CN104511007A - 一种脑蛋白水解物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，本发明提供了一种脑蛋白水解物的制备方法，包括原料处理、前处理、复合酶水解、调节pH值、超滤及纳滤的步骤。本发明所述制备方法简单，易于工业化生产；该方法采用一定比例的复合酶进行水解，得到脑蛋白水解物具有肽含量高，活力高等优点。

Description

一种脑蛋白水解物的制备方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种脑蛋白水解物的制备方法。

背景技术

脑蛋白水解物类药物是近年应用最多生化药物之一。在国内外相关研究领域及市场上占有重要地位。脑蛋白水解物作为健康、新鲜动物大脑组织经酶解提取的一种活性脑多肽类物质，含有多种人脑必须氨基酸及脑磷脂、卵磷脂、肽类神经生长因子等重要元素，能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。它可以通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶催化其他激素系统，提供神经递质、肽类激素及辅酶前体。目前，临床上主要采用脑蛋白水解物制成注射剂，用于治疗痴呆和脑功能障碍、脑发育不全、脑萎缩、神经衰弱、脑外伤综合症、中枢神经系统感染、脑膜炎、老年性痴呆、抑郁症、精神病或脑血管代谢失调等多种疾病，同时能有效增强学习记忆能力

CN200410022091.5公开了一种脑蛋白水解物的制备方法，该发明通过先后使用胃蛋白酶、胰蛋白酶进行酶解的方法制备脑蛋白水解物，该方法工序复杂，且要调节酸碱性，可能出现蛋白质变性等问题。

发明内容

基于上述原因，申请人在研究过程中，得到一种新的方法：该方法采用复合酶水解、调节pH值、超滤和纳滤相结合的步骤，特别是使用一定比例的复合酶，得到脑蛋白水解物，该脑袋白水解物，具有肽和总氮含量高，活力数值高，药理活性更强的优点。

本发明的目的在于提供一种脑蛋白水解物的制备方法。

具体而言，本发明提供了：

一种脑蛋白水解物的制备方法，该方法包括以下步骤：

a)原料处理：将新鲜或冷冻保存的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到2～5倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆，加入复合酶，温度40-50℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的0.5％-3％，水解3-8小时，水解结束后于沸水中保持8-15min灭酶，冷却后调节pH为6-7，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用100～1000Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由嗜热菌蛋白酶、中性蛋白酶组成。

所述嗜热菌蛋白酶的酶活力为40万U／克。

所述中性蛋白酶的酶活力为10万U／克。

复合酶中嗜热菌蛋白酶、中性蛋白酶重量比为(0.5～3)：(1～5)。

作为优选，所述复合酶中嗜热菌蛋白酶、中性蛋白酶重量比为1：2。

上述所述的制备方法得到的脑蛋白水解物为原料制备成口服制剂或注射制剂。

本发明所述的嗜热菌蛋白酶、中性蛋白酶均购自上海宝丰生化有限公司。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

1、由该制备方法简单，易于工业化生产。

2、由该方法制备脑蛋白粉末肽含量高，活力高，药理活性强。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明下述试验是在多次创造性试验基础上，进行的结论性验证试验。

实验例1动物药效学试验

试验药物：市售复方脑蛋白水解物片(购自大连贝尔药业有限公司)、本发明实施例5制得的样品，以蒸馏水配成所需浓度的溶液，供口服给药使用。

1)对小鼠低压缺氧状态的影响

取18-21g小鼠150只，雌雄各半，随机分为3组，按表1所示的药物剂量灌胃给药，30分钟后，将三组运行同时投入真空仓内，密闭，减压抽真空，当对照组小鼠死亡达半数以上时，通气后继续观察30分钟，记录各组动物的死亡数。

结果见表1。

表1小鼠耐缺氧试验研究

由表1结果可见，本发明制得的样品对小鼠的低压缺氧状态有明显改善作用。

2)对脑组织缺氧的影响

取未成年小鼠150只，随机分为3组，按表2所示的药物剂量灌胃给药，40分钟后，尾静脉注射生理盐水配制的KCN药液(1.8mg／kg)，注射完毕后计时，测定动物注射完毕后至呼吸停止的生存时间。

结果见表2。

表2对脑组织缺氧的影响

注：与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与市售组比较#P＜0.05

结果表明：以绝对致死量的KCN静脉注射，市售组与本发明实施例组都非常显著的延长了动物的存活时间，表明本发明具有改善动物中枢神经系统缺氧状态的作用；本发明组与市售组相比已具有显著的延长动物存活时间，表明本发明对改善动物中枢神经系统缺氧状态的作用优于市售品。

实验例2脑蛋白水解物中肽和总氮含量测定试验

1、试验药物

取按实施例3、实施例5、实施例8及CN200410022091.5方法制备的样品。

2、测定脑蛋白水解物中的脑蛋白水解物含量(以氨基氮计)的方法

取样品适量(约相当于肽50mg)，精密称定，置消化管中，加盐酸适量(使供试品完全浸没并不超过容器的2／3体积)，充氮封口，置110℃水解20小时，放冷，启封，将水解液全量转移至蒸发皿中，水浴蒸发至干，加水使残留物溶解并稀释至适宜浓度，作为总氨基酸测定用供试品溶液；另取本品适量，加水稀释至适宜浓度，作为游离氨基酸测定用供试品溶液，用氨基酸分析仪进行测定。另取相应的氨基酸对照品(见下表)，

精密称定并稀释制成合适浓度，作为对照品溶液，同法测定。按外标法为内标以峰面积计算各氨基酸含量(色氨酸除外)。以水解后总氨基酸含量减去游离氨基酸含量即为肽含量。

总氮取本品约10mg，精密称定，依法测定(中国药典2010年版二部附录VII D第二法)。

结果见表3。

表3肽含量测定试验考察结果

试验结论：稳定性试验结果显示，本发明制备的脑蛋白水解物中肽含量显著高于对比例的脑蛋白水解物。

3、活力测定实验

样品按实施例3、实施例5、实施例8及CN200410022091.5方法制备的样品。

测定法取本品适量，加水溶解并稀释制成每1ml约含总氮6mg的溶液，除菌过滤，取滤液适量加10％小牛血清培养液制成每1ml中含氮量为60μg的溶液，照活力测定法测定，结果见表4。

活力测定法用10％小牛血清培养液培养3～8代的PC12细胞至对数增长期，用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四醋酸二钠消化液消化，加10％小牛血清培养液稀释至每1ml中含(0.8～1.2)×105个细胞，将上述细胞混悬液在96孔细胞培养板上铺板，每孔100μl，以10％小牛血清培养液100μl作为空白对照组，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养24小时。供试品组，每孔加供试品溶液100μl，正常细胞组、损伤细胞组、空白对照组每孔分别加10％小牛血清培养液100μl，每组设3个复孔。置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养24小时。供试品组、损伤细胞组分别加入0.5mmol／L过氧化氢溶液50μl，剩余孔加入10％小牛血清培养液50μl，置37℃，5％二氧化碳饱和水汽培养箱中培养48小时。结束培养前4小时取出培养板，吸去培养液，每孔加入0.01mol／L磷酸盐缓冲液(pH7.3)洗一次，然后再在每孔中加入上述磷酸盐缓冲液(pH7.3)100μl和MTT溶液20μl，继续培养。培养结束后，吸出培养液，每孔加入二甲基亚砜100μl，摇匀，放置5分钟后，在酶标仪上以550nm的波长处分别测定其吸光度A值。

修复率％=(Ag-As)／(Az-As)×100％

式中Ag为供试品组平均吸光度-空白对照组平均吸光度；

As为损伤细胞组平均吸光度-空白对照组平均吸光度；

Az为正常细胞组平均吸光度-空白对照组平均吸光度。

表4活力测定实验考察结果

试验结论：活力测定实验结果显示，本发明制备的脑蛋白水解物修复率显著高于对比例的。表明本方法制备的脑蛋白水解物活性优于对比例。

实施例

实施例1

a)原料处理：将新鲜猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到2倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆加入重量比为1：2的复合酶，温度40℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的0.5％，水解8小时，水解结束后于沸水中保持8min灭酶，冷却后调节pH为6，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用100Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由酶活力为40万U／克的嗜热菌蛋白酶、酶活力为10万U／克的中性蛋白酶组成。

实施例2

a)原料处理：将冷冻保存的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到3倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆加入重量比为0.5：1.2的复合酶，温度45℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的1％，水解6.5小时，水解结束后于沸水中保持9min灭酶，冷却调节pH为6.3，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用500Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由酶活力为40万U／克的嗜热菌蛋白酶、酶活力为10万U／克的中性蛋白酶组成。

实施例3

a)原料处理：将新鲜的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到2倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆加入重量比为1：2的复合酶，温度44℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的2％，水解4小时，水解结束后于沸水中保持11min灭酶，冷却后调节pH为6.5，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用100Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由酶活力为40万U／克的嗜热菌蛋白酶、酶活力为10万U／克的中性蛋白酶组成。

实施例4

a)原料处理：将冷冻保存的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到4倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆加入重量比为3：2的复合酶，温度40-50℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的1.7％，水解5.3小时，水解结束后于沸水中保持9min灭酶，冷却后调节pH为6.8，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用500Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由酶活力为40万U／克的嗜热菌蛋白酶、酶活力为10万U／克的中性蛋白酶组成。

实施例5

a)原料处理：将冷冻保存的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到2倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆加入重量比为1：2的复合酶，温度43℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的1.5％，水解5小时，水解结束后于沸水中保持10min灭酶，冷却调节pH为6.5，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用100～1000Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由酶活力为40万U／克的嗜热菌蛋白酶、酶活力为10万U／克的中性蛋白酶组成。

实施例6

a)原料处理：将新鲜的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到3.4倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆加入重量比为2.2：4的复合酶，温度46℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的2％，水解5小时，水解结束后于沸水中保持10min灭酶，冷却后调节pH为6.6，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用100～1000Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由酶活力为40万U／克的嗜热菌蛋白酶、酶活力为10万U／克的中性蛋白酶组成。

实施例7

a)原料处理：将冷冻保存的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到4.3倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆加入重量比为2.8：4.5的复合酶，温度48℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的2.5％，水解7.5小时，水解结束后于沸水中保持13.5min灭酶，冷却后调节pH为6.3，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用100～1000Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由酶活力为40万U／克的嗜热菌蛋白酶、酶活力为10万U／克的中性蛋白酶组成。

实施例8

a)原料处理：将新鲜的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将步骤a)所得的猪脑切碎后加入到5倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将步骤b)所得猪脑浆加入重量比为3：5的复合酶，温度50℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的3％，水解3小时，水解结束后于沸水中保持15min灭酶，冷却后调节pH为7，过滤，最后超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将步骤c)所得超滤水解液用1000Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白粉末。

所述复合酶由酶活力为40万U／克的嗜热菌蛋白酶、酶活力为10万U／克的中件蛋白酶组成。

Claims (7)

1.一种脑蛋白水解物的制备方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

a)原料处理：将新鲜或冷冻保存的猪脑去除表面的包膜及血管，洗净，沥干水分，备用；

b)前处理：将所得的猪脑切碎后加入到2～5倍重量水中，室温条件下匀浆，冷冻贮藏；

c)复合酶水解：将冷冻贮藏所得猪脑浆，加入复合酶，温度40-50℃水解，复合酶的重量百分比为猪脑浆的0.5％-3％，水解3-8小时，水解结束后于沸水中保持8-15min灭酶，冷却后调节pH为6-7，过滤，超滤膜过滤水解液去除分子量大于10kDa的水解产物，收集超滤水解液于4℃条件下储存；

d)浓缩：将超滤水解液用100～1000Da的纳滤膜进行浓缩，浓缩液冻干，即得脑蛋白提取物。

2.根据权利要求1所述的一种脑蛋白水解物的制备方法，其中所述复合酶由嗜热菌蛋白酶、中性蛋白酶组成。

3.根据权利要求2所述的一种脑蛋白水解物的制备方法，其中所述嗜热菌蛋白酶的酶活力为40万U／克。

4.根据权利要求2所述的一种脑蛋白水解物的制备方法，其中所述中性蛋白酶的酶活力为10万U／克。

5.根据权利要求2所述的一种脑蛋白水解物的制备方法，其中所述复合酶中嗜热菌蛋白酶、中性蛋白酶重量比为(0.5～3)：(1～5)。

6.根据权利要求5所述的一种脑蛋白水解物的制备方法，其中所述复合酶中嗜热菌蛋白酶、中性蛋白酶重量比为1：2。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一种脑蛋白水解物的制备方法，其中制备方法得到的脑蛋白水解物为原料制备成口服制剂或注射制剂。