CN101933944B - 骨肽注射液的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种骨肽注射液的制备方法。它采用冷的丙酮和酸碱沉淀去除杂蛋白，并通过50KD、10KD，5KD超滤膜多级超滤，既能保证杂蛋白的彻底去除，又能有效地控制高分子量物质，使得骨肽注射液中得高分子物质少于2.1％，大大低于国家标准更有效保证制剂的安全性。

Description

骨肽注射液的制备方法
技术领域
本发明属于生物制药领域技术，具体涉及一种骨肽注射液的制备方法。
背景技术
骨肽注射液，曾用名：骨宁注射液，系由健康猪或胎牛四肢骨中提取制成的无菌水溶液，其主要成分为有机钙、磷、无机钙、无机盐、微量元素、氨基酸等。本品具有调节骨代谢，刺激成骨细胞增殖，促进新骨形成，以及调节钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防止骨质疏松。
目前，已公开了一些有关骨肽的制备工艺，是经热压提取、酸碱沉淀去蛋白、离心过滤、超滤、浓缩等过程。通常包括以下方法：(1)将猪四肢骨破碎后加水热压提取；(2)酸碱沉淀，离心去蛋白；(3)酒精沉淀，离心去蛋白；(4)离心液经10000分子量左右的超滤膜超滤得骨肽：(5)根据骨肽含量加注射用水配制注射液制剂。
上述的工艺方法未经过活性炭除热原，不能保证临床使用安全性；再者未经过多级超滤去除大分子物质，使制剂产品易引起过敏反应；其次注射液制剂中未添加稳定剂，注射液中氨基酸、小肽类物质易发生聚合为大分子物质而析出致使制剂不稳定，也易引起过敏反应。
发明内容
本发明的目的在于提供一种骨肽注射液的制备方法，以克服现有技术的不足。
本发明的技术方案为：骨肽注射液的制备方法，它是将去除的脂肪的猪或胎牛的四肢骨用水洗净后破碎，加所述碎骨4倍重量的纯化水加温在115-121℃，保温2小时，冷却至室温的提取液；过滤提取液，得第一上清液，将第一上清液在0-5℃存放净置，除去上层脂肪得第二提取液；将第二提取液浓缩至原体积的1/3～1/5得浓缩液；将浓缩液按体积比1∶1比例加入-10～-20℃预冷的冷丙酮，在不高于-20℃～5℃的低温环境下静置，分离，得第二上清液；第二上清液浓缩至无丙酮得第二浓缩液；调节第二浓缩液得PH值至3.0～4.5，在90～130℃保温后，冷却至室温后分离得第三上清液；调节第三上清液pH值至8.0～8.5，90～130℃保温后，冷却至室温后分离得第四上清液；调节第四上清液pH值至7.2～7.5得第三提取液；在第三提取液中加入活性炭，在75～85℃搅拌后过滤脱碳；过滤液先后通过50KD、10KD和5KD超滤膜超滤得骨肽溶液；在骨肽溶液中加入中加注射用水调节至每毫升溶液中含骨肽不少于6mg；加入稳定剂，灭菌得骨肽注射液。
加入稳定剂吐温-80至每毫升溶液中的稳定剂重量含量为1-2‰。
本发明法采用丙酮和酸碱沉淀去除杂蛋白，较传统工艺能更有效去除各类杂蛋白，特别是采用-10～-20℃预冷丙酮以及多级超滤，使得骨肽注射液中得高分子物质少于2.1％，大大低于国家标准5.0％，更有效保证制剂的安全性；采用活性炭吸附工艺能有效除热原，进一步保证了制剂临床使用的安全性；先后通过50KD、10KD，5KD超滤膜多级超滤，既能保证杂蛋白的彻底去除，又能有效地控制高分子量物质，保证临床安全性；制剂配料过程中加入吐温-80作稳定剂，能有效得避免制剂在储存过程中氨基酸、小肽类物质等聚合为大分子物质析出，影响制剂的澄明度，保证产品长时间储存过程的稳定，同时降低过敏反应发生率。
具体实施方式
取新鲜的猪(或胎牛)四肢骨，剥离其附着的脂肪，用饮用水和纯化水先后分别清洗三次，然后将其破碎。
将破碎的猪(或胎牛)四肢骨与其4倍重量的纯化水加入反应罐中，在121℃，保温2小时，然后冷却至室温。
将提取液用纱布过滤弃沉渣，上清液置0-5℃存放12小时以上，除去上层脂肪。
将去脂后的提取液减压真空(温度70-80℃；真空度-0.03～-0.08MPa)浓缩至原体积的1/4。
将浓缩液按体积比1∶1比例加入-10～-20℃预冷的冷丙酮，在不高于5℃的低温环境下静置1-2小时后，迅速离心，弃沉渣取上清液。
上清液减压减压真空(温度50-60℃；真空度-0.03～-0.08MPa)浓缩至无丙酮，同时回收丙酮。
浓缩液在不断搅拌下用10％盐酸调节pH值至4.0，100℃保温45分钟，冷却至室温后离心，弃沉渣取上清液。
上清液再用50％氢氧化钠溶液调节pH值8.5，100℃保温45分钟，冷却至室温后离心，弃沉渣取上清液。
上清液在不断搅拌下用10％的稀盐酸调pH值7.2，然后加入溶液总体积0.5％的活性炭，开启夹层蒸汽升温到80℃，搅拌30分钟后用蔡氏滤器过滤脱碳。
然后用50KD、10KD超滤膜逐级超滤澄清后得澄清液。
澄清液再用5KD超滤膜超滤得骨肽溶液。
制剂：将骨肽按质量标准方法测定多肽含量，加注射用水调节至每毫升含骨肽不少于6mg，同时加入稳定剂吐温-80至每毫升含量为1-2‰，然后灌装、灭菌后即得骨肽注射液。
产品检测：对上述制备的产品的检测结果如下表1
检测结果表1：
Figure BDA0000027061840000031
对高分子物质的检测结果如表2：
表2：
Figure BDA0000027061840000041
病毒灭活效果检测：
按本发明的制备工艺，在匀浆液中加入伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)为指示病毒，经过100℃×45分钟的热处理后，以PK-15细胞作为培养用细胞，采用96孔细胞病变法检测病毒的滴度，以细胞病变(CPE)作为判别病毒存在的指标，对未出现细胞病变的样品用细胞进行盲传三代。通过病毒对照培养结果显示，采用上述热处理方法，可以使伪狂犬病毒滴度下降PRV7.4个LogTCID50/0.1ml，样本经盲传一代、二代、三代，均未见特异致细胞病变作用(CPE)。

Claims (1)

1.一种骨肽注射液的制备方法，是将去除的脂肪的猪或胎牛的四肢骨用水洗净后破碎，加所述碎骨4倍重量的纯化水加温在115-121℃，保温2小时，冷却至室温的提取液；过滤提取液，得第一上清液，将第一上清液在0-5℃存放静置，除去上层脂肪得第二提取液；将第二提取液浓缩至原体积的1/3～1/5得浓缩液；将浓缩液按体积比1∶1比例加入-10～-20℃预冷的冷丙酮，在不高于-20℃～5℃的低温环境下静置，分离，得第二上清液；第二上清液浓缩至无丙酮得第二浓缩液；调节第二浓缩液得PH值至3.0～4.5，在90～130℃保温后，冷却至室温后分离得第三上清液；调节第三上清液pH值至8.0～8.5，90～130℃保温后，冷却至室温后分离得第四上清液；调节第四上清液pH值至7.2～7.5得第三提取液；在第三提取液中加入活性炭，在75～85℃搅拌后过滤脱碳；过滤液先后通过50KD、10KD和5KD超滤膜超滤得骨肽溶液；在骨肽溶液中加入中加注射用水调节至每毫升溶液中含骨肽不少于6mg；加入稳定剂，灭菌得骨肽注射液；所述加入稳定剂至每毫升溶液中的稳定剂重量含量为1-2‰；稳定剂是吐温-80。
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