CN113698472B - 一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法以及鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂 - Google Patents

一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法以及鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，它是以鱼皮为原料，包括：鱼皮预处理、胃蛋白酶提取胶原蛋白、调节等电点、双水相萃取纯化胶原蛋白、碱性蛋白酶酶解成胶原蛋白肽、葡聚糖凝胶分离小分子鱼皮胶原蛋白肽。本发明制得的鱼皮胶原蛋白肽分子量小，纯度高，且无色无味，比大分子多肽更利于人体吸收。本发明还公开了一种鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，它是由包括以下重量份数的原料制成的：30～55份鱼皮胶原蛋白肽、0.05～30份透明质酸钠、0.02～10份尼泊金类防腐剂、0.02～5份抗氧化剂、0.02～15份非离子型表面活性剂、0.02～5份十二烷基甲基亚砜、0.02～15份甘油和250～350份水。

Description

一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法以及鱼皮胶原 蛋白肽喷雾剂
技术领域
本发明属于鱼类副产品加工提高附加值技术领域，涉及一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，具体涉及到鱼皮预处理、胃蛋白酶提取胶原蛋白、调节等电点、双水相萃取纯化胶原蛋白、碱性蛋白酶酶解成胶原蛋白肽、葡聚糖凝胶分离小分子鱼皮胶原蛋白肽；本发明还涉及一种鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，由小分子鱼皮胶原蛋白肽制成外用美容修复喷雾剂制成外用喷雾剂后分散均匀，容易经皮肤吸收，适用于各种美容修复、保健产品。
背景技术
胶原蛋白为大分子的纤维性硬蛋白，相对分子量高达30万道尔顿，吸收率非常低，仅有2.5％左右。胶原蛋白经人体食用后不能直接吸收，需要经过消化分解为小分子多肽或者游离的氨基酸后才能被人体吸收，且有证据表明胶原蛋白中超过63.4％的氨基酸残基以肽的形式被吸收进而发挥功效[1]，说明人体服用胶原蛋白主要以胶原蛋白多肽的形式吸收。
胶原蛋白多肽相对分子质量为几百至几千，食用后能够被人体有效的吸收利用，利用率可达到90％以上。国内外有大量文献表明鱼皮胶原蛋白肽经口服可以发挥疗效，也有大量的相关产品在售，但国内把胶原蛋白肽制成外用制剂发挥疗效的技术还不成熟，相关研究也很少，主要是还不能很好地掌握胶原蛋白肽制成各种外用制剂的辅料的选择和用量，研究起点也比国外晚很多，工艺还不成熟。
参考文献：
[1]Wang L,Wang Q,Qian J,Liang Q,Wang Z,Xu J,He S,Ma H.Bioavailabilityand bioavailable forms of collagen after oral administration to rats.J AgricFood Chem.2015 Apr 15；63(14):3752-3756.
发明内容
为了解决上述现有技术方法中存在的不足，本发明的目的是提供一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，以及以该鱼皮胶原蛋白肽制成的喷雾剂，该喷雾剂主要用于修复老化皮肤，补充皮肤水分和胶原蛋白。
本发明的目的是通过下述技术方案来实现的：
一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)、鱼皮处理：用清水将鱼皮清洗干净，剪成小块，沥干；
步骤(2)、脱脂、脱色、除杂蛋白：将沥干的鱼皮和浓度为0.1M氢氧化钠溶液按照料液比1:10～1:20(g/mL或kg/L)混合，加入质量分数为30％的双氧水，进行脱脂、脱色，每6小时更换一次溶液，更换3～6次，水洗至鱼皮中性；将鱼皮和质量分数为2％的氯化钠溶液按照料液比1:10～1:20(g/mL或kg/L)混合以除杂蛋白，每6小时更换一次溶液，更换3～6次；再将鱼皮和无水乙醇按照料液比1:10～1:20(g/mL或kg/L)混合搅拌6小时以除去残留的脂肪，水洗至鱼皮无醇味，沥干；
步骤(3)、酶提取：按照料液比1:10～1:20(g/mL或kg/L)将鱼皮加入浓度为1.0M的柠檬酸溶液，冰浴超声振荡，再加入鱼皮原料重量2％～4％的胃蛋白酶，在4～10℃下搅拌提取24～72小时，过滤除去鱼皮残渣，离心，得到上清液；
步骤(4)、调等电点沉淀胶原蛋白：用8M的氢氧化钠溶液调节上清液的pH为7，静置，待出现沉淀，离心，弃去上清液，得到蛋白沉淀；
步骤(5)、双水相萃取法纯化蛋白：按照固液比(指原料鱼皮和双水相萃取体系的质量体积比)1:10～1:20(g/mL或kg/L)将蛋白沉淀加入(NH4)2SO4和聚乙二醇6000的双水相萃取体系中，搅拌均匀，在常温下振荡反应1h～3h，静置，分相，弃去沉淀，取上相萃取液；
步骤(6)、透析、冷冻干燥：将萃取液透析3～4天，每隔6小时换一次透析液，冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白粉末；
步骤(7)、酶解：用超纯水将鱼皮胶原蛋白粉末配成溶液，调节pH为9～11，加入碱性蛋白酶酶解；
步骤(8)、分离、冷冻干燥：经过酶解的胶原蛋白肽溶液采用装填葡聚糖凝胶G-10的葡聚糖凝胶层析柱分离纯化，得到<700Da的蛋白肽溶液，冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白肽粉末。
所述的鱼皮为海鱼的鱼皮，所述的海鱼为新鲜三文鱼、金枪鱼、黄鱼、带鱼、鲶鱼、鳕鱼、马面鱼、鱿鱼。
步骤(1)中，鱼皮剪成0.5cm×0.5cm的小块。
步骤(2)中，所述的双氧水和氢氧化钠溶液的体积比为1:100。
所述的脱脂、脱色在4～6℃下搅拌进行。脱脂、脱色后用水将鱼皮水洗至中性。
所述的除杂蛋白在4～6℃下搅拌进行。
所述的无水乙醇预冷至在4～6℃，在4～6℃下去残留的脂肪；用于洗涤的水预冷至4～6℃。
步骤(2)中，所述的水为超纯水。
步骤(3)中，超声振荡的功率为100W，时间为15～20min。
所述的离心的转速为2900～3510r/min，离心的时间为15～20min。
步骤(4)中，所述的离心的转速为2900～3510r/min，离心的时间为15～20min。
步骤(5)中，所述的双水相萃取体系为质量分数为14％～16％的(NH4)2SO4和质量分数为10％～14％的聚乙二醇6000的混合溶液。
步骤(6)中，透析采用截留分子量为10000Da的透析袋。所述的透析液为超纯水或0.5M乙酸溶液。
所述的冷冻干燥的温度为-50℃～-20℃。
步骤(7)中，用超纯水将鱼皮胶原蛋白粉末配成质量分数为2.5％的溶液。
加酶量为200000U/g(每1g鱼皮胶原蛋白粉末对应200000U碱性蛋白酶)，酶解温度为45～55℃，酶解时间为2～4小时。
所述的碱性蛋白酶为市售产品，通过枯草杆菌深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶。
本发明的另一个目的是提供一种鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，它是由包括以下重量份数的原料制成的：30～55份鱼皮胶原蛋白肽、0.05～30份透明质酸钠、0.02～10份尼泊金类防腐剂、0.02～5份抗氧化剂、0.02～15份非离子型表面活性剂、0.02～5份十二烷基甲基亚砜、0.02～15份甘油和250～350份水。
优选的，所述的鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂是由包括以下重量份数的原料制成的：30～45份鱼皮胶原蛋白肽、0.5～30份透明质酸钠、0.3～10份尼泊金类防腐剂、0.1～0.2份抗氧化剂、0.1～0.2份非离子型表面活性剂、0.1～2份十二烷基甲基亚砜、3～15份甘油和280～340份水。
所述的尼泊金类防腐剂为对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯中的至少一种，为更好地发挥疗效，优选为对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯重量比为1:1的组合；尼泊金类防腐剂的防腐效果不随pH值变化而变化，当喷雾剂中添加一些pH偏高或偏低的成分时也能发挥良好的防腐作用，且对皮肤黏膜没什么刺激性；而市面上经常使用的苯甲酸、山梨酸等酸性防腐剂会使人体内的酸碱平衡被打破。
所述的抗氧化剂为抗坏血酸，抗坏血酸即维生素C，具有强大的抗氧化作用，也不会对人体存在有害影响。
所述的非离子型表面活性剂为聚山梨酯，优选聚山梨酯20。聚山梨酯20亲水性好，被乳化后的油酯偏向水性，较为温和，比较适合用于喷雾剂中，使喷出液体分散均匀。
所述的十二烷基甲基亚砜、甘油作为透皮吸收剂；十二烷基甲基亚砜具有较强的渗透促进作用，甘油除了起到透皮吸收的作用，还对皮肤具有保湿滋润的功能，两者结合效果最优。
本发明的另一个目的是提供一种所述的鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂的制备方法，考虑到若将所有原料混合则不易溶于水，因此分别将鱼皮胶原蛋白肽、透明质酸钠、十二烷基甲基亚砜、抗坏血酸、聚山梨酯分别溶于水配制成溶液，将尼泊金类防腐剂溶于甘油中，再将上述溶液混合得到喷雾剂。
具体的，包括以下步骤：
步骤(a)、将透明质酸钠、十二烷基甲基亚砜、抗坏血酸、非离子型表面活性剂分别溶于占超纯水总量1/5～1/4的超纯水中，搅拌溶解，得到透明质酸钠溶液、十二烷基甲基亚砜溶液、抗坏血酸溶液、非离子型表面活性剂溶液；将余量超纯水加热至35～40℃，加入鱼皮胶原蛋白肽，搅拌使其溶解，得到鱼皮胶原蛋白肽溶液；
步骤(b)、甘油水浴加热至沸，加入尼泊金类防腐剂，搅拌至溶解；
步骤(g)、取上述溶液，混合，滤过后分装至喷雾装置中，即得鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂。
本发明所述的鱼胶原蛋白肽喷雾剂无色无味、易于透皮吸收，适用于各种美容修复、保健产品。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)、本发明在低温下提取胶原蛋白，避免了鱼皮胶原蛋白失活变性的问题。
(2)、本发明在氢氧化钠溶液脱脂时同时加入过氧化氢溶液以脱干净色素，得到无色产物，省略了后续活性炭脱色以及过滤除去活性炭的步骤。
(3)、相比采用乙酸作为酶提取胶原蛋白的溶剂，本发明以柠檬酸溶液作为胃蛋白酶提取胶原蛋白的溶剂，具有腐蚀性小、无刺激性味道的优点，同时在酶提取前先超声振荡15～20min有利于使鱼皮的结构松散，使酶提取更加充分。
(4)、大多数蛋白质的等电点都很接近，单纯通过调节等电点纯化蛋白，得到的产品混有其他大分子杂蛋白，使得产品纯度降低；而本发明采取调节等电点联合双水相萃取技术纯化蛋白，使得产品与残留大分子杂蛋白分离，提高纯度；双水相萃取法操作简单，设备资金投入少、在常温下即能发挥良好的分离作用，不存在有机溶剂残留的问题。
(4)、本发明用葡聚糖凝胶层析柱分离出<700Da的小分子肽，该肽分子量小，纯度高，且无色无味，比大分子多肽更利于人体吸收。
(5)、透明质酸钠是人体皮肤的构成之一，是人体内分布最广的一种酸性黏糖，存在于结缔组织的基质中，具有良好的保湿作用，在鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂中加入透明质酸钠增加了产品的补水作用。
(6)、以往口服胶原蛋白肽制剂还要通过消化道的吸收，再分布到特定区域发挥作用，时间较长，常常达不到美容效果。本发明将胶原蛋白肽制成外用喷雾剂，直接经皮肤吸收发挥疗效，大大加快了局部吸收速度。
附图说明
图1为实施例1制得的鱼皮胶原蛋白肽对修复光老化皮肤的影响；其中，皮肤重量(A)，羟脯氨酸含量(B)，皮肤水分含量(C)，透明质酸含量(D)的变化；数据以均值±SD表示；与模型组(M)相比，*p<0.05表示显著性差异；与正常组(N)相比，#p>0.05表示无显著性差异。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，是由以下方法制得的，步骤如下：
步骤(1)、鱼皮处理：取三文鱼皮，先用清水清洗干净，再把鱼皮剪成0.5cm×0.5cm的小块，放于通风橱内沥干；
步骤(2)、脱脂、除杂蛋白、脱色：称取80g沥干的鱼皮，加入1600mL浓度为0.1M的氢氧化钠溶液，同时加入16mL质量分数为30％的双氧水，在4℃下搅拌，由氢氧化钠对鱼皮进行脱脂，由双氧水对鱼皮脱色，每6小时更换一次溶液，共24小时，脱脂脱色后，鱼皮用超纯水洗至中性；再加入1600mL质量分数2％的氯化钠溶液，在4℃下搅拌除杂蛋白，每6小时更换一次溶液，共24小时；用纱布过滤后加入1600mL无水乙醇(在冰箱中预冷至4℃)，在4℃搅拌6小时，用超纯水(在冰箱中预冷至4℃)将鱼皮洗至无醇味，沥干；
步骤(3)、酶提取：将沥干的鱼皮加入1600mL 1.0M的柠檬酸溶液中，100W冰浴超声振荡20min，加入1.6g胃蛋白酶，在4℃下搅拌提取48小时，用纱布过滤掉剩余鱼皮残渣，再在3510r/min下离心20min，得到上清液；
步骤(4)、调等电点去除可溶性蛋白：用8M的氢氧化钠溶液调节上清液的pH为7.0，静置24小时，离心，弃去上清液，取蛋白沉淀；对蛋白沉淀进行纯度检测，根据检测到的羟脯氨酸含量换算成胶原蛋白肽含量，纯度为87.5％；
步骤(5)、双水相萃取法纯化蛋白：将蛋白沉淀加入800mL质量分数为16％的(NH4)2SO4和质量分数为14％的聚乙二醇6000的双水相萃取体系中，搅拌均匀，在常温下振荡反应1h，静置，分相，弃去沉淀，取上相萃取液；
步骤(6)、透析、冷冻干燥：采用截留分子量为10000Da的透析袋，萃取液用超纯水透析三天，每隔6小时换一次透析液；-50℃冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白粉末48g；
步骤(7)、酶解：鱼皮胶原蛋白粉末用超纯水配成质量分数为2.5％的溶液，调节pH为9，以碱性蛋白酶酶解，加酶量为200000U/g，保持酶解温度在50℃，酶解4小时；
步骤(8)、分离、冷冻干燥：酶解得到的胶原蛋白肽溶液经过葡聚糖凝胶层析柱(填料：葡聚糖凝胶G-10)，洗脱液为超纯水，分离得到<700Da的蛋白肽溶液，-50℃冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白肽粉末(见表1)32g；根据检测到的羟脯氨酸含量换算成胶原蛋白肽含量，胶原蛋白肽的纯度为98.20％；
步骤(9)、将30g透明质酸钠溶于66mL超纯水中，搅拌7分钟，使其完全溶解，备用；
步骤(10)、3g甘油水浴加热至沸，加入0.18g对羟基苯甲酸丙酯和0.18g对羟基苯甲酸丁酯，搅拌7分钟，使其溶解，备用；
步骤(11)、将0.1g十二烷基甲基亚砜溶于66mL超纯水中，搅拌7分钟，使其完全溶解，备用；
步骤(12)、66mL超纯水在水浴中加热至35℃，加入32g步骤(1)-步骤(9)制得的鱼皮胶原蛋白肽粉末，搅拌7分钟，使其溶解，备用；
步骤(13)、将0.1g抗坏血酸溶于66mL超纯水中，搅拌使其溶解，备用；
步骤(14)、将0.1g聚山梨酯20溶于66mL超纯水中，搅拌，使其溶解，备用；
步骤(15)、取步骤(9)-(14)的溶液，混合，滤过后分别分装至20mL喷雾装置中，即得鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，标示含量为48.50％。
表1.实施例1制得的鱼皮胶原蛋白肽粉分析检测结果
检测项目 检测方法 检测结果
色泽 GB 31645-2018 符合
滋味、气味 GB 31645-2018 符合
状态 GB 31645-2018 符合
相对分子质量<700的胶原蛋白肽比例 GB31645-2018附录A 98.20％
羟脯氨酸含量 GB/T 9695.23-2008 10.07％
总氮 GB 5009.5-2016 16.96％
水分 GB 5009.3第一法 3.60％
灰分 GB 5009.4第一法 0.55％
为验证喷雾制剂理化性质分散均匀，采取中国药典2015版第三部通则0112测本实施例鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂的每瓶主药含量。取1瓶本实施例制得的鱼皮胶原蛋白肽喷雾，弃去前5次喷射药液，用超纯水洗净喷口，充分干燥后，喷射10次(两次喷射间隔5秒并缓缓振摇，使每次充满一喷)，收集于5mL超纯水中，用羟脯氨酸试剂盒测定羟脯氨酸含量，所得结果除以10，再换算成胶原蛋白肽含量，即为平均每喷主药含量，平均每喷主药含量＝羟脯氨酸含量/10×转换系数9.75。每喷主药含量应为标示含量的80％～120％。
经检测，每喷主药含量＝48.30％/10×9.75＝47.09％，与标示含量48.50％比较，在国家标准范围之内，表明鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂主药在溶液中分散均匀。
对比例1
取实施例1步骤(7)酶解得到的胶原蛋白肽溶液，经过葡聚糖凝胶层析柱(填料：葡聚糖凝胶G-15)，洗脱液为超纯水，分离得到<1500Da的蛋白肽溶液，-50℃冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白肽粉末。
实施例2
一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，是由以下方法制得的，步骤如下：
步骤(1)、鱼皮处理：取金枪鱼皮，先用清水清洗干净，再把鱼皮剪成0.5cm×0.5cm的小块，放于通风橱内沥干；
步骤(2)、脱脂、除杂蛋白、脱色：称取100g沥干的鱼皮，加入2000mL 0.1M氢氧化钠溶液脱脂，同时加入20mL 30％双氧水脱色，在6℃下搅拌，每6小时更换一次溶液，共48小时；脱脂脱色后，鱼皮用超纯水洗至中性；加入2000mL质量分数2％的氯化钠溶液，在6℃下搅拌除杂蛋白，每6小时更换一次溶液，共48小时；用纱布过滤后加入2000mL无水乙醇(在冰箱中预冷至4℃)，在4℃搅拌6小时，用超纯水(在冰箱中预冷至4℃)将鱼皮洗至无醇味，沥干；
步骤(3)、酶提取：将沥干的鱼皮加入2000mL 1.0M的柠檬酸溶液中，100W冰浴超声振荡18min，之后加入2g胃蛋白酶，在4℃下搅拌提取72小时，用纱布过滤掉剩余鱼皮残渣，再在3500r/min下离心15min，得到上清液；
步骤(4)、调等电点去除可溶性蛋白：用8M的氢氧化钠溶液调节上清液的pH为7.0，静置24小时，离心，弃去上清液，取蛋白沉淀；对蛋白沉淀进行纯度检测，根据检测到的羟脯氨酸含量换算成胶原蛋白肽含量，纯度为87.2％。
步骤(5)、双水相萃取法纯化蛋白：将蛋白沉淀加入1000mL质量分数为15％的(NH4)2SO4和质量分数为13％的聚乙二醇6000的双水相萃取体系中，搅拌均匀，在常温下振荡反应1h，静置，分相，弃去沉淀，取上相萃取液；
步骤(6)、透析、冷冻干燥：采用截留分子量为10000Da的透析袋，萃取液用超纯水透析三天，每隔6小时换一次透析液，-50℃冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白粉末60g；
步骤(7)、酶解：冻干的鱼皮胶原蛋白粉末用超纯水配成质量分数为2.5％的溶液，调节pH为11，以碱性蛋白酶酶解，加酶量为200000U/g，保持酶解温度在45℃，酶解4小时；
步骤(8)、分离、冷冻干燥：酶解得到的胶原蛋白肽溶液经过葡聚糖凝胶层析柱(填料：葡聚糖凝胶G-10)分离纯化，分离得到<700Da的蛋白肽溶液，-50℃冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白肽粉末(见表2)45g；根据检测到的羟脯氨酸含量换算成胶原蛋白肽含量，胶原蛋白肽的纯度为98.30％；
步骤(9)、将10g透明质酸钠溶于65.5mL超纯水中，搅拌6分钟，使其完全溶解，备用；
步骤(10)、将10g甘油在水浴中至沸后，加入2g对羟基苯甲酸丙酯与2g对羟基苯甲酸丁酯，搅拌6分钟，使其溶解，备用；
步骤(11)、将1g十二烷基甲基亚砜溶于65.5mL超纯水中，搅拌6分钟，使其完全溶解，备用；
步骤(12)、将65.5mL超纯水在水浴中加热至37℃，加入45g步骤(1)-步骤(9)制得的鱼皮胶原蛋白肽粉末，搅拌6分钟，使其溶解，备用；
步骤(13)、将0.125g抗坏血酸溶于65.5mL超纯水中，搅拌使其溶解，备用；
步骤(14)、将0.125g聚山梨酯20溶于66.5mL超纯水中，搅拌，使其溶解，备用；
步骤(15)、取步骤(9)-(14)的溶液，混合，滤过后分别分装至20mL喷雾装置中，即得鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，标示量为63.74％。
表2.实施例2制得的鱼皮胶原蛋白肽粉分析检测结果
检测项目 检测方法 检测结果
色泽 GB 31645-2018 符合
滋味、气味 GB 31645-2018 符合
状态 GB 31645-2018 符合
相对分子质量<700的胶原蛋白肽比例 GB31645-2018附录A 98.30％
羟脯氨酸含量 GB/T 9695.23-2008 10.08％
总氮 GB 5009.5-2016 16.98％
水分 GB 5009.3第一法 3.55％
灰分 GB 5009.4第一法 0.57％
实施例3
一种高纯度小分子鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，是由以下方法制得的，步骤如下：
步骤(1)、鱼皮处理：取鳕鱼鱼皮，先用清水清洗干净，再把鱼皮剪成0.5cm×0.5cm的小块，放于通风橱内沥干；
步骤(2)、脱脂、除杂蛋白、脱色：称取70g沥干的鱼皮，加入0.1M氢氧化钠溶液1400mL脱脂，同时加入14mL 30％双氧水脱色，在5℃下搅拌，每6小时更换一次溶液，共72小时；用水洗至中性，加入1400mL质量分数2％的氯化钠溶液，在5℃下搅拌除杂蛋白，每6小时更换一次溶液，共72小时；用纱布过滤后加入无水乙醇(在冰箱中预冷至4℃)1400mL，在4℃搅拌6小时，之后用超纯水(在冰箱中预冷至4℃)将鱼皮洗至无醇味，沥干；
步骤(3)、将沥干的鱼皮加入1400mL 1.0M的柠檬酸溶液中，100W冰浴超声振荡15min，之后加入1.4g胃蛋白酶，在5℃下搅拌提取72小时，用纱布过滤掉剩余鱼皮残渣，再在3510r/min下离心15min，得到上清液；
步骤(4)、调等电点去除可溶性蛋白：用8M氢氧化钠溶液调节上清液pH为7.0，静置24小时，离心，弃去上清液，取蛋白沉淀；对蛋白沉淀进行纯度检测，根据检测到的羟脯氨酸含量换算成胶原蛋白肽含量，纯度为87.4％。
步骤(5)、双水相萃取法纯化蛋白：将蛋白沉淀加入700mL质量分数为14％的(NH4)2SO4和质量分数为12％的聚乙二醇6000的双水相萃取体系中，搅拌均匀，在常温下振荡反应1h，静置，分相，弃去沉淀，取上相萃取液；
步骤(6)、透析、冷冻干燥：采用截留分子量为10000Da的透析袋，萃取液用超纯水透析4天，每隔6小时换一次透析液，-50℃冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白粉末42g；
步骤(7)、冻干的鱼皮胶原蛋白粉末用超纯水配成质量分数为2.5％的溶液，调节pH为10，以碱性蛋白酶酶解，加酶量为200000U/g，保持酶解温度在50℃，酶解3.5小时；
步骤(8)、分离、冷冻干燥：酶解得到的胶原蛋白肽溶液经过葡聚糖凝胶层析柱(填料：葡聚糖凝胶G-10)分离纯化，分离得到<700Da的蛋白肽溶液，-50℃冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白肽粉末(见表3)35g；根据检测到的羟脯氨酸含量换算成胶原蛋白肽含量，胶原蛋白肽的纯度为98.40％。
步骤(9)、将0.5g透明质酸钠溶于57mL超纯水中，搅拌8分钟，使其完全溶解，备用；
步骤(10)、15g甘油在水浴中至沸，加入5g对羟基苯甲酸丙酯与5g对羟基苯甲酸丁酯，搅拌8分钟，使其溶解，备用；
步骤(11)、将2g十二烷基甲基亚砜溶于57ml超纯水中，搅拌8分钟，使其完全溶解，备用；
步骤(12)、将57mL超纯水在水浴中加热至39℃后，加入35g步骤(1)-步骤(9)制得的鱼皮胶原蛋白肽粉末，搅拌8分钟，使其溶解，备用；
步骤(13)、将0.2g抗坏血酸溶于57ml超纯水中，搅拌使其溶解，备用。
步骤(14)、将0.2g聚山梨酯20溶于57mL超纯水中，搅拌，使其溶解，备用。
步骤(15)、取步骤(9)-(14)的溶液，混合，滤过后分别分装至20mL喷雾装置中，即得鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，标示量为55.36％。
表3.实施例3制得的鱼皮胶原蛋白肽粉分析检测结果
检测项目 检测方法 检测结果
色泽 GB 31645-2018 符合
滋味、气味 GB 31645-2018 符合
状态 GB 31645-2018 符合
相对分子质量<700的胶原蛋白肽比例 GB31645-2018附录A 98.40％
羟脯氨酸含量 GB/T 9695.23-2008 10.09％
总氮 GB 5009.5-2016 16.99％
水分 GB 5009.3第一法 3.64％
灰分 GB 5009.4第一法 0.59％
实施例4
24只5周龄雌性昆明小鼠(25±2g，SPF级)随机分为4组(每组6只)：正常组(记为N)、模型组(记为M)、<1500MW CH组(小于1500分子量胶原蛋白肽组，对比例1鱼皮胶原蛋白肽粉末)、<700MW CH(小于700分子量胶原蛋白肽组，实施例1鱼皮胶原蛋白肽粉末)，动物连续预防性给药一周，正常组、模型组给予0.4mL生理盐水，<1500MW CH组(200mg/kg)给予0.4mL<1500MW CH(用生理盐水配制)，<700MW CH组(200mg/kg)给予0.4mL<700MW CH(用生理盐水配制)。之后，除正常组外，其余三组均行紫外线照射，持续3d，每天3h。紫外灯由3盏UVA灯(40W，波长320-400nm)和1盏UVB灯(40W，波长290-320nm)组成，灯距小鼠背部的距离为30厘米。UVA照射总剂量为18.47J/cm2，UVB照射总剂量为2.01J/cm2。之后分别于紫外线照射后0、1、2周，每组处死2只，取标本进行皮肤重量、羟脯氨酸含量、皮肤水分含量、透明质酸含量的变化分析，结果见图1。
由图1可以看出，鱼皮胶原蛋白肽具有修复光老化皮肤的作用，且分子量较小(小于700分子量)的胶原蛋白肽更容易经皮肤吸收，修复光老化皮肤和补水效果都优于高分子量(小于1500分子量)胶原蛋白肽。
以上实例仅为本发明的较佳实施方式。并非用于限定本发明的保护范围，所以凡是秉承本发明的原则对上述步骤进行替换、简化，没有实质性的改变，都属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(1)、鱼皮处理：用清水将鱼皮清洗干净，剪成小块，沥干；
步骤(2)、脱脂、脱色、除杂蛋白：将沥干的鱼皮和浓度为0.1M氢氧化钠溶液按照料液比1:10～1:20混合，加入质量分数为30%的双氧水，所述的双氧水和氢氧化钠溶液的体积比为1:100，进行脱脂、脱色，每6小时更换一次溶液，更换3～6次，所述的脱脂、脱色在4～6℃下搅拌进行，脱脂、脱色后用水将鱼皮水洗至中性；将鱼皮和质量分数为2%的氯化钠溶液按照料液比1:10～1:20混合除杂蛋白，每6小时更换一次溶液，更换3～6次；再将鱼皮和无水乙醇按照料液比1:10～1:20混合搅拌6小时，水洗至鱼皮无醇味，沥干；
步骤(3)、酶提取：按照料液比1:10～1:20将鱼皮加入浓度为1.0M的柠檬酸溶液，冰浴超声振荡，再加入鱼皮原料重量2%～4%的胃蛋白酶，在4～10℃下搅拌提取24～72小时，过滤除去鱼皮残渣，离心，得到上清液；
步骤(4)、调等电点沉淀胶原蛋白：用8M的氢氧化钠溶液调节上清液的pH为7，静置，待出现沉淀，离心，得到蛋白沉淀；
步骤(5)、双水相萃取法纯化蛋白：按照固液比1:10～1:20将蛋白沉淀加入(NH4)2SO4和聚乙二醇6000的双水相萃取体系中，所述的双水相萃取体系为质量分数为14%～16%的(NH4)2SO4和质量分数为10%～14%的聚乙二醇6000的混合溶液，搅拌均匀，振荡反应1h～3h，静置，分相，取上相萃取液；
步骤(6)、透析、冷冻干燥：采用截留分子量为10000Da的透析袋，将萃取液透析3～4天，每隔6小时换一次透析液，冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白粉末；所述的透析液为超纯水或0.5M乙酸溶液；
步骤(7)、酶解：用超纯水将鱼皮胶原蛋白粉末水溶液，调节pH为9～11，加入碱性蛋白酶酶解，加酶量为200000U/g，酶解温度为45～55℃，酶解时间为2～4小时；
步骤(8)、分离、冷冻干燥：经过酶解的胶原蛋白肽溶液采用装填葡聚糖凝胶G-10的葡聚糖凝胶层析柱分离纯化，得到<700Da的蛋白肽溶液，冷冻干燥，得到无色鱼皮胶原蛋白肽粉末。
2.根据权利要求1所述的鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的除杂蛋白在4～6℃下搅拌进行；
所述的无水乙醇预冷至在4～6℃，在4～6℃下去残留的脂肪；用于洗涤的水预冷至4～6℃。
3.根据权利要求1所述的鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，超声振荡的功率为100W，时间为15～20min；
所述的离心的转速为2900～3510 r/min，离心的时间为15～20min;
步骤(4)中，所述的离心的转速为2900～3510r/min，离心的时间为15～20min。
4.根据权利要求1所述的鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，所述的冷冻干燥的温度为-50℃～-20℃。
5.根据权利要求1所述的鱼皮胶原蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤(7)中，用超纯水将鱼皮胶原蛋白粉末配成质量分数为2.5%的溶液。
6.一种鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，其特征在于：它是由包括以下重量份数的原料制成的：30～55份权利要求1制得的鱼皮胶原蛋白肽、0.05～30份透明质酸钠、0.02～10份尼泊金类防腐剂、0.02～5份抗氧化剂、0.02～15份非离子型表面活性剂、0.02～5份十二烷基甲基亚砜、0.02～15份甘油和250～350份水；其中，所述的非离子型表面活性剂为聚山梨酯20。
7.根据权利要求6所述的鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，其特征在于：它是由包括以下重量份数的原料制成的：30～45份鱼皮胶原蛋白肽、0.5～30份透明质酸钠、0.3～10份尼泊金类防腐剂、0.1～0.2份抗氧化剂、0.1～0.2份非离子型表面活性剂、0.1～2份十二烷基甲基亚砜、3～15份甘油和280～340份水。
8.根据权利要求6所述的鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，其特征在于：所述的尼泊金类防腐剂为对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯中的至少一种；
所述的抗氧化剂为抗坏血酸。
9.根据权利要求8所述的鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂，其特征在于：所述的尼泊金类防腐剂为对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯重量比为1:1的组合。
10.一种权利要求6所述的鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤(a)、将透明质酸钠、十二烷基甲基亚砜、抗坏血酸、非离子型表面活性剂分别溶于占超纯水总量1/5～1/4的超纯水中，搅拌溶解，得到透明质酸钠溶液、十二烷基甲基亚砜溶液、抗坏血酸溶液、非离子型表面活性剂溶液；将余量超纯水加热至35～40℃，加入鱼皮胶原蛋白肽，搅拌使其溶解，得到鱼皮胶原蛋白肽溶液；
步骤(b)、甘油水浴加热至沸，加入尼泊金类防腐剂，搅拌至溶解；
步骤(c)、取上述溶液，混合，滤过后分装至喷雾装置中，即得鱼皮胶原蛋白肽喷雾剂。
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