CN115746128A - 一种提高羟脯氨酸含量的鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于胶原蛋白提取领域，具体涉及一种提高羟脯氨酸含量的鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法。该方法通过以下步骤实现：首先鱼皮鱼鳞进行脱脂预处理：将淡水鱼的鱼皮鱼鳞清洗干净后，加入复合脱脂剂脱脂处理，水洗至中性；经碳酸氢钠浸泡处理后，再次加入浓度为5%的柠檬酸浸泡，然后进行分段加热提取，得到胶原蛋白原液；将胶原蛋白原液中首先加入改性壳聚糖颗粒，再次加入定量的维生素C，加入胰蛋白酶和风味蛋白酶，酶解，将酶解产物灭酶，离心分离，将上清液冷冻干燥，即可。本发明提供的制备方法，能够提高制备得到的胶原蛋白肽中的羟脯氨酸含量，且提取率高，制备得到的蛋白肽纯度高，无异杂味。
Description
技术领域
本发明属于胶原蛋白提取领域，具体涉及一种提高羟脯氨酸含量的鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法。
背景技术
研究发现，鱼皮中胶原蛋白含量较高，胶原蛋白中富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，其水解产物胶原蛋白肽在医疗、保健及美容等行业具有广阔的应用前景。
目前，我国的水产养殖和加工业迅猛发展，产生大量的鱼皮、鱼鳞等下脚料，其胶原蛋白含量较高。现有技术中，通过鱼皮鱼鳞提取胶原蛋白的方法通常有盐法、酸法、碱法、热法及酶解法。由于水产胶原蛋白氨基酸组成的特点，其热稳定性较差，且通常具有较多的挥发性呈味物质，而这些不良气味在一定程度上限制了鱼胶原蛋白的应用。现有的提取方法，制备得到的鱼皮鱼鳞胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸含量较低，与水形成氢键的能力小于如牛皮提取得到的胶原蛋白。因此，如何去除不良气味的同时，提高羟脯氨酸含量成为了亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种提高羟脯氨酸含量的鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种提高羟脯氨酸含量的鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
（1）鱼皮鱼鳞预处理：将淡水鱼的鱼皮鱼鳞清洗干净后，加入复合脱脂剂脱脂处理3-5h，水洗至中性；
（2）将水洗后的鱼皮鱼鳞，首先加入浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液浸泡40min，然后滴加浓度为2%的柠檬酸，搅拌均匀后静置30min，过滤，蒸馏水清洗；
（3）将清洗后的鱼皮鱼鳞搅碎，再次加入浓度为5%的柠檬酸，搅拌均匀后浸泡40min，然后进行分段加热提取，得到胶原蛋白原液；
（4）将胶原蛋白原液中首先加入改性壳聚糖颗粒，搅拌静置20min后，再次加入定量的维生素C，加入胰蛋白酶和风味蛋白酶，酶解8-10h，将酶解产物灭酶，离心分离，将上清液冷冻干燥，即可。
进一步的，步骤（1）中，所述复合脱脂剂是由10%正丁醇和壬基酚聚氧乙烯醚按照质量比50:1组成。
进一步的，步骤（2）中，所述鱼皮鱼鳞和碳酸氢钠溶液的料液比为1g:25-30mL；所述碳酸氢钠和柠檬酸的摩尔比为3：2。
进一步的，步骤（3）中，所述柠檬酸的加入量占鱼皮鱼鳞质量的5倍。
进一步的，步骤（3）中，所述分段加热提取的具体过程为：首先升温至45-55℃，振荡提取3h；然后升温至75-80℃，振荡提取2h。
进一步的，步骤（4）中，所述改性壳聚糖颗粒的加入量占胶原蛋白原液质量的5%。
进一步的，步骤（4）中，所述维生素C的加入量占胶原蛋白原液质量的0.2%；所述胰蛋白酶的酶比活力为8000～10000U/g；所述风味蛋白酶的酶比活力为45000～50000U/g。
本发明所使用的改性壳聚糖颗粒通过以下方法制备而成：将0.5g壳聚糖（脱乙酰化≥90%）溶于25-30mL 体积浓度为2%的醋酸水溶液中进行溶解，然后缓慢滴加0.8g正硅酸乙酯，搅拌均匀后，加入0.5mL的戊二醛进行交联反应1.5h，交联结束后，蒸馏水洗涤至中性，65℃干燥即可。
本发明的有益效果为：
（1）本发明提供的制备方法，能够提高制备得到的胶原蛋白肽中的羟脯氨酸含量，且提取率高，制备得到的蛋白肽纯度高；
（2）本发明制备得到的胶原蛋白肽，无异杂味，操作过程可控性强，制备得到的胶原蛋白肽活性好，具有广泛的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
本发明所使用的淡水鱼为罗非鱼。
实施例1
（1）鱼皮鱼鳞预处理：将淡水鱼的鱼皮鱼鳞清洗干净后，加入复合脱脂剂（10%正丁醇水溶液和壬基酚聚氧乙烯醚按照质量比50:1组成），搅拌脱脂处理（复合脱脂剂没过鱼皮鱼鳞即可）3h，水洗至中性；
（2）将水洗后的鱼皮鱼鳞，每g中加入30mL浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液浸泡40min，然后按照碳酸氢钠和柠檬酸的摩尔比3：2滴加浓度为2%的柠檬酸，搅拌均匀后静置30min，过滤，蒸馏水清洗；
（3）将清洗后的鱼皮鱼鳞搅碎，再次加入5倍质量的浓度为5%的柠檬酸水溶液，搅拌均匀后浸泡40min，首先升温至45-55℃，振荡提取3h；然后升温至75-80℃，振荡提取2h，得到胶原蛋白原液；
（4）将0.5g壳聚糖（脱乙酰化≥90%）溶于25-30mL 体积浓度为2%的醋酸水溶液中进行溶解，然后缓慢滴加0.8g正硅酸乙酯，搅拌均匀后，加入0.5mL的戊二醛进行交联反应1.5h，交联结束后，蒸馏水洗涤至中性，65℃干燥即可；
（5）将胶原蛋白原液中首先加入占其质量5%的改性壳聚糖颗粒，搅拌静置20min后，再次加入占胶原蛋白原液质量的0.2%维生素C，加入8500U/g的胰蛋白酶和50000U/g的风味蛋白酶，酶解8h，将酶解产物灭酶，离心分离，将上清液冷冻干燥，即可。
实施例2
（1）鱼皮鱼鳞预处理：将淡水鱼的鱼皮鱼鳞清洗干净后，加入复合脱脂剂（10%正丁醇水溶液和壬基酚聚氧乙烯醚按照质量比50:1组成），搅拌脱脂处理（复合脱脂剂没过鱼皮鱼鳞即可）3h，水洗至中性；
（2）将水洗后的鱼皮鱼鳞，每g中加入30mL浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液浸泡40min，然后按照碳酸氢钠和柠檬酸的摩尔比3：2滴加浓度为2%的柠檬酸，搅拌均匀后静置30min，过滤，蒸馏水清洗；
（3）将清洗后的鱼皮鱼鳞搅碎，再次加入5倍质量的浓度为5%的柠檬酸水溶液，搅拌均匀后浸泡40min，首先升温至45-55℃，振荡提取3h；然后升温至75-80℃，振荡提取2h，得到胶原蛋白原液；
（4）将0.5g壳聚糖（脱乙酰化≥90%）溶于25-30mL 体积浓度为2%的醋酸水溶液中进行溶解，然后缓慢滴加0.8g正硅酸乙酯，搅拌均匀后，加入0.5mL的戊二醛进行交联反应1.5h，交联结束后，蒸馏水洗涤至中性，65℃干燥即可；
（5）将胶原蛋白原液中首先加入占其质量5%的改性壳聚糖颗粒，搅拌静置20min后，再次加入占胶原蛋白原液质量的0.2%维生素C，加入10000U/g的胰蛋白酶和45000U/g的风味蛋白酶，酶解8h，将酶解产物灭酶，离心分离，将上清液冷冻干燥，即可。
对比例1
（1）鱼皮鱼鳞预处理：将淡水鱼的鱼皮鱼鳞清洗干净后，加入复合脱脂剂（10%正丁醇水溶液和壬基酚聚氧乙烯醚按照质量比50:1组成），搅拌脱脂处理（复合脱脂剂没过鱼皮鱼鳞即可）3h，水洗至中性；
（2）将水洗后的鱼皮鱼鳞，每g中加入30mL浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液浸泡40min，然后按照碳酸氢钠和柠檬酸的摩尔比3：2滴加浓度为2%的柠檬酸，搅拌均匀后静置30min，过滤，蒸馏水清洗；
（3）将清洗后的鱼皮鱼鳞搅碎，再次加入5倍质量的浓度为5%的柠檬酸水溶液，搅拌均匀后浸泡40min，首先升温至45-55℃，振荡提取3h；然后升温至75-80℃，振荡提取2h，得到胶原蛋白原液；
（4）将胶原蛋白原液加入占胶原蛋白原液质量的0.2%维生素C，加入8500U/g的胰蛋白酶和50000U/g的风味蛋白酶，酶解8h，将酶解产物灭酶，离心分离，将上清液冷冻干燥，即可。
对比例2
（1）鱼皮鱼鳞预处理：将淡水鱼的鱼皮鱼鳞清洗干净后，加入复合脱脂剂（10%正丁醇水溶液），搅拌脱脂处理（复合脱脂剂没过鱼皮鱼鳞即可）5h，水洗至中性；
（2）将水洗后的鱼皮鱼鳞，每g中加入30mL浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液浸泡40min，搅拌均匀后静置30min，过滤，蒸馏水清洗；
步骤（3）-（5）同实施例1。
对比例3
（1）鱼皮鱼鳞预处理：将淡水鱼的鱼皮鱼鳞清洗干净后，加入复合脱脂剂（10%正丁醇水溶液和壬基酚聚氧乙烯醚按照质量比50:1组成），搅拌脱脂处理（复合脱脂剂没过鱼皮鱼鳞即可）3h，水洗至中性；
（2）将水洗后的鱼皮鱼鳞，每g中加入30mL浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液浸泡40min，然后按照碳酸氢钠和柠檬酸的摩尔比3：2滴加浓度为2%的柠檬酸，搅拌均匀后静置30min，过滤，蒸馏水清洗；
（3）将清洗后的鱼皮鱼鳞搅碎，再次加入5倍质量的浓度为5%的柠檬酸水溶液，搅拌均匀后浸泡40min，升温至75-80℃，振荡提取5h，得到胶原蛋白原液；
（4）将0.5g壳聚糖（脱乙酰化≥90%）溶于25-30mL 体积浓度为2%的醋酸水溶液中进行溶解，然后缓慢滴加0.8g正硅酸乙酯，搅拌均匀后，加入0.5mL的戊二醛进行交联反应1.5h，交联结束后，蒸馏水洗涤至中性，65℃干燥即可；
（5）将胶原蛋白原液中首先加入占其质量5%的改性壳聚糖颗粒，搅拌静置20min后，再次加入占胶原蛋白原液质量的0.2%维生素C，加入8500U/g的胰蛋白酶和50000U/g的风味蛋白酶，酶解8h，将酶解产物灭酶，离心分离，将上清液冷冻干燥，即可。
效果实施例
（一）将实施例1-2及对比例1-3制备得到的胶原蛋白肽，首先计算胶原蛋白肽提取率（以鱼皮鱼鳞1000g计），然后将得到的胶原蛋白肽检测羟脯氨酸含量，采用GB9695.23-90进行含量的检测：具体采用氯氨T氧化，对甲氨基苯甲醛进行显色，然后采用分光光度法测定，具体结果见表1。
表1
同时，实验过程中发现，当酶解过程中，不进行维生素C的添加时，酶解的时间延长1-1.5h，才能达到同实施例相当的提取率。
（二）将实施例1及对比例1-2制备得到的胶原蛋白肽进行品质鉴定，具体结果见表2。
表2
（三）对羟基自由基的清除作用
具体过程为：取0.2mL的FeSO4-EDTA 混合液（10mmol/L）于是观众，然后加入0.3mL10mmol/L的2-脱氧核糖溶液，然后加入实施例1及对比例1和2制备得到的胶原蛋白肽稀释液0.6mL（20mg/mL），设置对照组，对照组加入0.6mL蒸馏水，然后加入磷酸缓冲液（pH=7.5）0.7mL和0.2mL的H202（10mmol/L），混匀后置于37℃恒温反应1h，然后加入2.8%的TCA溶液1mL，混匀后加入1mL，1%TBA溶液；检测吸光度值，最终计算羟基自由基清除率；
清除率（%）=【（不加样品的吸光度-加入样品后的吸光度）/不加样品的吸光度】×100%；
具体结果见表3。
表3
Claims (7)
1.一种提高羟脯氨酸含量的鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）鱼皮鱼鳞预处理：将淡水鱼的鱼皮鱼鳞清洗干净后，加入复合脱脂剂脱脂处理3-5h，水洗至中性；
（2）将水洗后的鱼皮鱼鳞，首先加入浓度为0.5%的碳酸氢钠溶液浸泡40min，然后滴加浓度为2%的柠檬酸，搅拌均匀后静置30min，过滤，蒸馏水清洗；
（3）将清洗后的鱼皮鱼鳞搅碎，再次加入浓度为5%的柠檬酸，搅拌均匀后浸泡40min，然后进行分段加热提取，得到胶原蛋白原液；
（4）将胶原蛋白原液中首先加入改性壳聚糖颗粒，搅拌静置20min后，再次加入定量的维生素C，加入胰蛋白酶和风味蛋白酶，酶解8-10h，将酶解产物灭酶，离心分离，将上清液冷冻干燥，即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述复合脱脂剂是由10%正丁醇和壬基酚聚氧乙烯醚按照质量比50:1组成。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述鱼皮鱼鳞和碳酸氢钠溶液的料液比为1g:25-30mL；所述碳酸氢钠和柠檬酸的摩尔比为3：2。
4.根据权利要求1或3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述柠檬酸的加入量占鱼皮鱼鳞质量的5倍。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述分段加热提取的具体过程为：首先升温至45-55℃，振荡提取3h；然后升温至75-80℃，振荡提取2h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述改性壳聚糖颗粒的加入量占胶原蛋白原液质量的5%。
7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述维生素C的加入量占胶原蛋白原液质量的0.2%；所述胰蛋白酶的酶比活力为8000～10000U/g；所述风味蛋白酶的酶比活力为45000～50000U/g。
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