CN114208938B - 脑蛋白水解物及其制备方法和包含脑蛋白水解物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及食品加工领域，具体公开了一种脑蛋白水解物及其制备方法和包含脑蛋白水解物的组合物。一种脑蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：组织匀浆、钝化酶活性、酶解、高温灭菌、离心浓缩、脱脂以及后处理。其中，将匀浆液经过高温钝化处理，可以提高酶解效率，将酶解液经过离心浓缩处理后，可减少脱脂时的丙酮用量，最后经过干燥处理又可以去除剩余残留的丙酮，本申请的制备方法具有工艺简单、脱脂效率高以及水解物提取效率高的优点。本申请的脑蛋白水解物可直接食用，也可与其他原料配合食用，采用本申请的方法制得的脑蛋白水解物的质地细腻，腥味小、颜色较浅，含有较高的氨基酸、多肽、总神经节苷脂和总唾液酸以及较低的脂肪和胆固醇。

Description

脑蛋白水解物及其制备方法和包含脑蛋白水解物的组合物
技术领域
本申请涉及食品加工技术领域，更具体地说，它涉及脑蛋白水解物及其制备方法和包含脑蛋白水解物的组合物。
背景技术
脑蛋白水解物是指从动物脑组织中经水解提取得到的主要含有多肽类、蛋白质、氨基酸等的混合物，可作用于人体神经组织，能够改善神经细胞代谢、促进神经细胞的蛋白质合成、保护神经细胞免受缺血和神经毒素的伤害，具有改善失眠、头痛、记忆力下降、头晕及烦躁等症状的作用。
相关技术中，脑蛋白水解物的制备方法通常包括如下步骤：动物脑组织→前处理→匀浆→酶解→离心→超滤→柱层析精制→灭菌。由于动物脑中含有较高的脂肪和胆固醇(例如新鲜猪脑中脂肪含量为9.8g/100g，胆固醇含量为2571mg/100g)，而经常食用高脂类的食物不仅会造成血液中胆固醇升高，而且还可能诱发或加重动脉硬化，诱发高血压甚至肾脏疾病，严重的可能造成冠心病、心血管疾病等，因此，脑蛋白水解物在制备的过程中多会经过脱脂处理。
目前的脱脂工序一般会在酶解之前进行，其主要原因为在动物脑组织酶解前经过脱脂处理，可以去除包裹在蛋白质外的脂肪，有利于提高水解物中氨基酸以及低分子肽的收率。常见的脱脂方式为使用丙酮或丙酮复合溶剂进行脱脂，其优点为操作简单、脱脂效率高，但是也存在溶剂使用量大的问题。而其他脱脂方式如二氧化碳超临界萃取法和乳脂分离机脱脂法虽然安全性高，但均需使用特殊设备，不仅增加了设备投入的成本，而且还存在操作繁琐、活性肽收率下降的缺陷。因此，需要一种新的制备脑蛋白水解物的方法。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供一种脑蛋白水解物及其制备方法和包含脑蛋白水解物的组合物。
第一方面，本申请提供一种脑蛋白水解物的制备方法，采用如下的技术方案：
一种脑蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：
S1、组织匀浆：将动物脑组织清洗、除杂后，加水研磨匀浆，得到匀浆液；
S2、钝化酶活性：将所述匀浆液煮沸以钝化动物脑组织的酶活性并灭菌，冷却后得到预处理匀浆液；
S3、酶解：将所述预处理匀浆液酶解后，得到酶解液；
S4、高温灭菌：将所述酶解液煮沸，使酶失活并灭菌；
S5、离心浓缩：将S4的酶解液离心后，得到上清液；将上清液经减压浓缩后，得到膏状浓缩液；
S6、脱脂：向所述浓缩液中加入其重量的3-5倍的丙酮，然后低温搅拌，静置后，使其分层，弃去上层，得到脱脂水解物；
S7、后处理：将所述脱脂水解物经过干燥处理后，得到脑蛋白水解物。
丙酮是一种常见的有机溶剂，其沸点为56.53℃，易挥发，丙酮为GB2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定的各类食品加工过程中使用、残留量不需限定的加工助剂。通过采用上述技术方案，利用脂肪和胆固醇可溶于丙酮而脑蛋白肽不溶于丙酮的特点，将丙酮与浓缩液混合，通过简单的静置分层，即可将脑蛋白肽中的脂肪和胆固醇分离出去。之后，再利用干燥处理，可以使得小部分残留在脱脂水解物中的丙酮全部挥发除去，从而提高了产品的安全性。采用丙酮脱脂法进行脱脂，使用的丙酮在经过回收后经过简单处理即可重复利用，不仅可以提高资源的利用率，而且还可以减少有机溶剂的排放。
相较于在酶解前脱脂，本申请是将酶解液经过浓缩后再进行脱脂处理，经过浓缩处理，可以去除体系中的大部分水分，相较于传统的脱脂工序，往往需要加入脑组织10倍甚至20倍的丙酮，本申请只需要加入浓缩物的3-5倍的丙酮，从而降低丙酮的用量；此外，本申请的脱脂方式可以在不明显降低酶解产物多肽收率的前提下，可以降低成品中的脂肪和胆固醇含量；并且，相较于热风干燥，采用减压干燥的方式可以降低脑蛋白水解物的腥味，也能避免长时间高温处理对脑蛋白肽的破坏。
由于本申请是在动物脑组织酶解后进行脱脂处理，为了提高脑蛋白水解物的提取率，本申请在酶解前先将匀浆液经过煮沸处理，不仅可以钝化动物脑组织中原有酶的活性，而且还能使得动物脑匀浆液的质地更加细腻，从而提高多肽的提取率；此外，匀浆液经过煮沸处理后，还可以杀灭体系中的大部分微生物和芽孢，在成品中不需要再额外添加抑菌剂、防腐剂等物质，从而减少了食品添加剂的使用。
此外，采用丙酮处理酶解液时，由于动物脑中的神经节苷脂不溶于丙酮，可以与脑蛋白水解物均保留在沉淀物中，从而提高了脑蛋白水解物中神经节苷脂的含量。神经节苷脂(GLS)是存在于细胞膜表面的一类含有唾液酸的酸性鞘糖脂，在神经组织的含量最为丰富，主要包括GM1、GD1b、GD1a和GT1b等，其对神经组织有较大的亲和性，能透过血脑屏障参与神经修复，提高神经细胞的存活率，改善神经传导速度。并且，神经节苷脂不仅在神经发生、生长、分化过程中起到重要作用，对于受损神经的修复也十分重要。
采用本申请的方法制得的脑蛋白水解物的质地细腻，腥味小、颜色较浅；含有较高的氨基酸和多肽，其中90％为相对分子质量小于10000的肽段；并且，还含有较高的总神经节苷脂和总唾液酸以及较低的脂肪和胆固醇。本申请的脑蛋白水解物能够改善神经细胞代谢、促进神经细胞的蛋白质合成、保护神经细胞免受缺血和神经毒素的伤害，具有改善失眠、头痛、记忆力下降、头晕及烦躁等症状的作用。
优选的，所述S2中，将匀浆液煮沸后保持20-40min。
通过采用上述技术方案，将匀浆液煮沸后保持20-40min，可以充分杀灭体系中的大部分微生物和芽孢，有利于延长脑蛋白水解物的保存期。
优选的，所述蛋白酶由木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组成。
通过采用上述技术方案，木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶，有较广泛的特异性；利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶对动物脑组织匀浆液进行酶解，可以得到含有小分子多肽、氨基酸的水解物。由于在酶解前匀浆液经过煮沸处理，可以有效提高多肽的提取率。
优选的，所述木瓜蛋白酶与动物脑组织的重量比为0.2-0.5:100；
所述胰蛋白酶与动物脑组织的重量比为0.3-0.5:100。
优选的，所述S3中的酶解包括如下步骤：向预处理匀浆液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，调节体系pH为6.5-7.5，在55-60℃的温度下恒温搅拌水解6-12h，得到酶解液。
通过采用上述技术方案，利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶作为复合蛋白酶对动物脑组织进行水解处理，不需要反复调整体系的pH以及温度，大大简化了水解工艺，并且其水解效率高，易于工业化生产。
优选的，所述S5中的离心包括如下步骤：将酶解液经过离心处理后，收集上清液；然后向离心后的沉淀中加水搅拌均匀，再次离心，合并两次所得上清液。
通过采用上述技术方案，将酶解液经过两次离心处理，可以提高脑蛋白水解物的收率。
优选的，所述S5中离心转速为3000-5000r/min，温度为1-4℃，离心时间为10-30min。
优选的，所述S7中脱脂水解物在经过干燥处理前，还经过如下处理：
向脱脂水解物中加入水和β-环糊精，在40-60℃的温度下恒温搅拌1-3h；然后经过离心，收集沉淀物，将沉淀物干燥后，得到脑蛋白水解物。
通过采用上述技术方案，将脱脂水解物与水和β-环糊精混合，经过β-环糊精的包埋后，可以提高脑水解蛋白物的水溶性，降低成品的腥味以及不良口感。此外，脑蛋白水解物被β-环糊精包埋，包埋后离心，脑蛋白水解物在沉淀物中，残余的部分脂肪在上清液中被除去，从而可以进一步降低脑蛋白肽粉中的脂肪含量，配合前面的脱脂工序，对脑蛋白水解物起到很好的脱脂作用。
第二方面，本申请提供一种由脑蛋白水解物的制备方法制得的脑蛋白水解物。
第三方面，本申请提供一种包含脑蛋白水解物在制备营养组合物中的应用。
采用本申请的方法制备的脑蛋白水解物可直接食用或者与其他组分配合，制得固体饮料后，加水冲泡服用。
优选的，一种包含脑蛋白水解物的组合物，包括如下重量份的组分：脑蛋白水解物20-40份、赤藓糖醇20-40份、大豆肽粉20-40份、异麦芽酮糖醇5-15份、青金桔果粉5-15份、麦芽糖醇5-15份、粉末亚麻籽油1-10份、菊粉1-10份、燕麦1-10份、藜麦1-10份、牛磺酸1-10份、益生菌0.1-1份、维生素矿物质预混料0.1-1份、瓜尔豆胶0.2-0.3份、黄原胶0.2-0.3份、果胶0.1-0.2份以及安赛蜜0.01-0.03份。
本申请的益生菌为包含嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、发酵乳杆菌的复合益生菌。复合益生菌可合成消化酶，参与到肠道中营养物质的消化，从而促进肠道营养物质的吸收。益生菌的自身结构如肽聚糖、脂磷壁酸等成分可作为抗原直接发挥免疫激活作用，或者通过自分泌免疫激活剂，刺激宿主免疫系统，从而提高动物的免疫力，增强机体固有免疫细胞和自然杀伤细胞的活性。益生菌还可以维持肠道菌群结构平衡，降低肠道粘膜的渗透性，从而保护肠道粘膜的屏障完整性。
本申请的维生素矿物质预混料包含维生素A、维生素D3、维生素E、维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酰胺、叶酸、泛酸钙、氧化锌、乙二胺四乙酸铁钠、氧化镁、碳酸钙、麦芽糊精。添加维生素矿物预混料后，可以补充人体每日所需的维生素和矿物质。
大豆肽粉是以大豆粕或大豆蛋白等为主要原料，用酶解或微生物发酵法生产的混合肽粉末，以3-6个氨基酸组成的寡肽为主。大豆肽具有低抗原性、促进脂质代谢及发酵等功能，能快速补充人体氮源，具有帮助人体恢复体力、解除疲劳、改善睡眠的作用。采用脑蛋白水解物、大豆肽粉的多肽组合物对人体神经组织细胞具有很好的修复性，具有很好的调节机体免疫力的作用。
亚麻籽油含有丰富的维生素E以及不饱和脂肪酸，具有抗氧化、抗衰老、预防心脑血管疾病以及增强人体免疫力等生理功能。粉末亚麻籽油为微囊化粉末油脂，其既具有普通油脂的优良特性，能够提供能量、改善食品风味和口感，又克服了传统油脂的应用弊端，便于加工使用、运输和保存。
青金桔含有丰富的维生素C、金桔苷等成分，具有维护心脏功能、降低血脂、防止高血压及动脉硬化的作用。
菊粉、燕麦以及藜麦均属于高膳食纤维的物质，其具有很好的降低血脂、调节血糖、改善便秘的作用。
牛磺酸是动物体内一种结构简单的含硫氨基酸，其具有消炎、镇痛、维持机体渗透压平衡、维持正常视觉功能、调节细胞钙平衡、降血糖、调节神经传导、参与内分泌活动、调节脂类消化与吸收、增加心脏收缩能力、提高机体免疫能力、增强细胞膜抗氧化能力、保护心肌细胞等广泛的生物学功能。
赤藓糖醇、异麦芽酮糖醇以及麦芽糖醇均属于低热量的甜味剂，其与低含量的安赛蜜配合，作为组合物中的甜味矫味剂，不会引起升糖指数显著升高，在不明显增加食品热量的情况上，可以明显改善组合物的口感。
由上述原料复配得到的组合物不仅具有较好的口感，而且具有很好的降低血压、血脂的作用，可以促进机体新陈代谢，调节免疫功能，增强机体对疾病的抵抗能力。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请的方法是将酶解液经过浓缩后再进行脱脂处理，经过浓缩处理，可以去除体系中的大部分水分，传统的脱脂工序，往往需要加入脑组织重量的10倍甚至20倍的丙酮，本申请只需要加入浓缩物重量的3-5倍的丙酮，可以大大降低丙酮的用量；并且，本申请的脱脂方式可以在不明显降低酶解产物多肽收率的前提下，降低成品中的脂肪和胆固醇的含量；此外，相较于热风干燥，采用减压干燥的方式可以降低脑蛋白水解物的腥味，也能避免长时间高温处理对脑蛋白肽的破坏。并且，采用本申请无需采用特殊设备也能达到很好的脱脂效果，从而有利于简化生产工艺、降低生产成本。
2、本申请在酶解前先将匀浆液经过煮沸处理，不仅可以钝化动物脑组织中原有酶的活性，而且还能使得动物脑匀浆液的质地更加细腻，从而提高多肽的提取率；此外，匀浆液经过煮沸处理后，还可以杀灭体系中的大部分微生物和芽孢，在成品中不需要再额外添加抑菌剂、防腐剂等物质，从而减少了食品添加剂的使用。
3、采用本申请的方法制得的脑蛋白水解物的质地细腻，腥味小、颜色较浅。脑蛋白水解物含有较高的氨基酸和多肽，其中90％为相对分子质量小于10000的肽段；并且，还含有较高的总神经节苷脂和总唾液酸以及较低的脂肪和胆固醇。本申请的脑蛋白水解物能够改善神经细胞代谢、促进神经细胞的蛋白质合成、保护神经细胞免受缺血和神经毒素的伤害，具有改善失眠、头痛、记忆力下降、头晕及烦躁等症状的作用。
4、将脱脂水解物与水和β-环糊精混合后，经过β-环糊精的包埋后，可以提高脑水解蛋白物的水溶性，降低成品的腥味以及不良口感。此外，脑蛋白水解物被β-环糊精包埋，包埋后离心，脑蛋白水解物在沉淀物中，残余的部分脂肪在上清液被除去，从而可以进一步降低脑蛋白肽粉中脂肪含量，配合前面的脱脂工序，对脑蛋白水解物起到很好的脱脂作用。
5、本申请将脑蛋白水解物、大豆肽粉等原料复配得到的组合物不仅具有较好的口感，而且具有很好的降低血压、血脂的作用，可以促进机体新陈代谢，调节免疫功能，增强机体对疾病的抵抗能力。
具体实施方式
本申请提供了一种脑蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：
S1、组织匀浆：将动物脑清洗后，去除脑膜和血管，用去离子水冲洗其表面，加入动物脑重量的2-3倍的去离子水，然后用胶体磨匀浆两次后，制得匀浆液；
S2、钝化酶活性：将匀浆液煮沸后，保持20-40min，以钝化动物脑组织的酶活性并灭菌，冷却后得到预处理匀浆液；
S3、酶解：将预处理匀浆液中加入蛋白酶，调节体系pH为6.5-7.5，温度为55-60℃，在此条件下恒温搅拌水解6-12h，得到酶解液；其中，蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，木瓜蛋白酶与动物脑组织的重量比为0.2-0.5:100，胰蛋白酶与动物脑组织的重量比为0.3-0.5:100；
S4、高温灭菌：将酶解液煮沸后，保持20-40min，使酶失活并灭菌；然后降温至常温；
S5、离心：将S4的酶解液在转速为3000-5000r/min、温度为1-4℃的条件下，离心10-30min，收集上清液；向离心后的沉淀中加入其3-5倍的去离子水，再次在转速为3000-5000r/min、温度为1-4℃的条件下，离心10-30min，合并两次所得上清液；
S6、浓缩：将离心后的上清液通过减压浓缩，得到固含量为50-60％的粘稠膏状浓缩液；
S7、脱脂：向浓缩液中加入浓缩液的重量的3-5倍的丙酮，在-8～-7℃的温度下搅拌12-24h；然后静置1-2h，使体系自然分层，弃去上层，收集下层沉淀，得到脱脂水解物；
S8、后处理：向脱脂水解物中加入去离子水和β-环糊精，β-环糊精、去离子水和脱脂水解物的重量比为(1-3):(100-200):100；在40-60℃的温度下恒温搅拌1-3h；然后在转速为3000-5000r/min、温度为1-4℃的条件下，离心10-30min，收集沉淀物；将沉淀物经过减压干燥，得到干粉沉淀；
S9、粉碎：将干粉沉淀粉碎过60目筛后，得到脑蛋白水解物。
本申请将匀浆液经过高温钝化处理，可以钝化猪脑中原有酶的活性，且能使猪脑匀浆液质地细腻，提高酶解效率；将酶解液经过离心处理后，经过减压干燥可以去除体系中的大部分水分，可减少脱脂时的丙酮用量；然后经过干燥处理又可以去除剩余残留的丙酮；最后经过β-环糊精的包埋处理，可以提高脑水解蛋白物的水溶性，降低成品的腥味以及不良口感。此外，β-环糊精包埋还可进一步降低脑蛋白肽粉中脂肪含量，配合前面的脱脂工序，对脑蛋白水解物起到很好的脱脂作用。
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例中的原料均源自市售，其中，动物脑组织可以选择猪脑、羊脑、牛脑等，以下实施例均选择新鲜猪脑。蛋白酶选择木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，木瓜蛋白酶的酶活力为10万，胰蛋白酶的酶活力为4000u/g。
实施例1：一种脑蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：
S1、组织匀浆：将新鲜猪脑清洗后，去除脑膜和血管，用去离子水冲洗其表面，加入猪脑重量的2倍的去离子水，然后用胶体磨匀浆两次后，制得匀浆液；
S2、钝化酶活性：将匀浆液煮沸后，保持30min，以钝化猪脑的酶活性并灭菌，冷却后得到预处理匀浆液；
S3、酶解：将预处理匀浆液中加入蛋白酶，调节体系pH为7.0，温度为58℃，在此条件下恒温搅拌水解9h，得到酶解液；其中，蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，木瓜蛋白酶与猪脑的重量比为0.3:100，胰蛋白酶与猪脑的重量比为0.4:100；
S4、高温灭菌：将酶解液煮沸后，保持30min，使酶失活并灭菌；然后降温至常温；
S5、离心：将S4的酶解液在转速为4000r/min、温度为4℃的条件下，离心20min，收集上清液；向离心后的沉淀中加入其3倍的去离子水，再次在转速为4000r/min、温度为4℃的条件下，离心20min，合并两次所得上清液；
S6、浓缩：将离心后的上清液通过减压浓缩，得到固含量为55％的粘稠膏状浓缩液；
S7、脱脂：向浓缩液中加入浓缩液的重量的4倍的丙酮，在-8℃的温度下搅拌18h；然后静置2h，使体系自然分层，弃去上层，收集下层沉淀，得到脱脂水解物；
S8、后处理：向脱脂水解物中加入去离子水和β-环糊精，β-环糊精、去离子水和脱脂水解物的重量比为1:100:100；在50℃的温度下恒温搅拌2h；然后在转速为4000r/min、温度为4℃的条件下，离心20min，收集沉淀物；将沉淀物在压力为50kPa，温度为60℃的条件下，减压干燥12h，得到干粉沉淀；
S9、粉碎：将干粉沉淀粉碎过60目筛后，得到脑蛋白水解物。
实施例2
本实施例与实施例1的不同之处在于，S3中的蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，木瓜蛋白酶与猪脑的重量比0.5:100，胰蛋白酶与猪脑的重量比为0.3:100。
实施例3
本实施例与实施例1的不同之处在于，S3中的蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，木瓜蛋白酶与猪脑的重量比0.2:100，胰蛋白酶与猪脑的重量比为0.5:100。
实施例4
本实施例与实施例1的不同之处在于，S3中的蛋白酶仅为木瓜蛋白酶，木瓜蛋白酶与猪脑的重量比为0.7:100。
实施例5
本实施例与实施例1的不同之处在于，S3中的蛋白酶仅为胰蛋白酶，胰蛋白酶与猪脑的重量比为0.7:100。
实施例6
本实施例与实施例1的不同之处在于，S3中的蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，木瓜蛋白酶与猪脑的重量比0.6:100，胰蛋白酶与猪脑的重量比为0.1:100。
实施例7
本实施例与实施例1的不同之处在于，S3中的蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，木瓜蛋白酶与猪脑的重量比0.1:100，胰蛋白酶与猪脑的重量比为0.6:100。
实施例8
本实施例与实施例1的不同之处在于S8，S8的后处理包括如下步骤：将脱脂水解物在压力为50kPa，温度为60℃的条件下，减压干燥12h，得到干粉沉淀。
对比例
对比例1：一种脑蛋白水解物的制备方法，包括如下步骤：
S1、组织匀浆：将新鲜猪脑清洗后，去除脑膜和血管，用去离子水冲洗其表面，加入猪脑重量的2倍的去离子水，然后用胶体磨匀浆两次后，制得匀浆液；
S2、脱脂：向匀浆液中加入匀浆液的重量的10倍的丙酮，在-8℃的温度下搅拌18h；然后静置2h，使体系自然分层，弃去上层，收集下层沉淀，得到脱脂水解物；
S3、酶解：向脱脂水解物中加入其重量的5倍的水混合均匀，然后加入蛋白酶，调节体系pH为7.0，温度为58℃，在此条件下恒温搅拌水解9h，得到酶解液；其中，蛋白酶为木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，木瓜蛋白酶与猪脑的重量比为0.3:100，胰蛋白酶与猪脑的重量比为0.4:100；S4、高温灭菌：将酶解液煮沸后，保持30min，使酶失活并灭菌；然后降温至常温；
S5、离心：将S4的酶解液在转速为4000r/min、温度为4℃的条件下，离心20min，收集上清液；向离心后的沉淀中加入其3倍的去离子水，再次在转速为4000r/min、温度为4℃的条件下，离心20min，合并两次所得上清液；
S6、浓缩：将离心后的上清液通过减压浓缩，得到固含量为55％的粘稠膏状浓缩液；
S7、后处理：向浓缩液中加入去离子水和β-环糊精，β-环糊精、去离子水和浓缩液的重量比为1:100:100；在50℃的温度下恒温搅拌2h；然后在转速为4000r/min、温度为4℃的条件下，离心20min，收集沉淀物；将沉淀物在压力为50kPa，温度为60℃的条件下，减压干燥12h，得到干粉沉淀；
S8、粉碎：将干粉沉淀粉碎过60目筛后，得到脑蛋白水解物。
应用例
应用例中的原料除特殊说明外均购自市售。其中，脑蛋白水解物由实施例或对比例制得；粉末亚麻籽油购自陕西元贝贝生物科技有限公司，货号为YIBEIZI-1906；益生菌由重量比为3:2:1:1的嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、发酵乳杆菌组成；嗜酸乳杆菌购自深圳市海盛生物科技有限公司，其活性乳酸菌含量为100亿cfu/g；干酪乳杆菌购自陕西华实生物科技有限公司，其活性乳酸菌含量为100亿cfu/g；双歧杆菌为动物双歧杆菌，购自西安超邦生物科技有限公司，活性乳酸菌含量为100亿cfu/克；发酵乳杆菌购自山东嘉宏益生物工程有限公司，活性乳酸菌含量为100亿cfu/克。维生素矿物质预混料由如下组分组成：0.0002％的维生素A、0.000001％的维生素D3、0.008％的维生素E、0.05％的维生素C、0.005％的维生素B1、0.005％的维生素B2、0.005％的维生素B6、0.000001％的维生素B12、0.01％的烟酰胺、0.0005％的叶酸、0.004％泛酸钙、0.012％的氧化锌、0.08％的乙二胺四乙酸铁钠、0.0003％的氧化镁、0.0025％的碳酸钙，余量为麦芽糊精。
应用例1：一种脑蛋白水解物的组合物，由如下原料混合而成：脑蛋白水解物30kg、赤藓糖醇30kg、大豆肽粉30kg、异麦芽酮糖醇10kg、青金桔果粉10kg、麦芽糖醇10kg、粉末亚麻籽油5kg、菊粉5kg、燕麦5kg、藜麦5kg、牛磺酸1kg、益生菌0.5kg、维生素矿物质预混料0.5kg、瓜尔豆胶0.25kg、黄原胶0.25kg、果胶0.15kg以及安赛蜜0.02kg；其中，脑蛋白水解物由实施例1制备而得。
应用例2：本应用例与应用例1的不同之处在于，脑蛋白水解物由实施例8制备而得。
应用例3：本应用例与应用例1的不同之处在于，脑蛋白水解物由对比例1制备而得。
应用例4：本应用例与应用例1的不同之处在于，将原料中的瓜尔豆胶和果胶均替换为等量的黄原胶。
应用例5：本应用例与应用例1的不同之处在于，将原料中的黄原胶和果胶替换为等量的瓜尔豆胶。
应用例6：本应用例与应用例1的不同之处在于，将原料中的黄原胶和瓜尔豆胶替换为等量的果胶。
应用例7：本应用例与应用例1的不同之处在于，瓜尔豆胶的用量为0.15kg，果胶的用量为0.25kg。
性能检测试验
1、理化性能检测：按照如下方法，对脑蛋白水解物的理化指标进行测试，将统计结果示于表1。
水分按照GB/T5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》的方法进行测试；含氮量按照GB/T5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》的方法进行测试；肽含量采用高效液相色谱仪反相色谱法进行测试；脂肪含量按照GB/T5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》的方法进行测试；胆固醇含量按照GB/T5009.128-2016《食品安全国家标准食品中胆固醇的测定》的方法进行测试；总神经节苷脂采用高效液相色谱仪进行检测，采用间苯二酚-盐酸法测定其含量；采用Svennerholm的间苯二酚法测定唾液酸的含量。
表1实施例以及对比例中脑蛋白水解物的理化指标
根据表1数据，结合实施例1和对比例1可以看出，采用本申请实施例1的方法制得脑蛋白水解物中的多肽含量与对比例1基本接近，其中90％以上为相对分子量小于10000的肽段，并且相较于对比例1还含有较低的脂肪和胆固醇；说明相较于传统的脱脂方式，采用本申请的脱脂方式在实际中并不会明显降低多肽的提取率，并且又能显著降低成品中的脂肪和胆固醇的含量。此外，本申请的脑蛋白水解物还含有较高的神经节苷脂和唾液酸，对受损神经细胞具有很好的修复效果。食用本申请的脑蛋白水解物能够很好的改善失眠、头痛、记忆力下降、头晕及烦躁等症状。
结合实施例1-7可以看出，蛋白酶的种类以及用量对脑蛋白水解物中的含氮量、肽含量、总神经节苷脂含量以及唾液酸含量具有较大的影响，当采用木瓜蛋白酶与胰蛋白酶复配时，特别是当木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的用量为0.2-0.5:0.3-0.5时，其水解收率高，可以得到较多的多肽、总神经节苷脂和唾液酸。
结合实施例1和实施例8可以看出，脱脂水解物经过β-环糊精的包埋处理后，其对脑蛋白水解物中的含氮量以及多肽含量无明显影响，但是可以明显其中的降低脂肪和胆固醇的含量；说明β-环糊精的包埋处理可以增加水解物中脂肪和胆固醇的去除率。
2、16种氨基酸含量的测定：用于药品注射使用的脑蛋白水解物的质量控制方法主要是测定药品中的小分子多肽和16种氨基酸的含量，以保证药物的疗效和安全性。虽然本申请的脑蛋白水解物主要用于食品食用，仍可通过测定其16种氨基酸的含量对其质量进行测试。按照GB5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》，结合高效液相色谱仪反相色谱法，测定脑蛋白水解物中氨基酸的组成以及含量，经过多次测试，统计结果如表2所示。
表2实施例1的脑蛋白水解物中氨基酸的组成以及含量
采用本申请的方法制得的脑蛋白水解物含有16种氨基酸，其中，组氨酸、酪氨酸、苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸为人体必需氨基酸，实施例1的脑蛋白水解物中的人体必需氨基酸占总氨基酸总量的比例为63.5％，并且实施例1的脑蛋白水解物中还含有较高的总神经节苷脂和唾液酸，长期摄入可以为大脑提供神经营养，恢复和改善认知能力。
3.小鼠学习记忆功能实验
实验动物为6周龄的昆明系雄性小鼠，体重为20±2g。随机选择50只小鼠，将其分为5组，每组10只，将小鼠分为脑蛋白水解物治疗组、阳性药组、假手术组、正常对照组以及模型组。
脑蛋白水解物治疗组、阳性药组以及模型组所用小鼠采用缺陷再灌注脑损伤小鼠模型，该小鼠模型采用如下方法制备：采用双侧颈总动脉夹闭-缺血-再灌术造成缺血再灌注脑损伤小鼠模型；将小鼠按照1g/kg的剂量腹腔注射10wt％的乌拉坦，使其麻醉，然后对小鼠颈部皮肤消毒后，行颈部正中切口，剥离下颌腺及双侧胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌以及胸骨乳突肌，暴露颈总动脉，钝性分离双侧颈总动脉及伴行神经，用动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉20min后，松开动脉夹恢复血流20min，重复上述缺血再灌注3次，然后恢复血供，缝合皮肤即可。
假手术组只分离双侧颈总动脉，不行缺血再灌术。正常对照组不进行手术。
给药方式：脑蛋白水解物治疗组予以实施例1的脑蛋白水解物150mg/kg/d；阳性药组予吡拉西坦540mg/kg/d；正常对照组、模型组、假手术组均予蒸馏水0.2ml/d。将小鼠分笼饲养，各组小鼠连续灌胃35天，给药期间自由摄食和饮水，保持正常昼夜循环。
跳台实验：末次给药30min后，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其他4组均按照3mg/kg的剂量腹腔注射射氢溴酸东莨菪碱注射液，注射完成30min后，将小鼠进行跳台实验，实验分为两天，实验第一天为学习阶段，第二天为测试阶段。学习阶段将小鼠放入反应箱内适应环境3min，然后通36V电压，小鼠受到电击后会跳上跳台逃避，从跳台跳下时以小鼠双足同时接触铜栅为触电，视为错误反应，训练5min。在24h后的测试阶段，重复跳台实验，测试时先将小鼠放置在跳台上，记录小鼠第一次跳下的时间，即为触电潜伏期，同时记录5min内的错误次数(即小鼠跳下跳台的次数)，作为小鼠学习记忆测试成绩。采用统计学方法，对各组动物的触电潜伏期和错误次数进行t检验，将结果示于表3。
表3脑蛋白水解物对小鼠学习能力测试表
组别 潜伏期，s 5min内错误次数，次
正常对照组 120.5±38.6 2.2±1.3
模型组 42.5±25.2 8.8±1.7
假手术组 110.2±86.2 2.3±2.5
脑蛋白水解物治疗组 100.2±32.5 3.8±1.2
阳性药组 95.4±20.4 2.9±1.0
根据表3数据，模型组和正常对照组比较，潜伏期时间明显缩短，5min内错误次数明显增加，P＜0.05，差异性显著，说明小鼠记忆障碍模型成功。
脑蛋白水解物治疗组与模型组相比，潜伏期延长(P＜0.05)，5min内错误次数明显减少(P＜0.05)，说明脑蛋白水解物可以明显改善记忆障碍小鼠的学习能力。脑蛋白水解物治疗组与阳性药组相比，潜伏期延长，5min内错误次数明显减少，说明相较于目前市售的药品，本申请的脑蛋白水解物具有更为优异的改善记忆障碍小鼠的学习能力的效果。
4、水溶性试验：目前脑蛋白水解物多用于注射使用，也可以直接用于口服；但是，传统工艺生产的脑蛋白水解物用于口服时，仍然存在腥味重、口感差以及水溶性差、易结块的问题。为了验证不同工艺、配方下的脑蛋白水解物及其组合物的水溶性，对其润湿性以及分散性进行实验，将实验结果示于表4。
润湿性：称取10g脑蛋白水解物或者脑蛋白水解组合物，置于盛有100mL、40℃去离子水的烧杯中，从粉体放入烧杯时计时，记录粉体全部润湿的时间，润湿时间越短则表示其润湿性越好。
分散性：称取10g脑蛋白水解物或者脑蛋白水解组合物，置于盛有100mL、40℃去离子水的烧杯中，用磁力搅拌器以500r/min的速度搅拌，记录粉体在水中完全溶解所需要的时间，溶解时间越短则表示其分散性越好。
表4脑蛋白水解物或脑蛋白水解组合物水溶性测试表
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根据表4数据，结合实施例1、实施例8以及对比例1可以看出，相较于传统工艺，采用本申请的方法制得的脑蛋白水解物具有较短的润湿时间以及分散时间，说明采用本申请的方法制得的脑蛋白水解物具有较好的水溶性。
结合实施例1、应用例1可以看出，应用例1的脑蛋白水解组合物的润湿时间以及分散时间明显短于实施例1，说明本申请复配得到的脑蛋白水解组合物的水溶性明显优于单一的脑蛋白水解物。
结合应用例1、应用例2、应用例3可以看出，采用本申请的方法制得的脑蛋白水解物用于复配脑蛋白水解组合物时，其水溶性明显优于传统方法制得的脑蛋白水解物复配的脑蛋白水解组合物。
结合应用例1、应用例4、应用例5、应用例6以及应用例7可以看出，食用胶的种类发生变化时，其对脑蛋白水解组合物的水溶性产生较大的影响；相较于采用黄原胶、瓜尔豆胶、果胶中的两种使用时，采用由瓜尔豆胶、果胶和黄原胶复配得到的复合食用胶能够极大的提高脑蛋白水解组合物的水溶性，使其在温水下也能具有很好的溶解性，从而可以降低高温对益生菌、活性成分等组分的破坏。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、组织匀浆：将动物脑组织清洗、除杂后，加水研磨匀浆，得到匀浆液；
S2、钝化酶活性：将所述匀浆液煮沸以钝化动物脑组织的酶活性并灭菌，冷却后得到预处理匀浆液；
S3、酶解：将所述预处理匀浆液酶解后，得到酶解液；使用蛋白酶进行酶解，所述蛋白酶由木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组成；木瓜蛋白酶与动物脑组织的重量比为0.2-0.5:100；所述胰蛋白酶与动物脑组织的重量比为0.3-0.5:100；
S4、高温灭菌：将所述酶解液煮沸，使酶失活并灭菌；
S5、离心浓缩：将S4的酶解液离心后，得到上清液；将上清液经减压浓缩后，得到膏状浓缩液；
S6、脱脂：向所述浓缩液中加入其重量的3-5倍的丙酮，然后低温搅拌，静置后，使其分层，弃去上层，得到脱脂水解物；
S7、后处理：将所述脱脂水解物经过干燥处理后，得到脑蛋白水解物。
2.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述S2中，将匀浆液煮沸后保持20-40min。
3.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述S3中的酶解包括如下步骤：向预处理匀浆液中加入木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，调节体系pH为6.5-7.5，在55-60℃的温度下恒温搅拌水解6-12h，得到酶解液。
4.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述S5中的离心包括如下步骤：将酶解液经过离心处理后，收集上清液；然后向离心后的沉淀中加水搅拌均匀，再次离心，合并两次所得上清液。
5.根据权利要求4所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述S5中离心转速为3000-5000r/min，温度为1-4℃，离心时间为10-30min。
6.根据权利要求1所述的脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于，所述S7中脱脂水解物在经过干燥处理前，还经过如下处理：
向脱脂水解物中加入水和β-环糊精，在40-60℃的温度下恒温搅拌1-3h；然后经过离心后，收集沉淀物，将沉淀物干燥后，得到脑蛋白水解物。
7.一种由权利要求1-6任意一项所述的脑蛋白水解物的制备方法制备的脑蛋白水解物。
8.一种权利要求1-6任意一项所述方法制备的脑蛋白水解物在制备营养组合物中的应用。
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