与脑蛋白或脑肽有机融合，制备功能更强的活性纳米硒脑蛋白或脑肽至今尚无专利报道。

此外，在现有的动物脑蛋白或脑肽提取工艺中，一般采用有机溶剂（如丙酮、乙醚、乙醇等）抽提法对脑蛋白水解物进行脱脂，这种方法脱脂效果较好，产品收得率高，但是需要消耗大量的有机溶剂，易造成环境污染，成本高，对生产操作带来不便和危险性，而且蛋白质、肽类等活性物质长时间在有机溶媒的作用下可能导致不可逆的变性失活。因此，开发一种更加有效的脑蛋白脱脂新工艺具有重要意义。

发明内容

本发明的目的正是基于上述状况而提出的一种活性纳米硒脑肽制备工艺，该工艺以猪脑组织为主要原料，工艺简单，成本低，安全可靠，易于实施，所制备的活性纳米硒脑肽可作为有关保健食品和医药工业的原料，具有较高的实用价值。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现的：一种活性纳米硒脑肽制备工艺，其工艺步骤如下：

（1）取新鲜(或经冷冻保存后解冻)猪脑去粘膜、去血管、洗净后，加入2-4倍重量的去离子水匀浆，得到脑浆液；

（2）向所述脑浆液中加入脂肪酶酶解，灭酶，离心，收集沉淀，向沉淀中加入1-3倍重量的去离子水搅拌均匀后，得到脱脂脑蛋白液；

（3）向所述脱脂脑蛋白液中加入复合酶酶解，灭酶，调节pH值为7.0，离心，收集上清液；

（4）将上清液通过截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤，收集透过液，得到脑肽液；

（5）向所述脑肽液中依次加入亚硒酸钠溶液和抗坏血酸溶液，在40-55℃下搅拌反应1-2小时，得到反应液；

（6）将所述反应液进行喷雾干燥，得到成品。

步骤（2）所述脂肪酶为碱性脂肪酶，酶活力为10000-30000U/g，酶解条件为30-45℃，pH8.5～9.5，酶解30-60分钟，脂肪酶添加量为所述脑浆液重量的0.05-0.15%，酶解后在90-100℃灭酶20分钟。

步骤（3）所述复合酶为经活化的胰蛋白酶和风味蛋白酶的混合物，胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量混合比为1-3：0.5-1，酶解条件为45-55℃，pH7.8～8.5，酶解8-16小时，所加复合酶添加量为所述脱脂脑蛋白液重量的0.2-2.0%，酶解后在90-100℃灭酶20分钟；胰蛋白酶的活化方法为：取需要量的胰蛋白酶加入所述胰蛋白酶质量5-10倍的0.02mol/LCaCl₂.2H₂O溶液，于4-5℃活化30-60分钟。

步骤（5）所述加入亚硒酸钠溶液和抗坏血酸溶液的顺序是先加亚硒酸钠溶液，搅拌5-10分钟以后再在搅拌下滴加抗坏血酸溶液。

步骤（5）所述加入亚硒酸钠溶液和抗坏血酸溶液的量可以根据实际需要调整，但须满足抗坏血酸与亚硒酸钠的摩尔比≥10，亚硒酸钠溶液的质量浓度为0.01-0.1%，抗坏血酸溶液的质量浓度为0.5-1.2%。

步骤（6）所述喷雾干燥时进风口温度为180-200℃，出风口温度为80-100℃。

通过实施上述技术方案，本发明具有如下的有益效果：制备工艺中以酶解方式对动物脑蛋白水解物进行脱脂，不仅脱脂效果好，避免了环境污染，而且保证了小分子肽的稳定性和生物活性；制备工艺中采用具有生物活性的脑肽作为介质模板，既能吸附和稳定纳米硒，强化纳米硒的生物活性，又达到将活性脑肽与纳米硒结合起来，使脑肽与纳米硒的生理功能相互促进，协同增效，使所得产品具有更好的增强记忆、改善睡眠以及治疗神经性头痛等多种脑功能性疾病的功效。

附图说明

图1为活性纳米硒脑肽的透射电镜图。

具体实施方式

实施例1

（1）取经过检验的健康的新鲜猪脑200kg，去粘膜、去血管、洗净，加入2倍猪脑重量的去离子水，用匀浆机匀浆，得到脑浆液；（2）将脑浆液升温至35℃，调节pH值为9.0，加入脑浆液总重量的0.1%的脂肪酶，搅拌5分钟，停止搅拌，保温酶解40分钟后，升温至95℃灭酶20分钟，冷却至室温后，4000rmp离心15分钟，收集沉淀，向沉淀中加入2倍沉淀重量的去离子水搅拌均匀后，得到脱脂脑蛋白液；（3）将脱脂脑蛋白液升温至50℃，加入脱脂脑蛋白液总重量的1.2%的复合酶，调节pH值为8.0，搅拌5分钟，停止搅拌，保温酶解8小时后，升温至95℃灭酶20分钟，冷却至室温后，调节pH值为7.0，4000rmp离心15分钟，收集上清液；复合酶为经活化的胰蛋白酶和风味蛋白酶的混合物，胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量混合比为3：1；（4）将上清液通过截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤，收集透过液，得到脑肽液；（5）将脑肽液升温至50℃，加入300mL亚硒酸钠溶液，搅拌5分钟以后，加入1500mL抗坏血酸溶液，不断搅拌保温反应1小时，得到反应液；亚硒酸钠溶液的质量浓度为0.05%，抗坏血酸溶液的质量浓度为0.6%（6）将反应液进行喷雾干燥，得到成品13.69kg。

实施例2

（1）取经过检验的健康的冷冻鲜猪脑200kg，解冻后去粘膜、去血管、洗净，加入2倍猪脑重量的去离子水，用匀浆机匀浆，得到脑浆液；（2）将脑浆液升温至40℃，调节pH值为9.5，加入脑浆液总重量的0.05%的脂肪酶，搅拌5分钟，停止搅拌，保温酶解50分钟后，升温至95℃灭酶20分钟，冷却至室温后，4000rmp离心15分钟，收集沉淀，向沉淀中加入2倍沉淀重量的去离子水搅拌均匀后，得到脱脂脑蛋白液；（3）将脱脂脑蛋白液升温至55℃，加入脱脂脑蛋白液总重量的1.0%的复合酶，调节pH值为8.5，搅拌5分钟，停止搅拌，保温酶解12小时后，升温至95℃灭酶20分钟，冷却至室温后，调节pH值为7.0，4000rmp离心15分钟，收集上清液；复合酶为经活化的胰蛋白酶和风味蛋白酶的混合物，胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量混合比为3：1；（4）将上清液通过截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤，收集透过液，得到脑肽液；（5）将脑肽液升温至50℃，加入300mL亚硒酸钠溶液，搅拌5分钟以后，加入1500mL抗坏血酸溶液溶液，不断搅拌保温反应1小时，得到反应液；亚硒酸钠溶液的质量浓度为0.08%，抗坏血酸溶液的质量浓度为1.0%；（6）将反应液进行喷雾干燥，得到成成品13.27kg。

对比例

（1）取经过检验的健康的新鲜猪脑200kg，去粘膜、去血管、洗净，加入2倍猪脑重量的去离子水，用匀浆机匀浆，得到脑浆液；（2）将脑浆液升温至35℃，调节pH值为9.0，加入脑浆液总重量的0.1%的脂肪酶，搅拌5分钟，停止搅拌，保温酶解40分钟后，升温至95℃灭酶20分钟，冷却至室温后，4000rmp离心15分钟，收集沉淀，向沉淀中加入2倍沉淀重量的去离子水搅拌均匀后，得到脱脂脑蛋白液；（3）将脱脂脑蛋白液升温至50℃，加入脱脂脑蛋白液总重量的1.2%的复合酶，调节pH值为8.0，搅拌5分钟，停止搅拌，保温酶解8小时后，升温至95℃灭酶20分钟，冷却后，调节pH值为7.0，4000rmp离心15分钟，收集上清液；复合酶为经活化的胰蛋白酶和风味蛋白酶的混合物，胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量混合比为3：1；（4）将上清液通过截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤，收集透过液，得到脑肽液；（5）将脑肽液进行喷雾干燥，得到成品14.35kg。

对上述实施例和对比例得到的成品进行活性肽含量、活性肽分子量大小、微粒结构以及功效检测。

活性肽含量及其分子量大小检测：取少量成品配制成检测液进行检测，采用高效凝胶过滤色谱（HPLC）法测定，以已知分子量蛋白质做参照。

结果如表1：

从表1中可以看出，实施例所得的成品中活性肽含量达到70%以上，其中肽分子量主要集中在1000Da以下。

纳米硒脑肽微粒结构检测：

实施例1所得的成品经透射电镜测定（如附图1所示），从附图1可见，成品中存在均匀分散的纳米态脑肽—Se(0)微粒，该脑肽—Se(0)颗粒的形状为球形，颗粒平均直径在50纳米左右，硒粒子吸附在小分子脑肽表面，脑肽对纳米硒起到良好的分散作用和稳定作用。

功效检测：

改善睡眠效果检测：以经常入睡困难、有睡眠障碍的失眠者为临床试验对象，对照组1、对照组2和试验组各50人，其中试验组服用实施例1所得到的成品，对照组1服用对比例所得到的成品，对照组2不服用任何蛋白粉，服用方法和剂量为：餐后1小时温水冲服，一天3次，每次3克，连续服用90天。

结果见表2：

从表2中可以看出，服用活性纳米硒脑肽产品的试验组，其睡眠质量显著提高，失眠症状得到极大的改善，服用单一的脑肽产品的对照组1，其失眠症状在很大程度上也得到了改善，但总体效果不如活性纳米硒脑肽产品。

缓解神经性头痛效果检测：以经常出现持续性头部胀痛、压迫感、沉重感等症状的神经性头痛者为临床试验对象，对照组1、对照组2和试验组各40人，其中试验组服用实施例1所得到的成品，对照组1服用对比例所得到的成品，对照组2不服用任何蛋白粉，服用方法和剂量为：餐后1小时温水冲服，一天3次，每次3克，连续服用90天。

结果见表3：

从表3中可以看出，服用活性纳米硒脑肽产品的试验组，对消除或减轻神经性头痛症状具有良好的效果，服用单一的脑肽产品的对照组1也可以取得较好的疗效，但与活性纳米硒脑肽产品比较有较大的差距。

增强记忆力效果检测：以平时忘性大、记忆力减退明显、甚至出现有严重的记忆力障碍的中老年人（年龄在40岁以上）为临床试验对象，对照组1、对照组2和试验组各30人，其中试验组服用实施例1所得到的成品，对照组1服用对比例所得到的成品，对照组2不服用任何蛋白粉，服用方法和剂量为：餐后1小时温水冲服，一天3次，每次3克，连续服用90天。

结果见表4：

从表4中可以看出，服用活性纳米硒脑肽产品的试验组，对减轻记忆力衰退有显著的疗效，服用单一的脑肽产品的对照组1也有较好的疗效，但总体效果没有活性纳米硒脑肽产品的好。

Claims

1.一种活性纳米硒脑肽的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取新鲜或经冷冻保存后解冻的猪脑去粘膜、去血管、洗净后，加入2-4倍重量的去离子水匀浆，得到脑浆液；

（3）向所述脱脂脑蛋白液中加入复合酶酶解，灭酶，调节pH值，离心，收集上清液；

（4）将所述上清液通过截留分子量为5000Da的超滤膜进行超滤，收集透过液，得到脑肽液；

（6）将所述反应液进行喷雾干燥，得到成品。

2.根据权利要求1所述的一种活性纳米硒脑肽的制备工艺，其特征在于：步骤（2）所述脂肪酶为碱性脂肪酶，酶活力为10000-30000U/g，酶解条件为30-45℃，pH8.5～9.5，酶解30-60分钟，脂肪酶添加量为所述脑浆液重量的0.05-0.15%，酶解后在90-100℃灭酶20分钟。

3.根据权利要求1所述的一种活性纳米硒脑肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）所述复合酶为经活化的胰蛋白酶和风味蛋白酶的混合物，胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量混合比为1-3：0.5-1，酶解条件为45-55℃，pH7.8～8.5，酶解8-16小时，所加复合酶添加量为所述脱脂脑蛋白液质量的0.2-2.0%，酶解后在90-100℃灭酶20分钟。

4.根据权利要求3所述的一种活性纳米硒脑肽的制备方法，其特征在于：所述胰蛋白酶的活化方法为：取需要量的胰蛋白酶加入所述胰蛋白酶质量5-10倍的0.02mol/LCaCl₂.2H₂O溶液，于4-5℃活化30-60分钟。

5.根据权利要求1所述的一种活性纳米硒脑肽的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述加入亚硒酸钠溶液和抗坏血酸溶液的顺序是先加亚硒酸钠溶液，搅拌5-10分钟以后再在搅拌下滴加抗坏血酸溶液。

6.根据权利要求1所述的一种活性纳米硒脑肽的制备方法，其特征在于：步骤（5）所述加入亚硒酸钠溶液和抗坏血酸溶液的量可以根据实际需要调整，但须满足亚硒酸钠和抗坏血酸的摩尔比为≥10，亚硒酸钠溶液的质量浓度为0.01-0.1%，抗坏血酸溶液的质量浓度为0.5-1.2%。

7.根据权利要求1所述的一种活性纳米硒脑肽的制备方法，其特征在于：步骤（6）所述喷雾干燥时进风口温度为180-200℃，出风口温度为80-100℃。