CN104292295A - 一种湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法。该方法将热稳定米糠分散于去离子水中，搅拌均匀，添加淀粉酶，80℃～100℃酶解处理30min～60min后，调节其pH至7.0～9.0，灭酶，获得酶解米糠浆液；向酶解米糠浆液中添加葡萄糖或乳糖，混合均匀后获得混合液；混合液经胶体磨均质后置于水热喷射蒸煮器中进行湿热接枝反应，反应液冷却至室温，离心后，上清液pH值调至4.0～5.0，沉淀蛋白质，加水分散蛋白液进行中和、透析、冷冻干燥后，得糖接枝米糠分离蛋白。本发明开发出一种新型的湿热接枝技术，能够进行连续化生产，具有工业化和规模化的应用价值。所得目标蛋白具有更高的接枝度、良好的乳化与消化能力。

Description

一种湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法

技术领域

本发明涉及功能性米糠蛋白，特别是涉及一种湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法，属于谷物副产物深加工技术领域。

背景技术

蛋白的糖基化反应是基于美拉德反应的一类蛋白质化学改性方法。由于在蛋白质分子上引入糖链，增加了许多亲水性的羟基基团，可以有效地改变蛋白质的功能性质，例如增加蛋白的溶解性，进而提高蛋白的乳化性等。

蛋白质与还原糖接枝反应涉及的方法主要包括两种：干热法和湿热法。这两种方法在反应物状态、反应条件及反应设备等方面各有优劣。目前对干热法改性方面的研究较多，其制备的蛋白－多糖共价复合物具有良好的溶解度与理想的乳化性能。然而干热法反应条件严格，反应时间过长，难以应用到工业化生产中。目前有学者开发了湿热法用于蛋白质的糖接枝反应，该方法将蛋白与还原糖(一般为单糖与双糖)混合在密闭的液相体系中进行反应。尽管湿热法反应时间较干热法短；但湿热法反应效率相对较低，导致湿热法同样很难应用到连续的工业化生产中。至今，国内外上利用糖基化改性制备功能性蛋白的原料多为乳清蛋白、大豆分离蛋白、酪蛋白、β‐乳球蛋白与等。

米糠作为大米加工的副产物，其蛋白质含量大约占主成分的12～15％。米糠蛋白的氨基酸组成平衡，具有低过敏性和抗癌活性的特点。对于许多具有健康意识的消费者而言，米糠蛋白产品已经受到越来越多的关注，市场需求巨大。然而，至今仍少有商业化的米糠蛋白产品推出，主要限制性原因是米糠蛋白组成复杂，其溶出得率较低，功能特性较差，限制其在食品工业中的应用。因而，如何提高米糠蛋白的溶出得率，改善蛋白的营养和功能特性已成为国内外研究的热点问题。目前关于米糠蛋白的研究主要集中在蛋白制备方法的尝试等方面，主要包括碱法、酶法与物理方法，但现有报道的方法仍无法兼顾蛋白溶出得率与功能性质同时得到改善。

近年来，发明人发现喷射蒸煮处理可以实现难溶蛋白资源的高效提取，如高温豆粕蛋白和豌豆蛋白(ZL201010161753.2，ZL201110161826.2)，可实现连续生产。对于热稳定米糠蛋白，喷射蒸煮提供的高温高压剪切环境可提高蛋白的溶出，同时可以作为接枝反应器使米糠蛋白中含有少量的糖基化产物，但发明人实验发现，单一的喷射蒸煮处理获得蛋白的纯度较低，不利于蛋白的ε‐氨基与还原糖的还原末端羧基有效接触，导致接枝程度较低，未达到有效改善米糠蛋白功能性质的程度(夏宁,胡磊,王金梅,周小玲,杨晓泉.喷射蒸煮处理对米糠蛋白功能特性及体外消化性的影响.中国粮油学报.2012,27(5):44‐49)。

发明内容

针对现有米糠蛋白提取和糖接枝方法效率低及工业化应用的局限，本发明的目的在于提供一种蛋白质接枝度高、乳液粒径小的湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法，获得的米糠蛋白产品具有突出的溶解能力、乳化与消化性能。

本发明以热稳定化米糠和还原糖为主要原料，采用淀粉酶预处理结合连续水热喷射蒸煮技术进行处理，经过离心、酸沉、复溶、透析、冷冻干燥得到糖接枝米糠蛋白产品本发明以糖基化改性为理论基础，开发一种基于喷射蒸煮的新型连续化湿热接枝技术，用于制备功能性米糠蛋白，以期在获得高溶出率的同时改善其营养及功能性质，这对充分有效地利用米糠资源、提高稻米深加工的经济效益都有深远的意义。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

一种湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)分别以g和mL作为质量和体积单位，将热稳定米糠按1:10～1:20质量体积比分散于去离子水中，调节米糠料液的pH至4.0～6.0，搅拌均匀，按0.5～2.0％的质量比添加淀粉酶，80℃～100℃酶解处理30min～60min后，调节其pH至7.0～9.0，灭酶，获得酶解米糠浆液；

(2)向酶解米糠浆液中添加葡萄糖或乳糖，葡萄糖或乳糖与米糠中蛋白的质量比为1:1～4:1，混合均匀后获得混合液；

(3)混合液经胶体磨均质后置于水热喷射蒸煮器中进行湿热接枝反应，反应温度为110℃～150℃，反应时间为(30～120)s，反应液冷却至室温，离心后，上清液pH值调至4.0～5.0，沉淀蛋白质，加水分散所得蛋白液进行中和、透析、冷冻干燥后，得糖接枝米糠分离蛋白。

为进一步实现本发明目的，优选地，所述均质的时间为10min以上。

所述离心的转速为6000g～10000g；离心的时间为10min～30min。

所述水热喷射蒸煮接枝反应温度为120℃～140℃，反应时间为60s‐90s。

所述搅拌的温度控制为15℃～30℃；搅拌的时间控制为1h～2h。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：目前，蛋白质与还原糖接枝反应主要采用干热法，然而干热法反应条件严格，反应时间过长，难以应用到工业化生产中。近来开发的湿热法尽管反应时间较干热法短，但反应效率相对较低，同样很难连续工业化生产。本发明开发出一种新型的制备功能性米糠蛋白的方法，可实现糖基化改性技术高效应用于米糠蛋白的制备及连续化生产中。本发明将喷射蒸煮器作为糖接枝连续反应器的同时结合淀粉酶处理和外添还原糖工艺有效地强化了糖接枝效果。其中，淀粉酶处理可断裂米糠中淀粉和蛋白的结合，提高蛋白提取率，增大蛋白与还原糖的接触，从而有利于接枝反应的进行；在此基础上，外添还原糖工艺的加入协同强化了糖接枝反应。依据本发明工艺获得的米糠蛋白产品具有突出的溶解能力、乳化与消化性能；可广泛应用于食品加工、化妆保健品、医药等领域。

附图说明：

图1不同处理米糠蛋白的SDS‐PAGE电泳图谱。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述，但实施例不构成对本发明要求保护范围的限定。

本发明中蛋白含量采用GB/T5009.5‐03凯氏定氮法测定，用于计算蛋白提取率和纯度。

本发明中糖基化米糠蛋白产品的总糖含量采用3,5‐二硝基水杨酸法测定。

本发明中糖基化米糠蛋白产品的糖接枝度采用OPA、SDS‐PAGE电泳测定。

本发明中糖基化米糠蛋白产品在pH 8.0的溶解度采用Lowry法测定。

本发明中糖基化米糠蛋白产品的乳化特性采用测定蛋白乳液的体积平均直径(d₄₃)进行评价。方法如下：将糖基化米糠蛋白产品溶于5mM磷酸缓冲液(pH 7.0)配置0.5％米糠蛋白溶液，向其添加10％(w/v)玉米油，并加入0.02％(w/v)叠氮钠，充分混匀后经高速剪切机预乳化(5000rpm,2min)，之后高压微射流均质处理二次(50MPa)，获得蛋白乳液。

本发明中糖基化米糠蛋白产品的消化特性采用体外消化模型进行测定。方法如下：称取1.0g糖基化米糠蛋白溶于100mL pH 1.5的HCl溶液，37℃水浴预热5min，然后加入1％胃蛋白酶(酶/蛋白＝1:100,w/w)酶解120min，调节溶液pH至7.0以终止反应。随后加入1％胰蛋白酶(酶/蛋白＝1:100,w/w)再消化120min，加入20％(w/v)三氯乙酸溶液终止消化，测定此时的可溶性氮含量，用以计算氮释放量(％)，评价米糠蛋白的消化性。

对比实施例：单一的喷射蒸煮处理获得蛋白的纯度较低(对比实施例)

分别以g和mL作为质量和体积单位，将热稳定米糠按1:10的质量体积比分散于去离子水中，调节米糠料液的pH至9.0后经胶体磨均质10min后置于利用广州南联食品机械公司生产的水热喷射蒸煮器中进行处理，反应温度为130℃，反应时间为90s，反应液冷却至室温，8000g离心20min，上清液pH调至4.0沉淀蛋白质，加水分散所得蛋白质，形成蛋白液，中和至pH为7.0，透析，冷冻干燥后，得米糠分离蛋白。

表1.对比实施例的指标

实施例1‐3

一种新型的湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法，步骤如下：

(1)分别以g和mL作为质量和体积单位，将热稳定米糠按1:10、1:15和1:20的质量体积比分散于去离子水中(分别为实施例1、实施例2和实施例3)，调节米糠料液的pH至6.0，室温25℃搅拌2h，按0.5％质量比例向其中添加淀粉酶，90℃酶解处理60min后，调节其pH至9.0进行灭酶，获得酶解米糠浆液；

(2)向上述酶解米糠浆液中添加葡萄糖，其中添加糖量与米糠中蛋白的质量比为2:1，混合均匀后获得混合液；

(3)上述混合液经胶体磨均质10min后置于水热喷射蒸煮器中进行湿热接枝反应，利用广州南联食品机械公司生产的水热喷射蒸煮提供的高温高压实现接枝，反应温度为130℃，反应时间为90s，反应液冷却至室温，冷却后的料液经8000g离心20min后，上清液pH调至4.0沉淀蛋白质，加水分散所得蛋白质，形成蛋白液，中和pH至7.0，透析，冷冻干燥后即得糖接枝米糠分离蛋白。测试结果如表2。

表2.实施例1‐3的指标

从表1和表2可以看出，向热稳定米糠经过淀粉酶预处理并添加葡萄糖后，经过喷射蒸煮湿热接枝后，米糠蛋白的提取率、总糖含量、接枝度、蛋白质溶解度、乳化性和消化性均有大幅度提高。由SDS‐PAGE电泳图谱(图1)可看出，加入葡萄糖的米糠蛋白PAS染色后条带变深，说明米糠蛋白发生了糖接枝。这可能是由于热稳定米糠中添加还原糖后，在喷射蒸煮提供的高温高压环境使得米糠蛋白的ε‐氨基与还原糖的还原末端羧基以共价键相连接形成糖基化蛋白。与只进行喷射蒸煮处理的米糠蛋白相比(对比实施例)，实施例1中的蛋白分子由于较多的引入了糖链，增加了其亲水性羟基基团，有效地改善了蛋白质的功能性质，例如改善蛋白的溶解性，乳化性与起泡性等。特别是，米糠蛋白稳定乳液的粒径由0.72减小到0.32μm。对于单一喷射蒸煮样品的消化性而言，实施例1‐3中料液比小于1:10时，其消化性明显提高。

实施例4‐9

一种新型的湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法，步骤如下：

(1)分别以g和mL作为质量和体积单位，将热稳定米糠按1:20(w/v)料液比分散于去离子水中，调节米糠料液的pH至6.0，室温25℃搅拌2h，按0.5％(w/w)的比例向其中添加淀粉酶，90℃酶解处理60min后，调节其pH至9.0进行灭酶，获得酶解米糠浆液；

(2)向上述酶解米糠浆液中添加葡萄糖或乳糖(见表3，表中葡萄糖:蛋白(1:1)为实施例4，依次至乳糖:蛋白(4:1)为实施例9)，其中添加糖量与米糠中蛋白的质量比为1:1、2:1、4:1(w:w)，混合均匀后获得混合液；

(3)上述混合液经胶体磨均质10min后置于利用广州南联食品机械公司生产的水热喷射蒸煮器中进行湿热接枝反应，反应温度为130℃，反应时间为90s，反应液冷却至室温，冷却后的料液经8000g离心20min后，上清液pH调至4.0沉淀蛋白质，加水分散所得蛋白质，得蛋白液，中和至pH值为6.9，透析、冷冻干燥后即得糖接枝米糠分离蛋白。测试结果如表3。

表3实施例4‐9的指标

从表1和表3可以看出，与对比实施例相比，实施例2中的淀粉酶处理未添加还原糖的米糠样品其提取率不受影响，而其蛋白纯度、接枝程度显著提高，总糖含量较低。这可能是由于米糠经淀粉酶处理后，淀粉部分水解成还原糖，其蛋白与淀粉之间的结合被有效打断，经喷射蒸煮、酸沉后获得蛋白纯度和接枝度显著提高。同时，在这一酸沉过程中，淀粉酶处理样品可以有效避免蛋白回收时淀粉的共沉淀，从而蛋白中总糖含量较低。溶解度、乳化性和消化性均有所提高。

向热稳定米糠中添加葡萄糖或乳糖后，经过喷射蒸煮湿热接枝后，米糠蛋白的提取率、总糖含量、接枝度、蛋白质溶解度、乳化性和消化性均有大幅度提高，说明水热喷射蒸煮处理有助于米糠中的蛋白与还原糖发生糖基化反应，SDS‐PAGE图谱也证实了此推测(图1)。尽管添加糖后蛋白纯度较低，但相对于对比实施例而言，糖接枝米糠蛋白的总糖主要以还原糖为主，有利于强化接枝反应的进行。添加葡萄糖的糖基化反应程度要高于乳糖，且当葡萄糖与蛋白的质量比为2:1时，添加糖接枝后制备的蛋白具有良好的溶解性与乳化性，糖基化反应是造成这些变化的主要原因，但对蛋白的消化性能影响不大。米糠的淀粉酶预处理结合外添还原糖和喷射蒸煮处理可以有效协同强化米糠蛋白的接枝反应，喷射蒸煮可以作为一种新型的湿热接枝反应器应用到米糠蛋白的制备与功能改性上。

实施例10‐12

一种新型的湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法，步骤如下：

(1)将一定量热稳定米糠按1:10(w/v)料液比分散于去离子水中，调节米糠料液的pH至5.0，室温25℃搅拌2h，按0.5％(w/w)的比例向其中添加淀粉酶，90℃酶解处理30min后，调节其pH至9.0进行灭酶，获得酶解米糠浆液；

(2)向上述酶解米糠浆液中添加葡萄糖，其中添加糖量与米糠中蛋白的质量比为2:1(w:w)，混合均匀后获得混合液；

(3)上述混合液经胶体磨均质10min后置于利用广州南联食品机械公司生产的水热喷射蒸煮器中进行湿热接枝反应，反应温度分别为110℃、130℃与150℃(分别为实施例10、实施例11和实施例12)，反应时间为90s，反应液冷却至室温，冷却后的料液经8000g离心20min后，上清液pH调至4.0沉淀蛋白质，加水分散所得蛋白液进行中和、透析、冷冻干燥后即得糖接枝米糠分离蛋白。检测结果如表4：

表4实施例10‐12的指标

从表1和表4可以看出，喷射蒸煮糖接枝反应受温度强烈影响。向热稳定米糠中添加葡萄糖后，经过高于110℃喷射蒸煮湿热接枝后，米糠蛋白的提取率、总糖含量、接枝度、蛋白质溶解度、乳化性和消化性均有大幅度提高。采用不同的水热喷射蒸煮温度处理，在低温110℃下蛋白的提取率、纯度与总糖的含量均较低，说明在该温度下发生的糖基化反应程度较低，高温的150℃反应，虽然在蛋白提取率、纯度、接枝程度和溶解性上与130℃的反应条件相差不大，但是产品的乳化性能与消化性能相对较弱。

图1为实施例1‐3处理米糠蛋白的SDS‐PAGE图谱。图中1,2,3,4,5,6,7分别代表对比实施例、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8以及实施例9样品；分别采用考马斯亮蓝R250(还原电泳和非还原电泳)与PAS染色糖基化产物中的蛋白与糖。

既能使蛋白纯度达到食品工业要求又能显著提高米糠蛋白接枝度的工艺方法是现有技术的难点，也是本发明的关键。发明人考虑到热稳定米糠中蛋白可能与其他物质的牢固结合，导致其无法被有效提取，达到较高的纯度。现有报道中可以借鉴的断裂蛋白与其他物质结合的方法主要有：一是通过蛋白酶水解蛋白质为小肽从而提高提取率和纯度；二是通过纤维素酶等非蛋白酶对天然米糠进行预处理，打断二者的结合，从而提取米糠蛋白(刘颖,田文娟,马永强.非蛋白酶提取米糠蛋白的研究.农产品加工,2010,10,20‐23)。对于热稳定米糠而言，本发明利用淀粉酶结合喷射蒸煮工艺尝试提取具有一定蛋白纯度且接枝程度较高的糖接枝米糠蛋白产品。尽管淀粉酶预处理工艺的加入显著提高了米糠蛋白的纯度，但其糖接枝度仅由4.5％提高至8.4％，米糠蛋白乳化性仅有小幅度提高(对比实施例和实施例4)，蛋白稳定乳液的粒径仅由0.72μm减小到0.64μm。寻找合理工艺是成为了改进淀粉酶结合喷射蒸煮接枝的关键。发明人考虑到淀粉酶预处理可以有效断裂米糠中淀粉和蛋白的结合，且显著减小蛋白质与淀粉在酸沉时的共沉淀，有效提高了蛋白质纯度，在此基础上，本发明在淀粉酶预处理与喷射蒸煮处理之间加入还原糖添加的工艺步骤，可以有效增大体系中蛋白ε‐氨基与还原糖的还原末端羧基的接触，进而强化接枝反应。实施例显示，外源还原糖添加的工艺获得了意想不到的协同效果，外源添加还原糖后，蛋白质接枝度由8.4％最高提高至22.8％，乳液粒径显著减小到0.19μm。

需要说明的是，本发明发现，外添还原糖步骤必须基于淀粉酶预处理基础之上，若直接添加葡萄糖和乳糖等还原糖后直接进行喷射蒸煮处理，尽管蛋白接枝度有一定的提高(接枝度约为10％)，但蛋白纯度低于30％，这一值限制了米糠蛋白作为功能蛋白配料在食品工业中的应用。由此，本发明中的淀粉酶处理，外添还原糖和喷射蒸煮处理工艺对于提高米糠蛋白的接枝有明显的协同改善效果。

Claims (5)

1.一种湿热接枝法制备功能性米糠蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)分别以g和mL作为质量和体积单位，将热稳定米糠按1:10～1:20质量体积比分散于去离子水中，调节米糠料液的pH至4.0～6.0，搅拌均匀，按0.5～2.0％的质量比添加淀粉酶，80℃～100℃酶解处理30min～60min后，调节其pH至7.0～9.0，灭酶，获得酶解米糠浆液；

(2)向酶解米糠浆液中添加葡萄糖或乳糖，葡萄糖或乳糖与米糠中蛋白的质量比为1:1～4:1，混合均匀后获得混合液；

(3)混合液经胶体磨均质后置于水热喷射蒸煮器中进行湿热接枝反应，反应温度为110℃～150℃，反应时间为(30～120)s，反应液冷却至室温，离心后，上清液pH值调至4.0～5.0，沉淀蛋白质，加水分散所得蛋白液进行中和、透析、冷冻干燥后，得糖接枝米糠分离蛋白。

2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述均质的时间为10min以上。

3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述离心的转速为6000g～10000g；离心的时间为10min～30min。

4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述水热喷射蒸煮接枝反应温度为120℃～140℃，反应时间为60s‐90s。

5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述搅拌的温度控制为15℃～30℃；搅拌的时间控制为1h～2h。