CN113908174B - 一种高效安全的脑蛋白水解物制备方法及其应用 - Google Patents

一种高效安全的脑蛋白水解物制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高效安全的猪脑提取物制备方法，包括下述步骤：(1)选取健康猪脑，将其置于10℃以下解冻后，按照猪脑：水的质量比为1:1‑3，加入水，匀浆绞碎，再置于‑20℃冷冻；(2)将冷冻匀浆液置于80‑95℃水浴保温融化后，加入0.1‑1.0％的复合酶后，再将其置于30‑50℃水浴条件下保温酶解1‑10h后得酶解液；(3)取出酶解液，置于0‑10℃、4000‑4500r/min条件下离心20‑30min，收集离心上清液，再将制得的离心上清液置于纸浆过滤器减压抽滤，将收集滤液置于‑20℃冷冻；(4)取出冷冻滤液，将其置于15℃以下水浴融化后，再将融化滤液置于0‑10℃、4000‑4500r/min条件下离心20‑30min，收集滤液再用纸浆过滤器减压抽滤，所得滤液经截留分子量为10000‑30000道尔顿的超滤膜超滤，制得猪脑提取物。本发明显著提高了资源利用率、显著改善了曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的稳定性、质量均一性、有效性和安全性，保障临床用药安全有效。

Description

一种高效安全的脑蛋白水解物制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高效安全的脑蛋白水解物制备方法及其应用。
背景技术
曲克芦丁脑蛋白水解物注射液为曲克芦丁与猪脑提取物组合制成的灭菌注射液。每1000ml曲克芦丁脑蛋白水解物注射液由适量的猪脑提取物(含总氮500mg,多肽1910mg，核酸≥800mg)、40g曲克芦丁(以C33H42O19计)和适量的注射用水组成。曲克芦丁脑蛋白水解物注射液中含曲克芦丁(C33H42O19)为36.0-44.0mg/ml,总氮含量为0.40-0.60mg/ml，多肽含量1.52-2.30mg/ml,核酸含量≥0.8mg/ml。曲克芦丁脑蛋白水解物注射液临床用于治疗脑血栓、脑栓塞、脑痉挛等急慢性脑血管疾病，以及用于治疗颅脑外伤、脑外伤及脑血管疾病(脑供血不全、脑梗塞)所引起的脑功能障碍等后遗症，用于治疗闭塞性周围血管疾病、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿。
猪脑提取物的制备包括匀浆、冻融、酶解、过滤等步骤。但猪脑提取物在制备过程中对温度控制、过滤效果、制备时间及容器具处理等要求较高，在制备中容易导致酶解和过滤的周期过长、提取效率低，从而易导致微生物污染和高分子量物质增多，进而影响药物的质量、稳定性和用药安全性。为此，需要研究开发高效安全的猪脑提取物制备方法，缩短生产周期，减少甚至避免猪脑提取物制备中的微生物污染和内毒素生成，提高药物的质量和稳定性，保障临床的用药安全有效性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效安全的猪脑提取物制备方法，包括下述步骤：
(1)选取检疫合格的、冻存于-20℃以下的健康猪脑，将其置于10℃以下解冻后，拣选去除杂质，按照猪脑：水的质量比为1:1-3，加入水，匀浆绞碎，再将制得的猪脑匀浆液置于-20℃冷冻；
(2)将步骤(1)制得的冷冻匀浆液置于10-15℃水浴保温融化36-48h后，加热至80-95℃保温15-30分钟，降温至30-50℃，调节匀浆液pH6.5-8.0后，加入0.1-1.0％(质量比)的复合酶，再将其置于30-50℃水浴条件下保温酶解1-10h后，降温至20-30℃，调pH3.0-4.0后，再降温至5-6℃，得酶解液，其中，所述复合酶为胰蛋白酶：脂肪酶：淀粉酶按质量比为1：1：1混合而成；
(3)取出步骤(2)制得的酶解液，置于0-10℃、4000-4500r/min条件下离心20-30min，收集离心上清液，再将制得的离心上清液置于纸浆过滤器减压抽滤，收率滤液后，调pH8.0-9.0，加热至80-90℃后保温15-30分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，降温至5-6℃，调PH7.0-7.5，加热80-90℃保温15-30分钟，降温20℃以下，用纸浆过滤器减压抽滤，得澄清滤液，置于-20℃冷冻；
(4)取出步骤(3)制得的冷冻滤液，置于15℃以下水浴融化后，再将融化滤液置于0-10℃、4000-4500r/min条件下离心20-30min，收集滤液再用纸浆过滤器减压抽滤，所得滤液经截留分子量为10000-30000道尔顿的超滤膜超滤，制得猪脑提取物。
本发明优选的技术方案中，调节猪脑匀浆液pH 7.0-7.5。
本发明优选的技术方案中，在制得的猪脑匀浆液中加入复合蛋白酶的量为0.5-0.8％(质量比)。
本发明优选的技术方案中，所述步骤(3)的纸浆过滤器减压抽滤步骤可重复操作1-3次。
本发明优选的技术方案中，所述纸浆过滤器的制备包括下述步骤：将定性中速滤纸用水浸泡至润湿后，将其置于300-500r/min搅拌20-30min，120℃下灭菌10-30min，再制得糊状纸浆均匀平铺在过滤器中，压实，抽真空至0.06-0.1Mpa。
本发明优选技术方案中，将过滤器先用1.0-2.0％的氢氧化钠溶液浸泡1-2h、洗涤干净后，120℃下灭菌10-30min，再将纸浆均匀平铺在过滤器上。
本发明优选的技术方案中，所述纸浆的厚度为1-4cm，优选为1.5-3.5cm，更优选为2-3cm。
本发明优选技术方案中，所述超滤膜的截留分子量为15000-20000道尔顿。
本发明的另一目的在于提供一种高安全性的猪脑提取物，该提取物由本发明的方法制得。
本发明优选的技术方案中，所述高安全性的猪脑提取物中的微生物含量≤100cfu/ml，优选≤15cfu/ml，更优选为0cfu/ml。
本发明优选的技术方案中，所述高安全性的猪脑提取物中的高分子量物质含量≤0.2％，优选≤0.1％，更优选为未检出。
本发明的另一目的在于提供一种高安全性的猪脑提取物用于制备曲克芦丁脑蛋白水解物注射液中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种高安全性的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备方法，其中，每1000ml曲克芦丁脑蛋白水解物注射液由适量的本发明的猪脑提取物、40g曲克芦丁(以C33H42O19计)和适量的注射用水组成，包括下述步骤：取所需量的曲克芦丁溶解于注射用水，在搅拌条件下，将制得的曲克芦丁水溶液加热至90-100℃后加入以曲克芦丁质量计的0.01-1％的活性炭，继续搅拌1-3h后，降温至20-30℃，经孔径为0.15-0.50μm的膜过滤后，调滤液pH7.0-7.5后，加入本发明的猪脑提取物，补加注射水定容，在100℃灭菌20-30分钟，即得。
本发明优选技术方案中，活性炭的添加量为曲克芦丁质量的0.05-0.1％。
本发明优选技术方案中，所述滤膜的孔径为0.20-0.22μm。
本发明优选的技术方案中，所述曲克芦丁脑蛋白水解物注射液中的多肽含量为1.53-2.3mg/ml，优选1.8-2.1mg/mg，更优选1.95-2.0mg/ml。
本发明优选技术方案中，所述曲克芦丁脑蛋白水解物注射液中的总氮含量为0.4-0.6mg/ml，优选0.45-0.58mg/ml，更优选0.5-0.55mg/ml。
本发明优选技术方案中，所述曲克芦丁脑蛋白水解物注射液中的核酸含量≥0.8mg/ml，优选≥0.85mg/ml。
本发明优选的技术方案中，所述曲克芦丁脑蛋白水解物注射液为无菌。
本发明优选的技术方案中，所述曲克芦丁脑蛋白水解物注射液未见可见异物。
本发明的另一目的在于提供一种高安全性的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液用于脑血栓、脑栓塞、脑痉挛等急慢性脑血管疾病，以及颅脑外伤及脑外伤及脑血管疾病所引起的脑功能障碍等后遗症的任一种或其并发症的药物中的应用。
本发明优选的技术方案中，所述脑血管疾病选自脑供血不全、脑梗塞的任一种或其并发症。
本发明的另一目的在于提供一种高安全性的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液用于闭塞性周围血管疾病、血栓性静脉炎、毛细血管出血以及血管通透性升高引起的水肿的任一种或其并发症的药物中的应用。
本发明优选的技术方案中，所述曲克芦丁脑蛋白水解物注射液用于肌肉注射时，每次2-4毫升，每天两次。
本发明优选的技术方案中，所述曲克芦丁脑蛋白水解物注射液用于静脉滴注时，每天静脉注射10ml，将10毫升注射液稀释于250-500毫升0.9％氯化钠注射液或5％葡萄糖注射液中。20天为一个疗程，使用1-3个疗程，每个疗程间隔3-7天。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明有关曲克芦丁脑蛋白水解物注射液相关指标，包括溶液澄清度、热原、过敏反应、高分子量杂质、可见异物等的检测方法参照《中国药典》(2020版)、《中国药典》(2020版)四部、《中国药典》(2020版)四部通则、《中国药典》(2020版)中的分子排阻色谱法。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1.本发明改进优化脑蛋白水解物制备中的酶解、过滤等步骤及其条件，显著缩短生产周期并显著减少三废处理量，显著降低注射液被微生物感染的风险，显著提高猪脑提取物中的多肽提取率、澄清度，进而显著提高药物质量、稳定性及其用药安全有效性，并显著降低了注射液中的可见异物和高分子杂质量，提高产品质量，保障用药安全性。本发明显著提高了资源利用率、显著改善了曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的稳定性、质量均一性、有效性和安全性，保障临床用药安全有效。
2、本发明的制备方法具有操作简便、提取效率高、提取物质量好且质量均一性优、绿色环保、成本更优、适合工业化生产等优点。
具体实施方式
以下参照实施例说明本发明，但本发明不局限于实施例。
实施例1曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备
高效安全的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取检疫合格的、冻存于-20℃以下的健康猪脑，将其置于10℃以下解冻后，拣选去除杂质，按照猪脑：水的质量比为1:1，加入水，匀浆绞碎，再将制得的猪脑匀浆液置于-20℃冻藏；
(2)将步骤(1)制得的冻藏匀浆液置于15℃水浴保温融化48h，然后加热95℃保温30分钟后，降温至40℃，调节猪脑匀浆液pH 7.0，加入0.5％的复合酶后，再将其置于40℃水浴条件下保温酶解5h后，降温至25℃，调pH 3.5后，再降温至5℃，制得酶解液，其中，所述复合酶为胰蛋白酶：脂肪酶：淀粉酶按质量比为1：1：1混合而成；
(3)取出步骤(2)制得的酶解液，置于5℃、4000r/min条件下离心25min，收集离心上清液，再将制得的离心上清液置于纸浆厚度为1.5cm的纸浆过滤器上减压抽滤，收集滤液后，调pH8.0，加热至80℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆厚度为1.5cm的纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，再降温至5℃，调pH7.0，加热至80℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆厚度为1.5cm的纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，将收集滤液置于-20℃冷冻；
(4)取出步骤(3)制得的冷冻滤液，将其置于15℃以下水浴融化后，再将融化滤液置于5℃、4000r/min条件下离心25min，收集滤液再用纸浆厚度为1.5cm的纸浆过滤器减压抽滤，所得滤液经截留分子量为20000道尔顿的超滤膜超滤，制得猪脑提取物；
所述纸浆过滤器的制备包括下述步骤：1)将过滤器用2.0％的氢氧化钠溶液浸泡1h后，洗涤干净，120℃下灭菌10min；2)将定性中速滤纸用水浸泡至润湿后，将其置于300-500r/min下搅拌20-30min，120℃下灭菌10min，再制得糊状纸浆均匀平铺在过滤器中厚度为1.5cm，砸实，抽真空至0.06-0.1Mpa；
(5)将200g曲克芦丁用500ml注射水溶解后，加入0.2g药用炭，加热至100℃保温1h，降温至30℃，过滤，收集滤液调pH7.5，再加入猪脑提取物400g，补加注射水定容至5000ml，搅拌混匀后，经0.22μm的膜过滤后，灌封，100℃灭菌30分钟，得曲克芦丁脑蛋白水解物注射液。
实施例2曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备
高效安全的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取检疫合格的健康猪脑，将其置于10℃以下解冻后，拣选去除杂质，按照猪脑：水的质量比为1:2，加入水，匀浆绞碎，再将制得的猪脑匀浆液置于-20℃冻藏；
(2)将步骤(1)制得的冻藏匀浆液置于15℃水浴保温融化48h，然后加热95℃保温30分钟后，降温至30℃，调节猪脑匀浆液pH 6.5后，加入0.1％(质量比)的复合酶后，再将其置于30℃水浴条件下保温酶解1-10h后，降温至20℃，调pH3.0后，再降温至5℃，得酶解液，其中，所述复合酶为胰蛋白酶：脂肪酶：淀粉酶按质量比为1：1：1混合而成；
(3)取出步骤(2)制得的酶解液，置于0℃、4000r/min条件下离心20min，收集离心上清液，再将制得的离心上清液置于纸浆厚度为2cm的纸浆过滤器减压抽滤，收率滤液后，调pH8.0，加热至80℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆厚度为2cm的纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，再降温至5℃，调pH7.0，加热至80℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆厚度为2cm的纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，将收集滤液置于-20℃冷冻；
(4)取出步骤(3)制得的冷冻滤液，将其置于15℃以下水浴融化后，再将融化滤液置于0℃、4000r/min条件下离心20min，收集滤液再用纸浆厚度为2cm的纸浆过滤器减压抽滤，所得滤液经截留分子量为10000道尔顿的超滤膜超滤，制得猪脑提取物。
所述纸浆过滤器的制备包括下述步骤：1)将过滤器用2.0％的氢氧化钠溶液浸泡1h后，洗涤干净，120℃下灭菌10min；2)将定性中速滤纸用水浸泡至润湿后，将其置于300r/min下搅拌20min，120℃下灭菌10min，再制得糊状纸浆均匀平铺在过滤器中厚度为2cm，抽真空至0.06-0.1Mpa；
(5)将200g曲克芦丁用500ml注射水溶解后，加入0.2g药用炭，加热至100℃保温1h，降温至30℃，过滤，收集滤液调PH7.0-7.5，再加入猪脑提取物400g，补加注射水定容至5000ml，搅拌混匀后，药液0.22μm的膜过滤后，灌封，100℃灭菌30分钟，得曲克芦丁脑蛋白水解物注射液。
实施例3曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备
高效安全的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取检疫合格的健康猪脑，将其置于10℃以下解冻后，拣选去除杂质，按照猪脑：水的质量比为1:3，加入水，匀浆绞碎，再将制得的猪脑匀浆液置于-20℃冻藏；
(2)将步骤(1)制得的冻藏匀浆液置于15℃水浴保温融化48h，然后加热95℃保温30分钟后，降温至50℃，调节猪脑匀浆液pH 8.0后，加入1.0％(质量比)的复合酶后，再将其置于50℃水浴条件下保温酶解10h后，降温至20-30℃，调pH4.0后，再降温至6℃，得酶解液，其中，所述复合酶为胰蛋白酶：脂肪酶：淀粉酶按质量比为1：1：1混合而成；
(3)取出步骤(2)制得的酶解液，置于10℃、4500r/min条件下离心30min，收集离心上清液，再将制得的离心上清液置于纸浆厚度为5cm的纸浆过滤器减压抽滤，收率滤液后，调pH9.0，加热至90℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆厚度为5cm的纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，再降温至5℃，调pH7.0，加热至80℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆厚度为5cm的纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，将收集滤液置于-20℃冷冻；
(4)取出步骤(3)制得的冷冻滤液，将其置于15℃以下水浴融化后，再将融化滤液置于10℃、4500r/min条件下离心30min，收集滤液再用纸浆厚度为5cm的纸浆过滤器减压抽滤，所得滤液经截留分子量为30000道尔顿的超滤膜超滤，制得猪脑提取物。
所述纸浆过滤器的制备包括下述步骤：1)将过滤器用2.0％的氢氧化钠溶液浸泡1h后，洗涤干净，120℃下灭菌10min；2)将定性中速滤纸用水浸泡至润湿后，将其置于500r/min下搅拌30min，120℃下灭菌10min，再制得糊状纸浆均匀平铺在过滤器中，然后砸实，纸浆厚度为5cm，抽真空至0.06-0.1Mpa；
(5)将200g曲克芦丁用500ml注射水溶解后，加入0.2g药用炭，加热至100℃保温1h，降温至30℃，过滤，收集滤液调PH7.0-7.5，再加入猪脑提取物400g，补加注射水定容至5000ml，搅拌混匀后，药液0.22μm的膜过滤后，灌封，100℃灭菌30分钟，得曲克芦丁脑蛋白水解物注射液。
实施例4曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备
曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取检疫合格的健康猪脑，将其置于10℃以下解冻后，拣选去除杂质，按照猪脑：水的质量比为1:2，加入水，匀浆绞碎，再将制得的猪脑匀浆液置于-20℃冻藏；
(2)将步骤(1)制得的冻藏匀浆液置于15℃水浴保温融化48h，然后加热95℃保温30分钟后，降温至40℃，调节猪脑匀浆液pH 7.0后，加入0.5％的胰蛋白酶后，再将其置于40℃水浴条件下保温酶解5h后，降温至25℃，调pH 3.5后，再降温至5℃，得酶解液；
(3)取出步骤(2)制得的酶解液，置于5℃、4000r/min条件下离心25min，收集离心上清液，再将制得的离心上清液置于过滤器减压抽滤，收率滤液后，调pH9.0，加热至90℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用过滤器减压抽滤，收集滤液，再降温至5℃，调pH7.0，加热至80℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用过滤器减压抽滤，收集滤液，将收集滤液置于-20℃冷冻；
(4)取出步骤(3)制得的冷冻滤液，将其置于15℃以下水浴融化后，再将融化滤液置于5℃、4000r/min条件下离心25min，收集滤液再用过滤器减压抽滤，所得滤液经截留分子量为20000道尔顿的超滤膜超滤，制得猪脑提取物；
所述过滤器上设置定性中速滤纸；
(5)将200g曲克芦丁用500ml注射水溶解后，加入0.2g药用炭，加热至100℃保温1h，降温至30℃，过滤，收集滤液调PH7.0-7.5，再加入猪脑提取物400g，补加注射水定容至5000ml，搅拌混匀后，药液0.22μm的膜过滤后，灌封，100℃灭菌30分钟，得曲克芦丁脑蛋白水解物注射液。
试验例1本发明猪脑提取物的检测结果
按照本发明的检测方法，检测实施例1和实施例4制得的猪脑提取物，结果见表1。
表1
Figure BDA0003359606980000121
Figure BDA0003359606980000131
试验例2曲克芦丁脑蛋白水解物注射液引发的过敏反应研究
按照本发明所述的检测方法研究实施例1和实施例4制得的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液引发的过敏反应。
用实施例1和实施例4制得的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液配置得到含不同多肽含量的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液。
选取36只250g的健康豚鼠，每组6只。每只豚鼠静脉注射不同多肽含量的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液1ml激发后，30分钟内观察过敏反应。结果见表2。
表2
Figure BDA0003359606980000132
试验例3曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的长期稳定性研究
选取实施例1、实施例4制得的曲克芦丁脑蛋白水解物注射液各100支，将其置于常温、阴凉条件下放置2年-3年，按照本发明所述的方法检测可见异物，结果见表3。
表3
组别 放置2年 放置3年
实施例1 100支均无可见异物 100支均无可见异物
实施例4 100支均无可见异物 100支中有18支有可见异物
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种曲克芦丁脑蛋白水解物注射液的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取检疫合格的、冻存于-20℃以下的健康猪脑，将其置于10℃以下解冻后，拣选去除杂质，按照猪脑：水的质量比为1:1，加入水，匀浆绞碎，再将制得的猪脑匀浆液置于-20℃冻藏；
(2)将步骤(1)制得的冻藏匀浆液置于15℃水浴保温融化48h，然后加热95℃保温30分钟后，降温至40℃，调节猪脑匀浆液pH 7.0，加入0.5％的复合酶后，再将其置于40℃水浴条件下保温酶解5h后，降温至25℃，调pH 3.5后，再降温至5℃，制得酶解液，其中，所述复合酶为胰蛋白酶：脂肪酶：淀粉酶按质量比为1：1：1混合而成；
(3)取出步骤(2)制得的酶解液，置于5℃、4000r/min条件下离心25min，收集离心上清液，再将制得的离心上清液置于纸浆厚度为1.5cm的纸浆过滤器上减压抽滤，收集滤液后，调pH8.0，加热至80℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆厚度为1.5cm的纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，再降温至5℃，调pH7.0，加热至80℃后保温20分钟，再降温至20℃以下后，用纸浆厚度为1.5cm的纸浆过滤器减压抽滤，收集滤液，将收集滤液置于-20℃冷冻；
(4)取出步骤(3)制得的冷冻滤液，将其置于15℃以下水浴融化后，再将融化滤液置于5℃、4000r/min条件下离心25min，收集滤液再用纸浆厚度为1.5cm的纸浆过滤器减压抽滤，所得滤液经截留分子量为20000道尔顿的超滤膜超滤，制得猪脑提取物；
所述纸浆过滤器的制备包括下述步骤：1)将过滤器用2.0％的氢氧化钠溶液浸泡1h后，洗涤干净，120℃下灭菌10min；2)将定性中速滤纸用水浸泡至润湿后，将其置于300-500r/min下搅拌20-30min，120℃下灭菌10min，再制得糊状纸浆均匀平铺在过滤器中厚度为1.5cm，砸实，抽真空至0.06-0.1Mpa；
(5)将200g曲克芦丁用500ml注射水溶解后，加入0.2g药用炭，加热至100℃保温1h，降温至30℃，过滤，收集滤液调pH7.5，再加入步骤（4）制得的猪脑提取物400g，补加注射水定容至5000ml，搅拌混匀后，经0.22μm的膜过滤后，灌封，100℃灭菌30分钟，得曲克芦丁脑蛋白水解物注射液。
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