CN110144376A - 纳米级胶原蛋白肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米级胶原蛋白肽及其制备方法，属于蛋白肽制备技术领域，包括以下步骤：(1)去除鱼鳞；(2)酶解制备胶原蛋白；(3)盐析；(4)酶解制备胶原蛋白肽；(5)超滤。本发明所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，可以得到分子量小且分子量均一的纳米级胶原蛋白肽，所述纳米级胶原肽可以抑制表皮细胞吸、沉积收黑色素，有效清除自由基，具有较强的抗氧化作用。
Description
技术领域
本发明属于蛋白肽制备技术领域，具体涉及一种纳米级胶原蛋白肽及其制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种由动物细胞表达的天然生物高分子，作为细胞外基质的主要成分几乎存在于所有组织，约占哺乳动物体内总蛋白的在皮肤、跟腱、软骨和其它结缔组织中含量较高，在动物真皮层，胶原蛋白含量超过在其它组织中胶原蛋白起着支持、连接的作用并影响动物细胞的形状。动物成纤维细胞表达后的胶原称为原胶原，原胶原在生物酶的催化作用下去除端肽后形成胶原蛋白。胶原蛋白热变性后形成的分子量不均一的多肽混合物称为明胶，胶原蛋白直接经过化学和酶法降解后的多肽也称为胶原蛋白肽。
申请号为201110007964.5的发明公开了一种小分子鱼鳞胶原蛋白肽的制备工艺，属于生物提取技术领域，包括如下步骤：(1)预处理鱼鳞，除掉鱼鳞的表面杂质和脂肪；(2)高温硫酸提取法提取鱼鳞胶原蛋白肽，提取产率超过95％；(3)离心机分离协同膜分离的工艺技术纯化提取液，得到纯度大于90％的大分子鱼鳞胶原蛋白肽；(4)蛋白酶酶解大分子鱼鳞胶原蛋白肽，酶解结束后灭酶，得到纯度大于90％、相对分子质量小于1.5kD的小分子鱼鳞胶原蛋白肽溶液；(5)喷雾干燥快速干燥蛋白肽溶液，得到小分子鱼鳞胶原蛋白肽粉成品。该工艺需要采用硫酸等腐蚀性强的化学品。
发明内容
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
针对现有技术中存在的上述不足，本发明所要解决的技术问题之一是纳米级胶原蛋白肽的制备方法，酶解法制备，安全环保，得到分子量小且分子量均一的纳米级胶原蛋白肽。
本发明提供一种纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞；
(2)酶解制备胶原蛋白；
(3)盐析；
(4)酶解制备胶原蛋白肽；
(5)超滤。
具体地，本发明所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)酶解制备胶原蛋白：将步骤(1)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.2-0.5mol/L的乙酸水溶液以固液比1：(20-30)(g/L)混合均匀，按照25-30U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300-400转/分钟的转速搅拌反应20-28小时；反应结束后，将反应液以9000-12000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；
(3)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9-2mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(2)中的乙酸水溶液体积比为1：(1-1.2)，以200-300转/分钟的转速搅拌12-24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为8-10ku的透析袋中透析34-72小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(4)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为4-5％的胶原蛋白水溶液，按照4-6U/mg的添加量加入蛋白酶(即每mg胶原蛋白水溶液加4-6U蛋白酶)，于pH8-11、温度37-50℃的条件下酶解4-8小时，得到酶解反应液；
(5)超滤：将步骤(4)得到的酶解反应液采用截流分子量为1-3ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时。
作为本发明的一个改进的技术方案，所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1-0.2mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积3-5倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.2-0.9mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氯化钠水溶液体积2-3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10-15％的乙醚水溶液以固液比1：(3-4)(g/mL)浸泡40-48小时，用乙醚水溶液体积5-10倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.2-0.5mol/L的乙酸水溶液以固液比1：(20-30)(g/L)混合均匀，按照25-30U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300-400转/分钟的转速搅拌反应20-28小时；反应结束后，将反应液以9000-12000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9-2mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：(1-1.2)，以200-300转/分钟的转速搅拌12-24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为8-10ku的透析袋中透析34-72小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为4-5％的胶原蛋白水溶液，按照4-6U/mg的添加量加入蛋白酶，于pH8-11、温度37-50℃的条件下酶解4-8小时，得到酶解反应液；
(6)超滤：将步骤(5)得到的酶解反应液采用截流分子量为1-3ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时。
通过添加预处理的工艺步骤，去除鱼皮中残留的脂肪、灰分等杂质，提高胶原蛋白的提取率，同时改善胶原蛋白的纯度，这为采用胶原蛋白酶解制备胶原蛋白肽提供基础。
作为本发明的一个改进的技术方案，所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1-0.2mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积3-5倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.2-0.9mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氯化钠水溶液体积2-3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10-15％的乙醚水溶液以固液比1：(3-4)(g/mL)浸泡40-48小时，用乙醚水溶液体积5-10倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.2-0.5mol/L的乙酸水溶液以固液比1：(20-30)(g/L)混合均匀，按照25-30U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300-400转/分钟的转速搅拌反应20-28小时；反应结束后，将反应液以9000-12000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9-2mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：(1-1.2)，以200-300转/分钟的转速搅拌12-24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为8-10ku的透析袋中透析34-72小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为4-5％的胶原蛋白水溶液，按照4-6U/mg的添加量加入蛋白酶，于pH8-11、温度37-50℃的条件下进行酶解4-8小时；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1-3ku，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时。
在传统的胶原蛋白酶解制备胶原蛋白肽的过程中，胶原蛋白降解后释放出的多肽仍然存在于溶液中，这些多肽会继续被酶解。由于多肽的扩散速率受分子量影响，分子量低的多肽其扩散速率快，导致这些多肽与酶发生相互作用的几率高于多肽链，导致酶解过程不均一，产生的多肽分子量范围宽且难以控制。本发明对酶解过程进行可控性操作，酶解过程中释放出的多肽，低于膜解离分子量的多肽被过滤出，而分子量超过膜解截留分子量的多肽继续进行反应，直至释放出的多肽被过滤出。通过这种方法，得到分子量小且分子量分布均匀的胶原蛋白肽。由于分子量低的蛋白酶在酶解的过程中可能被滤出，因此可以考虑将蛋白酶进行固定化。
作为本发明的一个改进的技术方案，所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1-0.2mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积3-5倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.2-0.9mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氯化钠水溶液体积2-3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10-15％的乙醚水溶液以固液比1：(3-4)(g/mL)浸泡40-48小时，用乙醚水溶液体积5-10倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.2-0.5mol/L的乙酸水溶液以固液比1：(20-30)(g/L)混合均匀，按照25-30U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300-400转/分钟的转速搅拌反应20-28小时；反应结束后，将反应液以9000-12000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9-2mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：(1-1.2)，以200-300转/分钟的转速搅拌12-24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为8-10ku的透析袋中透析34-72小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为4-5％的胶原蛋白水溶液，按照4-6U/mg的添加量加入蛋白酶，于pH8-11、温度37-50℃的条件下进行酶解4-8小时；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1-3ku，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，得到胶原蛋白肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(7)配制质量分数为5-10％的胶原蛋白肽水溶液，加入胶原蛋白肽重量3-4％的包埋剂，于60-70℃以200-300转/分钟的转速搅拌反应40-60分钟，采用200-300目滤布过滤，收集滤液；将滤液稀释3-4倍后，采用截流分子量为1-3ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时。
所述包埋剂为β-环糊精、麦芽糊精、羧甲基纤维素、阿拉伯胶中的一种或几种的混合物。优选地，所述包埋剂为麦芽糊精和β-环糊精以质量比(1.6-1.8)：1混合而成的混合物。
酶解制备胶原蛋白多肽过程中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、固定化胰蛋白酶中的一种。
本发明所要解决的技术问题之二是纳米级胶原蛋白肽。
本发明所述纳米级胶原蛋白肽，采用上述任一种所述的纳米级胶原蛋白肽的制备方法制备而成。
本发明所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，可以得到分子量小且分子量均一的纳米级胶原蛋白肽，所述纳米级胶原肽可以抑制表皮细胞吸、沉积收黑色素，有效清除自由基，具有较强的抗氧化作用。
具体实施方式
实施例中各原料介绍：
实施例中提取胶原蛋白肽的鱼品种为罗非鱼。
胃蛋白酶，购自郑州亿之源化工产品有限公司，酶活力为20万U/g。
碱性蛋白酶，具体采用南宁东恒华道生物科技有限责任公司提供的型号为2709的碱性蛋白酶，是由地衣芽胞杆菌经发酵提炼而成的蛋白水解酶，主要成分为地衣芽胞杆菌蛋白酶，酶活力为20U/g。
胰蛋白酶，购自河北百味生物科技有限公司，酶活力为20万U/g。
β-环糊精，CAS号：68168-23-0，食品级，购自阿法埃莎(中国)化学有限公司。
麦芽糊精，CAS号：9050-36-6，食品级，购自上海泽叶生物科技有限公司。
固定化胰蛋白酶的制备参考《固定化胰蛋白酶的制备研究》(张黎明，袁永俊，食品与发酵科技，第45卷第2期)进行。
实施例1
所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)酶解制备胶原蛋白：将步骤(1)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.3mol/L的乙酸水溶液以固液比1：20(g/mL)混合均匀，按照25U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300转/分钟的转速搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液以9000转/分钟的转速离心20分钟，收集上清液；
(3)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(2)中的乙酸水溶液体积比为1：1.2，以300转/分钟的转速搅拌24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为10ku的透析袋中透析48小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(4)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，按照4U/mg的添加量加入碱性蛋白酶，于pH9.5、40℃的条件下酶解4小时，得到酶解反应液；
(5)超滤：将步骤(4)得到的酶解反应液采用截流分子量为1ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时。
实施例2
所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积4倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氯化钠水溶液体积3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10％的乙醚水溶液以固液比1：3(g/mL)浸泡40小时，用乙醚水溶液体积8倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.3mol/L的乙酸水溶液以固液比1：20(g/mL)混合均匀，按照25U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300转/分钟的转速搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液以9000转/分钟的转速离心20分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：1.2，以300转/分钟的转速搅拌24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为10ku的透析袋中透析48小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，按照4U/mg的添加量加入碱性蛋白酶，于pH9.5、40℃的条件下酶解4小时，得到酶解反应液；
(6)超滤：将步骤(5)得到的酶解反应液采用截流分子量为1ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时。
实施例3
所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积4倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氯化钠水溶液体积3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10％的乙醚水溶液以固液比1：3(g/mL)浸泡40小时，用乙醚水溶液体积8倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.3mol/L的乙酸水溶液以固液比1：20(g/mL)混合均匀，按照25U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300转/分钟的转速搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液以9000转/分钟的转速离心20分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：1.2，以300转/分钟的转速搅拌24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为10ku的透析袋中透析48小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，按照4U/mg的添加量加入碱性蛋白酶，于pH9.5、40℃的条件下酶解4小时，得到酶解反应液；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1ku，分离压力为0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时。
实施例4
所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积4倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氯化钠水溶液体积3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10％的乙醚水溶液以固液比1：3(g/mL)浸泡40小时，用乙醚水溶液体积8倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.3mol/L的乙酸水溶液以固液比1：20(g/mL)混合均匀，按照25U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300转/分钟的转速搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液以9000转/分钟的转速离心20分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：1.2，以300转/分钟的转速搅拌24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为10ku的透析袋中透析48小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，按照4U/mg的添加量加入胰蛋白酶，于pH8.5、40℃的条件下酶解4小时，得到酶解反应液；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1ku，分离压力为0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时。
实施例5
所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积4倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氯化钠水溶液体积3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10％的乙醚水溶液以固液比1：3(g/mL)浸泡40小时，用乙醚水溶液体积8倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.3mol/L的乙酸水溶液以固液比1：20(g/mL)混合均匀，按照25U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300转/分钟的转速搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液以9000转/分钟的转速离心20分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：1.2，以300转/分钟的转速搅拌24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为10ku的透析袋中透析48小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，按照4U/mg的添加量加入固定化胰蛋白酶，于pH8、40℃的条件下酶解4小时，得到酶解反应液；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1ku，分离压力为0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时。
实施例6
所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积4倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氯化钠水溶液体积3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10％的乙醚水溶液以固液比1：3(g/mL)浸泡40小时，用乙醚水溶液体积8倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.3mol/L的乙酸水溶液以固液比1：20(g/mL)混合均匀，按照25U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300转/分钟的转速搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液以9000转/分钟的转速离心20分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：1.2，以300转/分钟的转速搅拌24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为10ku的透析袋中透析48小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，按照4U/mg的添加量加入固定化胰蛋白酶，于pH8、40℃的条件下酶解4小时，得到酶解反应液；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1ku，分离压力为0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，得到胶原蛋白肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(7)配制质量分数为5％的胶原蛋白肽水溶液，加入胶原蛋白肽重量3％的β-环糊精，于70℃以200转/分钟的转速搅拌反应60分钟，采用300目滤布过滤，收集滤液；将滤液稀释4倍后，采用截流分子量为1ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时。
实施例7
所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积4倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氯化钠水溶液体积3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10％的乙醚水溶液以固液比1：3(g/mL)浸泡40小时，用乙醚水溶液体积8倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.3mol/L的乙酸水溶液以固液比1：20(g/mL)混合均匀，按照25U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300转/分钟的转速搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液以9000转/分钟的转速离心20分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：1.2，以300转/分钟的转速搅拌24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为10ku的透析袋中透析48小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，按照4U/mg的添加量加入固定化胰蛋白酶，于pH8、40℃的条件下酶解4小时，得到酶解反应液；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1ku，分离压力为0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，得到胶原蛋白肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(7)配制质量分数为5％的胶原蛋白肽水溶液，加入胶原蛋白肽重量3％的麦芽糊精，于70℃以200转/分钟的转速搅拌反应60分钟，采用300目滤布过滤，收集滤液；将滤液稀释4倍后，采用截流分子量为1ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时。
实施例8
所述纳米级胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积4倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：7(g/mL)浸泡6小时，取出，用氯化钠水溶液体积3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10％的乙醚水溶液以固液比1：3(g/mL)浸泡40小时，用乙醚水溶液体积8倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.3mol/L的乙酸水溶液以固液比1：20(g/mL)混合均匀，按照25U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300转/分钟的转速搅拌反应24小时；反应结束后，将反应液以9000转/分钟的转速离心20分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：1.2，以300转/分钟的转速搅拌24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为10ku的透析袋中透析48小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为5％的胶原蛋白水溶液，按照4U/mg的添加量加入固定化胰蛋白酶，于pH8、40℃的条件下酶解4小时，得到酶解反应液；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1ku，分离压力为0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，得到胶原蛋白肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时；
(7)配制质量分数为5％的胶原蛋白肽水溶液，加入胶原蛋白肽重量3％的包埋剂，所述包埋剂为麦芽糊精和β-环糊精以质量比1.6：1混合而成的混合物，于70℃以200转/分钟的转速搅拌反应60分钟，采用300目滤布过滤，收集滤液；将滤液稀释4倍后，采用截流分子量为1ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30℃，预冻时间为2小时，升华温度为15℃，解析温度为30℃，真空度为0.09MPa，真空冷冻干燥时间为20小时。
测试例1
对实施例1-8的纳米级胶原蛋白肽减少黑色素效果进行测试，参考申请号为201610109586.4的专利进行。
分别将实施例1-8的纳米级胶原蛋白肽加适量DMSO溶解，使用细胞培养基稀释获得浓度100μg/mL的药液。
细胞培养：小鼠黑素瘤B16细胞经复苏后，接种于含10％胎牛血清的1640培养基中，37℃，5％CO2培养箱中培养，0.25％胰酶消化传代。取对数生长期的B16细胞，经胰酶消化后成细胞悬液后，加培养基稀释并接种于96孔板，每空1000个/100uL，培养24小时。弃去细胞培养液，加入不同种类的含药培养基，空白对照孔加入正常培养基，每种3个复孔。96孔板继续在培养箱中孵育72小时，弃去上清液，使用PBS清洗细胞3次。在各个孔中加入1mol/L氢氧化钠溶液，80℃水浴1小时，于M1000多功能连续波长酶标仪(瑞士Tecan公司)中490nm处测定各孔吸光度。
相对黑色素生成量＝[(药物孔吸光度平均值-氢氧化钠溶液吸光度平均值)/(空白孔吸光度平均值-氢氧化钠溶液吸光度平均值)]。
具体测试结果见表1。
表1：减少黑色素效果性能测试结果表
从表1可以看出，本发明所述纳米级胶原蛋白肽，能够通过抗氧化作用抑制黑色素的生成，预防表皮细胞黑色素的沉积以及色斑的生成。
测试例2
对实施例1-8的纳米级胶原蛋白肽清除对羟基自由基(OH·)和清除超氧阴离子(O2-)的能力进行测定。其中，清除对羟基自由基(OH·)的能力参考《甘草有效成分分离及其对自由基清除能力》(王海宽，赵新淮，姜岩食品与机械，2000，(4):23-24)进行测定，清除超氧阴离子(O2-)的能力参考《超氧化物歧化酶模型化合物的合成，表征和活性测定》(苗志伟，周卫红，有机化学，1999,19:537-541)进行。
具体测试结果见表2。
表2：自由基清除率测试结果表
从表2可以看出，实施例6-8对纳米级胶原蛋白肽进行包埋，胶原蛋白肽清除自由基的能力不仅没有下降，反而得到提升，这是因为胶原蛋白肽中含有如2,4-二叔丁基苯酚的挥发性抗氧化成分，通过包埋可以缓解挥发性抗氧化成分的损失，提高抗氧化成分的缓释能力。
Claims (8)
1.纳米级胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞；
(2)酶解制备胶原蛋白；
(3)盐析；
(4)酶解制备胶原蛋白肽；
(5)超滤。
2.根据权利要求1所述的纳米级胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)酶解制备胶原蛋白：将步骤(1)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.2-0.5mol/L的乙酸水溶液以固液比1：(20-30)(g/L)混合均匀，按照25-30U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300-400转/分钟的转速搅拌反应20-28小时；反应结束后，将反应液以9000-12000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；
(3)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9-2mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(2)中的乙酸水溶液体积比为1：(1-1.2)，以200-300转/分钟的转速搅拌12-24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为8-10ku的透析袋中透析34-72小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(4)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为4-5％的胶原蛋白水溶液，按照4-6U/mg的添加量加入蛋白酶，于pH8-11、温度37-50℃的条件下酶解4-8小时，得到酶解反应液；
(5)超滤：将步骤(4)得到的酶解反应液采用截流分子量为1-3ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时。
3.根据权利要求1所述的纳米级胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1-0.2mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积3-5倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.2-0.9mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氯化钠水溶液体积2-3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10-15％的乙醚水溶液以固液比1：(3-4)(g/mL)浸泡40-48小时，用乙醚水溶液体积5-10倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.2-0.5mol/L的乙酸水溶液以固液比1：(20-30)(g/L)混合均匀，按照25-30U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300-400转/分钟的转速搅拌反应20-28小时；反应结束后，将反应液以9000-12000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9-2mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：(1-1.2)，以200-300转/分钟的转速搅拌12-24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为8-10ku的透析袋中透析34-72小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为4-5％的胶原蛋白水溶液，按照4-6U/mg的添加量加入蛋白酶，于pH8-11、温度37-50℃的条件下酶解4-8小时，得到酶解反应液；
(6)超滤：将步骤(5)得到的酶解反应液采用截流分子量为1-3ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时。
4.根据权利要求1所述的纳米级胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1-0.2mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积3-5倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.2-0.9mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氯化钠水溶液体积2-3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10-15％的乙醚水溶液以固液比1：(3-4)(g/mL)浸泡40-48小时，用乙醚水溶液体积5-10倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.2-0.5mol/L的乙酸水溶液以固液比1：(20-30)(g/L)混合均匀，按照25-30U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300-400转/分钟的转速搅拌反应20-28小时；反应结束后，将反应液以9000-12000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9-2mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：(1-1.2)，以200-300转/分钟的转速搅拌12-24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为8-10ku的透析袋中透析34-72小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为4-5％的胶原蛋白水溶液，按照4-6U/mg的添加量加入蛋白酶，于pH8-11、温度37-50℃的条件下进行酶解4-8小时；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1-3ku，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时。
5.根据权利要求2所述的纳米级胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)去除鱼鳞：去掉鱼皮上的鱗片，用流动的水冲洗干净，沥干；
(2)预处理：将沥干的鱼皮和摩尔浓度为0.1-0.2mol/L的氢氧化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氢氧化钠水溶液体积3-5倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用摩尔浓度为0.2-0.9mol/L的氯化钠水溶液以固液比1：(7-8)(g/mL)浸泡6-8小时，取出，用氯化钠水溶液体积2-3倍的去离子水洗涤，沥干；将鱼皮用质量分数为10-15％的乙醚水溶液以固液比1：(3-4)(g/mL)浸泡40-48小时，用乙醚水溶液体积5-10倍的去离子水洗涤，沥干；
(3)酶解制备胶原蛋白：将步骤(2)得到的鱼皮和摩尔浓度为0.2-0.5mol/L的乙酸水溶液以固液比1：(20-30)(g/L)混合均匀，按照25-30U/mg的添加量加入胃蛋白酶，以300-400转/分钟的转速搅拌反应20-28小时；反应结束后，将反应液以9000-12000转/分钟的转速离心15-25分钟，收集上清液；
(4)盐析：向上清液中加入摩尔浓度为0.9-2mol/L的氯化钠水溶液，氯化钠水溶液和步骤(3)中的乙酸水溶液体积比为1：(1-1.2)，以200-300转/分钟的转速搅拌12-24小时，得到混合液；将混合液采用截流分子量为8-10ku的透析袋中透析34-72小时，透析袋中有絮状物沉淀出现，收集絮状物，真空冷冻干燥，得到胶原蛋白；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(5)酶解制备胶原蛋白肽：配制质量分数为4-5％的胶原蛋白水溶液，按照4-6U/mg的添加量加入蛋白酶，于pH8-11、温度37-50℃的条件下进行酶解4-8小时；在酶解过程中将酶解反应液采用超滤膜过滤，所述超滤膜的截流分子量为1-3ku，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；同时将未透过超滤膜的酶解反应液继续进行酶解；
(6)干燥：将步骤(5)得到的透过液真空冷冻干燥，得到胶原蛋白肽；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时；
(7)配制质量分数为5-10％的胶原蛋白肽水溶液，加入胶原蛋白肽重量3-4％的包埋剂，于60-70℃以200-300转/分钟的转速搅拌反应40-60分钟，采用200-300目滤布过滤，收集滤液；将滤液稀释3-4倍后，采用截流分子量为1-3ku的超滤膜进行分离，分离压力为0.20-0.25MPa，收集透过液；将透过液真空冷冻干燥，即得；其中真空冷冻干燥的工艺条件为：预冻温度-30～-20℃，预冻时间为1-2小时，升华温度为15-20℃，解析温度为30-35℃，真空度为0.08-0.09MPa，真空冷冻干燥时间为16-20小时。
6.根据权利要求5所述的纳米级胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述包埋剂为β-环糊精、麦芽糊精、羧甲基纤维素、阿拉伯胶中的一种或几种的混合物。
7.根据权利要求2-5中任一项所述的纳米级胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于，酶解制备胶原蛋白多肽过程中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶、固定化胰蛋白酶中的一种。
8.纳米级胶原蛋白肽，其特征在于，采用权利要求1-7中任一种所述的纳米级胶原蛋白肽的制备方法制备而成。
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