CN109536553A

CN109536553A - 一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法

Info

Publication number: CN109536553A
Application number: CN201811454618.XA
Authority: CN
Inventors: 熊何健
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2019-03-29

Abstract

本发明公开了一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法，此法以鲍加工下脚料鲍内脏为原料，采用脂肪酶与蛋白酶联合阶梯酶解、膜分离技术制备糖肽类化合物，以糖肽为模板，利用亚硒酸钠与茶多酚、Vc的反应介导制备一种糖肽纳米硒溶胶。本发明采用具有生物活性的糖肽、茶多酚为稳定剂、还原剂制备纳米硒材料，既能利用糖肽类物质同时具有多羟基、酰胺键的结构特征和糖肽、茶多酚相对温和的还原能力，极大的增强纳米硒溶胶稳定性，又能利用糖肽、茶多酚生理活性强化产品的生物学功能，有利于其在保健/功能食品、生物医药、化妆品等领域的开发应用，同时也为鲍资源高值化利用提供一条有效途径。

Description

一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法

技术领域

本发明属于纳米技术领域，特别涉及一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法。

背景技术

硒是一种人体必需的微量元素，是构成机体抗氧化酶系统的关键成分，对维持机体的生命活动有重要作用。但硒的营养剂量与可耐受最高摄入量间的范围很窄，致使硒营养补充不易控制。近年来的研究表明，纳米硒毒性很低，是目前毒性最低的硒形式，且具有很高的生物利用率和生物活性。

纳米硒材料制备过程中，纳米颗粒的无序分散、快速团聚、无定形形貌一直是纳米硒制备中要解决的关键技术问题。研究表明，多糖、蛋白质等生物大分子材料可以作为修饰剂，能较有好地使纳米硒微粒均匀分散、防止团聚，且形成特殊的形貌，从而在纳米硒材料的成核、生长微粒形状调控等方面发挥作用。然而，天然多糖、蛋白质物质分子量大，大分子间纠缠作用导致硒溶胶材料存放后期的不稳定，使用多糖或蛋白质仍无法很好解决纳米硒溶胶后期团聚导致的稳定性问题。

鲍内脏是鲍加工过程中产生的下脚料，量极大，但因是非食物资源，通常被废弃，既污染环境，也浪费资源。鲍内脏干物质中，蛋白质含量约50%、糖类约15%、脂质约10%，且作为动物材料，内脏组织中的糖多以结合态的糖蛋白形式存在，通过生物酶解技术对糖蛋白质适度水解，可制备中等分子量的糖肽类物质，同时具有多糖的多羟基结构和蛋白质多肽链的酰胺平面结构特征，且不存在生物大分子的分子间纠缠，对纳米硒能起到极好的稳定效果。目前，使用鲍内脏糖肽类物质制备纳米硒溶胶尚未见文献报道。

发明内容

本发明针对现有纳米硒溶胶制备存在的缺陷，联合使用生物技术与膜分离技术组合工艺，旨在提供一种速度快、处理量大、可连续化操作的糖肽纳米硒溶胶的工业化制备方法。

本发明具体通过以下技术方案实现；

本发明是一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法，包括以下步骤：

1) 原料预处理：将冷冻鲍内脏解冻破碎，加水、NaHCO₃混合，在微沸状态下热处理15-25min，降温至60℃以下，料液pH值9.0-10.5；

2）联合阶梯酶解：料液添加碱性脂肪酶和碱性蛋白酶在30-60℃联合酶解，当酶解液的pH值下降到约8.0时，调整物料温度35-55℃，添加胰蛋白酶继续水解。酶解3.0-9.0 hr后，物料加活性碳煮沸灭酶、脱色，经碟式离心机离心，取水相为酶解液；

3）膜分离制备鲍内脏糖肽：酶解液经孔径50-800nm陶瓷膜微滤，滤液先经截留分子量100-150KD超滤膜超滤，超滤透过液再经截留分子量1-10KD超滤膜超滤，得截留液，即为鲍内脏糖肽溶液；

4）鲍内脏糖肽纳米硒溶胶的制备：加水调整鲍内脏糖肽溶液固形物含量，缓慢加入亚硒酸钠溶液，物料缓慢搅拌0.5-4.0hr，然后缓慢加入茶多酚与Vc混合溶液组成制备纳米硒溶胶的反应体系，在20-60℃温度下反应1.0-10.0hr。反应完成后用截留分子量0.5-50KD膜分离脱除未反应的亚硒酸钠，得到的截留液即鲍内脏糖肽纳米硒溶胶。

进一步：

步骤1）中所述的加水量为鲍内脏湿物料重量的8-12倍。

步骤2）中所述的碱性脂肪酶的用量为60-600U/g鲍内脏原料，碱性蛋白酶的用量为100-1000U/g鲍内脏原料，胰蛋白酶的用量为100-1000U/g鲍内脏原料。

步骤4）中所述的制备纳米硒溶胶的反应体系中，鲍内脏糖肽固形物含量为0.01-1.00%，亚硒酸钠浓度为0.1-10mmol/L，茶多酚、Vc混合物的浓度0.5-50 mmol/L，茶多酚、Vc混合物中茶多酚的摩尔百分比为10%-90%。

本发明的有益效果为

脂质类物质的存在会严重影响纳米硒溶胶的稳定性。动物材料中的脂质常以脂蛋白、糖脂的结合态形式存在，脱脂困难。本发明联合应用NaHCO₃碱/盐处理、脂肪酶水解、碟式离心机械分离进行脱脂操作，不仅提高脱脂效果，同时促进原料中糖类物质的释放，提高糖肽得率。本发明首次以鲍内脏酶解产物糖肽为模板，通过亚硒酸钠与茶多酚、Vc混合物的反应介导制备一种鲍内脏糖肽纳米硒溶胶产品。

鲍内脏中含有大量色素，色素类物质残留会严重影响后续纳米硒溶胶的制备。本发明通过原料预处理中NaHCO₃碱性条件下热降解、灭酶操作时的活性碳吸附、酶解液陶瓷微滤与第一次超滤操作时的截留作用，完成糖肽制备工艺中的脱色处理。

联合应用碱性蛋白酶、胰蛋白酶阶梯水解鲍内脏蛋白质制备糖肽类物质，其分子量主要分布在1-100kDa，糖肽同时具有多糖的多羟基结构和蛋白质多肽链的酰胺平面结构特征，能极好的增强纳米硒溶胶的稳定性。

联合利用糖肽、茶多酚相对温和的还原能力，与Vc共同作为还原剂制备纳米硒，使得硒离子还原反应过程更为缓和、平稳，克服纳米硒颗粒因快速生成导致团聚、颗粒形态不规则的缺点。同时，糖肽、茶多酚还具有增强免疫、降血脂和调节肠道菌群等诸多生理活性，能强化纳米硒产品的生物学功能，利于其开发应用。

纳米硒溶胶制备过程中，通常采用半透膜透析脱除体系中最终未反应的硒离子，周期长，处理量小。本发明则采用超滤技术，速度快、处理量大，可连续化操作，易于实现工业化生产。本发明制备的纳米硒溶胶在保健食品、生物医药、化妆品等领域具有很好的应用前景，同时也为鲍资源的高效利用提供一条有效途径。

附图说明

图1本发明制备的鲍内脏糖肽纳米硒透射电镜图。

图2本发明制备的鲍内脏糖肽纳米硒存放6个月透射电镜图。

图3本发明制备的鲍内脏糖肽纳米硒灌胃小鼠肠道（粪便）菌群热图。

具体实施例

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：

本发明是一种纳米硒溶胶的制备方法，它包括以下步骤：

（1）原料预处理：冷冻鲍内脏解冻，取5kg加50kg去离子水经胶体磨磨浆破碎，送入酶解罐，加NaHCO₃调整料液pH10.5，加热在微沸状态下热处理25min，降温至55℃。

（2）联合阶梯酶解：料液按600U/g鲍内脏原料添加碱性脂肪酶、1000U/g鲍内脏原料添加碱性蛋白酶55℃联合酶解，当酶解液的pH值下降到8.1时，调整物料温度35℃，按100U/g鲍内脏原料添加胰蛋白酶继续水解，酶解至8.0 hr，加0.6kg活性碳煮沸，碟式离心机离心得酶解液。

（3）膜分离制备鲍内脏糖肽：酶解液降温至室温经孔径800nm陶瓷膜微滤，滤液先经截留分子量150KD超滤膜超滤，超滤透过液再经截留分子量1KD超滤膜超滤得截留液，即为鲍内脏糖肽溶液；

（4）鲍内脏糖肽纳米硒溶胶的制备：鲍内脏糖肽溶液加去离子水，再缓慢加入亚硒酸钠溶液，物料缓慢搅拌1.0hr，然后缓慢加入茶多酚与Vc混合溶液，反应体系中各物料浓度为：鲍内脏糖肽固形物含量为0.10%，亚硒酸钠浓度为1.0mmol/L，茶多酚、Vc混合物的浓度10mmol/L，茶多酚、Vc混合物中茶多酚的摩尔百分比为80%。室温反应8.0hr。反应完成后用截留分子量10KD膜分离脱除未反应的亚硒酸钠，得到的截留液即鲍内脏糖肽纳米硒溶胶。

实施例2：

本发明是一种纳米硒溶胶的制备方法，它包括以下步骤：

（1）原料预处理：冷冻鲍内脏解冻，取5kg加60kg去离子水经胶体磨磨浆破碎，送入酶解罐，加NaHCO₃调整料液pH9.5，加热在微沸状态下热处理15min，降温至35℃。

（2）联合阶梯酶解：料液按60U/g鲍内脏原料添加碱性脂肪酶、500U/g鲍内脏原料添加碱性蛋白酶35℃联合酶解，当酶解液的pH值下降到8.2时，调整物料温度55℃，按1000U/g鲍内脏原料添加胰蛋白酶继续水解，酶解至4.0 hr，加1.0kg活性碳煮沸，碟式离心机离心得酶解液。

（3）膜分离制备鲍内脏糖肽：酶解液降温至35℃经孔径50nm陶瓷膜微滤，滤液先经截留分子量100KD超滤膜超滤，超滤透过液再经截留分子量10KD超滤膜超滤得截留液，即为鲍内脏糖肽溶液；

（4）鲍内脏糖肽纳米硒溶胶的制备：鲍内脏糖肽溶液加去离子水，再缓慢加入亚硒酸钠溶液，物料缓慢搅拌3.0hr，然后缓慢加入茶多酚与Vc混合溶液，反应体系中各物料浓度为：鲍内脏糖肽固形物含量为0.02%，亚硒酸钠浓度为0.2mmol/L，茶多酚、Vc混合物的浓度2mmol/L，茶多酚、Vc混合物中茶多酚的摩尔百分比为20%，50℃温度下反应2.0hr。反应完成后用截留分子量1KD膜分离脱除未反应的亚硒酸钠，得到的截留液即鲍内脏糖肽纳米硒溶胶。

鲍内脏糖肽纳米硒粒径和稳定性分析。

由图1可知，鲍内脏糖肽纳米硒颗粒分散度较好，无聚集，粒径小于30nm。

由图2可知，鲍内脏糖肽纳米硒存放6个月无明显颗粒团聚现象，与图1相比，粒径未见增大，表现出良好的稳定性。

鲍内脏糖肽纳米硒对小鼠肠道菌群的影响分析。

昆明种小鼠灌胃鲍多糖纳米硒四周，灌胃剂量50μg Se/kg，对小鼠粪便微生物菌群结构进行分析。由图3可知，小鼠粪便微生物丰度前25的属中，有7个属的丰度发生了显著变化（p<0.05）。有益菌属：乳酸杆菌（Lactobacillus）、副拟杆菌（Parabacteroides）的丰度显著上调，有害菌属：螺杆菌（Helicobaster）、Clostridiales_vadinBB60_group、颤杆菌（Oscillibacter）丰度显著下调；此外，普雷沃氏菌科一未知菌属（unclassified_f_ Prevotellaceae）丰度显著上调，瘤胃菌科的一未知菌属（norank_f__Ruminococcaceae）丰度显著下调。

以上所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1) 原料预处理：将冷冻鲍内脏解冻破碎，加水与NaHCO₃混合，在微沸状态下热处理15-25min，降温至60℃以下，获取料液，料液pH值9.0-10.5；

2）联合阶梯酶解：在料液中添加碱性脂肪酶和碱性蛋白酶在30-60℃联合酶解，当酶解液的pH值下降到约8.0时，调整料液温度35-55℃，添加胰蛋白酶继续水解；酶解3.0-9.0 hr后，物料加活性碳煮沸灭酶、脱色，经碟式离心机离心，取水相作为酶解液；

3）膜分离制备鲍内脏糖肽溶液：酶解液经孔径50-800nm陶瓷膜微滤，滤液先经截留分子量100-150KD超滤膜超滤，超滤透过液再经截留分子量1-10KD超滤膜超滤，得截留液，即为鲍内脏糖肽溶液；

4）糖肽纳米硒溶胶的制备：调整鲍内脏糖肽溶液固形物含量，缓慢加入亚硒酸钠溶液，物料缓慢搅拌0.5-4.0hr，然后缓慢加入茶多酚与Vc混合溶液组成制备纳米硒溶胶的反应体系，在20-60℃温度下反应1.0-10.0hr；反应完成后用截留分子量0.5-50KD膜分离脱除未反应的亚硒酸钠，得到的截留液即鲍内脏糖肽纳米硒溶胶。

2.根据权利要求1所述的一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法，其特征在于：步骤1）中所述的加水量为鲍内脏湿物料重量的8-12倍。

3.根据权利要求1所述的一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法，其特征在于：步骤2）中所述的碱性脂肪酶的用量为60-600U/g鲍内脏原料，碱性蛋白酶的用量为100-1000U/g鲍内脏原料，胰蛋白酶的用量为100-1000U/g鲍内脏原料。

4.根据权利要求1所述的一种糖肽纳米硒溶胶的制备方法，其特征在于：步骤4）中所述的制备纳米硒溶胶的反应体系中，鲍内脏糖肽固形物含量为0.01-1.00%，亚硒酸钠浓度为0.1-10mmol/L，茶多酚、Vc混合物的浓度0.5-50 mmol/L，茶多酚、Vc混合物中茶多酚的摩尔百分比为10%-90%。