CN103627761A - 一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法。本发明利用鮟鱇鱼皮作为原料，先用酸液抽提出胶原蛋白，然后经过盐析和透析提纯，再后在超声波条件下使用胃蛋白酶和风味蛋白酶分步水解鱼皮胶原蛋白，最后经过脱芳脱色，离心分离后冷冻干燥得到富羟脯氨酸胶原蛋白肽。本发明有效利用了鮟鱇鱼皮的下脚料，通过水解鮟鱇鱼皮制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽，不仅利用了从鮟鱇鱼皮中提取的胶原蛋白肽的高营养价值，还解决了鮟鱇鱼皮下脚料污染环境，造成资源浪费的问题。本发明提供给了一种富羟脯氨酸胶原蛋白肽的制备方法，不仅可以运用于鱼皮原料，还可以运用于其他原料，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及鱼胶原蛋白肽制备领域，尤其是涉及一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法。
背景技术
鮟鱇鱼是广泛分布于我国东部海域（东海北部、黄海及渤海）的冷温性底层鱼类。近年来随着我国鮟鱇鱼加工量不断增长，在加工过程中剩余了大量鱼皮等下脚料，即污染了环境又造成资源的浪费。相关人员对从鮟鱇鱼加工副产物中的硫酸软骨素、硫酸皮肤素、胶原蛋白等活性物质做了相关研究。人们发现，通过水解鮟鱇鱼的胶原蛋白制备成胶原蛋白肽，能够显著提高其营养价值和消化。其胶原蛋白肽能最大程度地发挥出胶原的各种功能，具有保护胃粘膜、抗溃疡作用、抗过敏、降血压、降胆固醇、抗衰老、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮创伤的修复和促进角膜上皮细胞的生长等营养及生理功能。
羟脯氨酸（Hyp）是胶原蛋白肽的特征氨基酸，在其他蛋白质中很少见。文献证明胶原蛋白肽中主要成分脯氨酸-羟脯氨酸（Pro-Hyp）可促进皮肤前卫细胞生长（Agric.Food Chem.2009，57，444-449）和改善关节炎症状（Osteoarthri tis and Cartilage，17（12），1620-1627）。胶原蛋白肽中羟脯氨酸含量和原料来源有关。但是同一来源中，主要取决于制备方法。因此胶原蛋白肽制备过程中最大限度地提取、保留羟脯氨酸至关重要。但是目前文献中报道的各种来源的胶原蛋白肽中的羟脯氨酸含量基本都不超过10%。如吉林大学学报自然科学学报，2001，16-108文献中报道的鹿皮胶原的提取与性质一文中，采用酸法和酶法从东北特产梅花鹿鹿皮中提取胶原蛋白，制备得到的鹿皮胶原肽中羟脯氨酸含量仅为8.6%。
而今研究发现，在鮟鱇鱼皮中，通过ISO3496:1978(E)方法对其进行氨基酸含量检测，发现鮟鱇鱼皮内羟脯氨酸含量较高，是一种极富有提取价值的原料。而现有技术中制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法尚未发现。
发明内容
本发明是为了解决现有鮟鱇鱼皮废料尚未有效利用的问题，同时解决现有技术中缺少制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽方法的问题，提供了一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）选取鮟鱇鱼皮清洗，剪碎成片状，然后放入稀碱液中磁力搅拌24～30 h，取出后水洗至中性；
（2）加入正丁醇溶液，搅拌20～28 h后取出，用水洗涤并沥干；
（3）将沥干的鱼皮捣碎，加入稀酸溶液，加热到55～90℃，经5～7 h搅拌抽提，过滤后得到胶原蛋白粗提液；
（4）在胶原蛋白粗提液中加入0.8～1mol/L的 NaCl溶液盐析20～24h，然后用蒸馏水透析2～3天，得到胶原蛋白沉淀物；
（5）将胶原蛋白沉淀物溶于所述稀酸溶液中，以胶原蛋白沉淀物和稀酸溶液总质量计，加入1%～2%的胃蛋白酶，酶解5～6 h；
（6）然后调pH到6.5～7.5，以胶原蛋白沉淀物和稀酸溶液总质量计，加入0.1%～0.2%的风味蛋白酶，酶解6～7 h；
（7）得到的酶解液进行灭酶、过滤，在滤液中加入活性炭脱芳脱色，然后离心分离除去活性炭，清液冷冻干燥，制得富羟脯氨酸胶原蛋白肽。
作为优选，步骤（5）中胶原蛋白沉淀物和稀酸溶液的料液比为1:10～1:25。
作为优选，所述稀酸溶液为1%～4%的醋酸溶液或柠檬酸溶液。
作为优选，将步骤（3）中的胶原蛋白粗提液放入绝缘袋，进行高压脉冲电场处理0.5～1h。
作为优选，高压脉冲电场处理的脉冲时间为1s，脉冲频率为30～40Hz，电场强度为15～25kV/cm。
作为优选，步骤（5）和步骤（6）的酶解过程中使用超声波辅助酶解。
作为优选，超声波频率为25～40 kHz，功率为100～400 W。
作为优选，胃蛋白酶的酶比活力为3000～3500U/g，胃蛋白酶酶解温度为34～37℃。
作为优选，风味蛋白酶的酶比活力为40000～50000 U/g，风味蛋白酶酶解温度为40～55℃。
作为优选，步骤（1）稀碱液为2.5%～5.5%的NaOH溶液。
本发明制备方法中，先对鮟鱇鱼皮做除杂处理。首先碱洗去除杂蛋白，然后用正丁醇溶液去除脂肪。提高胶原蛋白的纯度，减少其他物质进入后续工序，提高制得的胶原蛋白肽的纯度。然后进行酶解，酶解前用酸液抽提，剥离鱼皮中的胶原蛋白，使其溶解在酸液中。
本发明应用高压脉冲电场辅助，其原理是高压脉冲电场可以在瞬间使细胞壁和细胞膜电位混乱，改变其通透性，并可以击破细胞壁和细胞膜,使它们发生不可逆破坏,造成细胞新陈代谢紊乱、细胞生长的必须组分流出,从而有助于对胶原蛋白的提取。同时此法对胶原蛋白的分子结构不会造成破坏，能保持其包括色、味在内的基本性质。
本发明利用NaCl溶液盐析和蒸馏水透析对胶原蛋白粗提液进行提纯，提高制得胶原蛋白肽的纯度。
本发明采用双酶分步水解的方法：和单酶酶解相比，胃蛋白酶和风味蛋白酶作用于肽键的切割位点不同，胃蛋白酶是为了以切掉芳香族氨基酸，风味蛋白酶能够对胶原蛋白进行内切和外切，以除去苦味和保证释放寡肽。两者相互协同作用胶原蛋白，切断每条肽链内的连接使分子量减小，并将羟脯氨酸充分暴露。和多种酶共同酶解相比，分步酶解更有利于提高酶解效率，因为不同的酶的酶解环境，如PH、温度等都会对酶解产生影响。为加强酶解效果，选取酶比活力为3000～3500U/g的胃蛋白酶，首次酶解温度为34～37℃；然后选取酶比活力为40000～50000 U/g的风味蛋白酶，二次酶解温度为40～55℃。
采用双酶分步水解使得水解分布进行，避免了共同酶解可能对胶原蛋白中原有的羟脯氨酸造成破坏，又使得肽链中的羟脯氨酸充分暴露，因此可制备得到富羟脯氨酸含量的胶原蛋白肽。
本发明中在酶解过程，辅助使用超声波，超声波可以起到乳化效应，能使双酶和胶原蛋白之间均匀的充分的混合和接触，可以提高胶原蛋白肽的提取率，所以也相对地提高了羟脯氨酸的提取率。
同时，本发明对胃蛋白酶酶解时的胃蛋白酶加入量，料液比，酶解温度，酶解时间进行了优化。选取胃蛋白酶加入量：1%～2%；料液比：1:10～1:25；酶解温度：34～37℃；酶解时间：5～6 h，提高羟脯氨酸的提取率。
有益效果：本发明有效利用了鮟鱇鱼皮的下脚料，通过水解鮟鱇鱼皮制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽，不仅利用了从鮟鱇鱼皮中提取的富羟脯氨酸胶原蛋白肽的高营养和医用价值，还解决了鮟鱇鱼皮下脚料污染环境，造成资源浪费的问题。本发明提供给了一种富羟脯氨酸胶原蛋白肽的制备方法，不仅可以运用于鱼皮原料，还可以运用于其他原料，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1
取洗净后的鮟鱇鱼皮1000 g，用剪刀剪切成长宽为2 cm×2 cm左右的碎片。在鮟鱇鱼皮碎片中加入25L 质量分数为4.5% NaOH溶液，浸泡24 h 后取出，然后用水洗涤至pH为中性。再在鱼皮中加入35 L 9%的正丁醇溶液，搅拌28 h后取出，用水洗涤并沥干。将已沥干的鮟鱇鱼皮碎片捣碎，加入60L质量分数为4%的柠檬酸溶液，加热至55℃，并不断搅拌抽提6 h，过滤后得到胶原蛋白粗提液。然后胶原蛋白粗提液放入绝缘袋，进行高压脉冲电场处理0.5h。设置高压脉冲电场处理的脉冲时间为1s，脉冲频率为30Hz，电场强度为25kV/cm。取出后，在胶原蛋白粗提液中加入0.8mol/L的 NaCl溶液盐析20h，然后用蒸馏水透析2天 ，得到胶原蛋白沉淀物。然后将胶原蛋白沉淀物溶于柠檬酸溶液中，设置胶原蛋白沉淀物和柠檬酸溶液的料液比为1:10，以胶原蛋白沉淀物和柠檬酸溶液总质量计，加入1%胃蛋白酶，胃蛋白酶的酶比活力为3000U/g，在超声波频率为40 kHz，功率为400 W，温度为34℃下进行酶解5h；然后用6mol/L的NaOH溶液和6mol/L的HCl溶液调首次酶解后的反应液pH为6.5，加入0.15%的风味蛋白酶，风味蛋白酶的酶比活力为40000U/g，在同样的超声波条件下设置温度为50℃进行二次酶解6 h。对所得的酶解液加热至95℃，并保持7 min灭酶，过滤杂质，所得滤液中加入活性碳，并在40℃搅拌1 h后离心分离除去活性炭，清液冷冻干燥，制得富羟脯氨酸胶原蛋白肽133.26g。通过ISO3496:1978(E)方法对制备得到的胶原蛋白肽进行氨基酸含量检测，测定羟脯氨酸含量。结果见表1。
实施例2
取洗净后的鮟鱇鱼皮1000 g，用剪刀剪切成长宽为2 cm×2 cm左右的碎片。在鮟鱇鱼皮碎片中加入25L 质量分数为2.5% NaOH溶液，浸泡30 h 后取出，然后用水洗涤至pH为中性。再在鱼皮中加入35 L 9%的正丁醇溶液，搅拌20 h后取出，用水洗涤并沥干。将已沥干的鮟鱇鱼皮碎片捣碎，加入60L质量分数为1%的醋酸溶液，加热至65℃，并不断搅拌抽提7 h，过滤后得到胶原蛋白粗提液。然后胶原蛋白粗提液放入绝缘袋，进行高压脉冲电场处理0.5h。设置高压脉冲电场处理的脉冲时间为1s，脉冲频率为40Hz，电场强度为15kV/cm。取出后，在胶原蛋白粗提液中加入0.9mol/L的 NaCl溶液盐析24h，然后用蒸馏水透析3天 ，得到胶原蛋白沉淀物。然后将胶原蛋白沉淀物溶于醋酸溶液中，设置胶原蛋白沉淀物和醋酸溶液的料液比为1:25，以胶原蛋白沉淀物和醋酸溶液总质量计，加入2%胃蛋白酶，胃蛋白酶的酶比活力为3500U/g，在超声波频率为25 kHz，功率为100 W，温度为36℃下进行酶解6h；然后用6mol/L的NaOH溶液和6mol/L的HCl溶液调首次酶解后的反应液pH为7.5，加入0.2%的风味蛋白酶，风味蛋白酶的酶比活力为50000U/g，在同样的超声波条件下设置温度为40℃进行二次酶解7 h。对所得的酶解液加热至95℃，并保持7 min灭酶，过滤杂质，所得滤液中加入活性碳，并在40℃搅拌1 h后离心分离除去活性炭，清液冷冻干燥，制得富羟脯氨酸胶原蛋白肽134.64g。通过ISO3496:1978(E)方法对制备得到的胶原蛋白肽进行氨基酸含量检测，测定羟脯氨酸含量。结果见表1。
实施例3
取洗净后的鮟鱇鱼皮1000 g，用剪刀剪切成长宽为2 cm×2 cm左右的碎片。在鮟鱇鱼皮碎片中加入25L 质量分数为5.5% NaOH溶液，浸泡248 h 后取出，然后用水洗涤至pH为中性。再在鱼皮中加入35 L 9%的正丁醇溶液，搅拌25 h后取出，用水洗涤并沥干。将已沥干的鮟鱇鱼皮碎片捣碎，加入60L质量分数为2%的柠檬酸溶液，加热至90℃，并不断搅拌抽提5 h，过滤后得到胶原蛋白粗提液。然后胶原蛋白粗提液放入绝缘袋，进行高压脉冲电场处理0.5h。设置高压脉冲电场处理的脉冲时间为1s，脉冲频率为35Hz，电场强度为20kV/cm。取出后，在胶原蛋白粗提液中加入1mol/L的 NaCl溶液盐析22h，然后用蒸馏水透析2天 ，得到胶原蛋白沉淀物。然后将胶原蛋白沉淀物溶于柠檬酸溶液中，设置胶原蛋白沉淀物和柠檬酸溶液的料液比为1:15，以胶原蛋白沉淀物和柠檬酸溶液总质量计，加入1.5%胃蛋白酶，胃蛋白酶的酶比活力为3200U/g，在超声波频率为35 kHz，功率为300 W，温度为37℃下进行酶解5.5h；然后用6mol/L的NaOH溶液和6mol/L的HCl溶液调首次酶解后的反应液pH为7，加入0.1%的风味蛋白酶，风味蛋白酶的酶比活力为45000U/g，在同样的超声波条件下设置温度为55℃进行二次酶解6.5 h。对所得的酶解液加热至95℃，并保持7 min灭酶，过滤杂质，所得滤液中加入活性碳，并在40℃搅拌1 h后离心分离除去活性炭，清液冷冻干燥，制得富羟脯氨酸胶原蛋白肽128.65g。通过ISO3496:1978(E)方法对制备得到的胶原蛋白肽进行氨基酸含量检测，测定羟脯氨酸含量。结果见表1。
对比例1
和实施例1的不同之处在于，胶原蛋白粗提液未施加高压脉冲电场处理，两次酶解过程中均未施加超声波条件。结果见表1。
对比例2
和实施例2的不同之处在于，胶原蛋白粗提液未施加高压脉冲电场处理，两次酶解过程中均未施加超声波条件。结果见表1。
Claims (10)
1.一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）选取鮟鱇鱼皮清洗，剪碎成片状，然后放入稀碱液中磁力搅拌24～30 h，取出后水洗至中性；
（2）加入正丁醇溶液，搅拌20～28 h后取出，用水洗涤并沥干；
（3）将沥干的鱼皮捣碎，加入稀酸溶液，加热到55～90℃，经5～7 h搅拌抽提，过滤后得到胶原蛋白粗提液；
（4）在胶原蛋白粗提液中加入0.8～1mol/L的 NaCl溶液盐析20～24h，然后用蒸馏水透析2～3天，得到胶原蛋白沉淀物；
（5）将胶原蛋白沉淀物溶于所述稀酸溶液中，以胶原蛋白沉淀物和稀酸溶液总质量计，加入1%～2%的胃蛋白酶，酶解5～6 h；
（6）然后调pH到6.5～7.5，以胶原蛋白沉淀物和稀酸溶液总质量计，加入0.1%～0.2%的风味蛋白酶，酶解6～7h；
（7）得到的酶解液进行灭酶、过滤，在滤液中加入活性炭脱芳脱色，然后离心分离除去活性炭，清液冷冻干燥，制得富羟脯氨酸胶原蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，步骤（5）中胶原蛋白沉淀物和稀酸溶液的料液比为1:10～1:25。
3.根据权利要求1或2所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，所述稀酸溶液为1%～4%的醋酸溶液或柠檬酸溶液。
4.根据权利要求1所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，将步骤（3）中的胶原蛋白粗提液放入绝缘袋，进行高压脉冲电场处理0.5～1h。
5.根据权利要求4所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，高压脉冲电场处理的脉冲时间为1s，脉冲频率为30～40Hz，电场强度为15～25kV/cm。
6.根据权利要求1所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，步骤（5）和步骤（6）的酶解过程中使用超声波辅助酶解。
7.根据权利要求6所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，超声波频率为25～40kHz，功率为100～400W。
8.根据权利要求1所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，胃蛋白酶的酶比活力为3000～3500U/g，胃蛋白酶酶解温度为34～37℃。
9.根据权利要求1所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，风味蛋白酶的酶比活力为40000～50000 U/g，风味蛋白酶酶解温度为40～55℃。
10.根据权利要求1所述的一种制备富羟脯氨酸胶原蛋白肽的方法，其特征在于，步骤（1）稀碱液为2.5%～5.5%的NaOH溶液。
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