CN112220050A - 一种牦牛胶原蛋白肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种牦牛胶原蛋白肽及其应用。本发明的胶原蛋白肽为3000Da以下的高品质青海牦牛肽，具有较佳的抗衰老和抗氧化作用，同时有利于人体直接吸收，能起到较好的美容保健作用，采用本发明的胶原蛋白肽制备美容保健产品具备较好的抗衰老功效。
Description
技术领域
本发明属于美容保健领域，具体涉及一种牦牛胶原蛋白肽及其应用。
背景技术
随着人民的生活质量和经济水平的高速发展，对于美的追求和机体活力的保养同样日渐提高，特别在抗衰老方面一直保持着极大的需求与渴望。体内的胶原蛋白可以说是一切生命的支架，在衰老方面扮演着重要角色，随着年龄的增长和生活的压力，体内可溶性胶原逐渐减少，导致机体老化与起皱，另一方面年龄的增长，如体内SOD活性下降，降低体内有害自由基的清除能力，进一步加剧机体的老化。但大量研究以证明，通过体外补充胶原蛋白肽，激活多种生化途径，促进胶原的再生和修复，以及自由基清除能力的增强等功效达到安全可靠的抗衰老功效。
当前市场上对于抗衰老的胶原蛋白肽产品的开发，大多数产品依然以鱼皮胶原蛋白肽为主，公开的专利中如CN 105055188 A，CN 201010553485.9，CN 200910230201.X，CN102462640 B等都是选用鱼源胶原蛋白肽作为原料或添加成分起到抗衰老功效，并且市场上大部分商家为了利润将鱼皮肽过度宣传，误导消费者，导致牛源的胶原蛋白肽所占市场地位较低，不如鱼源胶原蛋白肽受欢迎，同时进口胶原蛋白肽占据国内大量的市场份额。
牛源的胶原蛋白具有与人体胶原蛋白最高的相似度，羟脯氨酸含量也是远高于鱼源，水解的胶原蛋白肽本质上应该是更利于人体吸收和促进体内的胶原再生与更新，达到更好的抗衰老效果。如今伴随着西北地区牛副产物利用度降低，进一步降低了牛源胶原蛋白肽生产成本，因此非常有必要推广出高品质的抗衰老功效的牛源胶原蛋白肽产品满足人们的需求，同时大力改进市场上牛源胶原蛋白肽的市场地位。
发明内容
本发明的目的在于提供一种牦牛胶原蛋白肽及其应用，该牦牛胶原蛋白肽具有抗衰老的功效，在抗衰老化妆品、保健品中有较好的应用前景。
本发明目的通过下述技术方案实现。
一种牦牛胶原蛋白肽，其特征在于：
所述牦牛胶原蛋白肽的分子量小于3000Da；
所述牦牛胶原蛋白肽是从青藏高原牦牛的皮中提取；
所述牦牛胶原蛋白肽中羟脯氨酸含量大于10g/100g；
所述牦牛胶原蛋白肽具有抗衰老的功效。
作为优选技术方案，所述牦牛胶原蛋白肽通过复合定向酶切技术提取。
作为优选技术方案，所述青海柴达木盆地牦牛为纯天然生态环境，低温低氧强光养育。
一种上述牦牛胶原蛋白肽在抗衰老化妆品中的应用。
一种上述牦牛胶原蛋白肽在抗衰老保健品中的应用。
作为具体技术方案，所述化妆品包括精华，眼霜，防晒霜，面膜。
作为具体技术方案，所述抗衰老保健品包括固体冲剂，营养棒，口服液，胶囊。
本发明的有益效果：本发明的抗衰老牦牛源牦牛胶原蛋白肽能显著促进人成纤维细胞的增殖，提高肌肤的自我新陈代谢和修复能力，又能明显提高胞内SOD活力，加强机体自身对有害自由基的清除能力，高含量的羟脯氨酸同样能促进胶原蛋白的再生，同时在体外本体仍有较好的抗氧化能力，从各方面协同作用具备作为抗衰老功效的原料或添加成分的应用。
附图说明
图1为本发明牦牛胶原蛋白肽对成纤维细胞增殖的影响图。
图2为本发明牦牛胶原蛋白肽处理成纤维细胞后对胞内SOD活力的影响图。
图3为本发明牦牛胶原蛋白肽体外清除DPPH自由基的能力图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明，需要指出的是以下实施方式仅是以例举的形式对本发明所做的解释性说明，但本发明的保护范围并不仅限于此，所有本领域的技术人员以本发明的精神对本发明所做的等效的替换均落入本发明的保护范围。
实施例1
一种牦牛胶原蛋白肽，其制备方法具体步骤如下：
(1)前处理：称取新鲜牦牛皮，脱毛后切碎成1×1cm的块状，于室温下按料液质量比为1:5kg/kg加入质量浓度为5％的纯碱浸泡8h，浸泡结束后清水洗净牦牛皮至中性，之后将牦牛皮按料液质量比为1:5kg/kg加入至质量浓度为5％食盐中再次浸泡8h，浸泡结束后，清水洗净牦牛皮呈中性，以达到脱脂除杂的目的；
(2)匀浆：将前处理后的牦牛皮按料液质量比为1:5kg/kg加入0.05M的醋酸溶液用胶体磨进行充分匀浆，制得牦牛皮匀浆液；
(3)酶解：
第一次酶解：于步骤(2)匀浆得到的牦牛皮浆液中加入1.5g酶活力为10万的胃蛋白酶，之后于真空度0.85～0.98MPa、转速20r/min、温度35～40℃下进行旋蒸脱溶酶解4h，得第一次酶解液；
超微细化处理：将第一次酶解液灭酶，之后过200目筛，之后收集筛下液采用纳米对撞机进行超微细化处理，使处理后的筛下液的平均粒径小于500nm，得纳米化酶解液；
第二次酶解：采用NaOH调整纳米化酶解液的pH至9，加入0.3g酶活力为20万的碱性蛋白酶和0.03g酶活力为10万的弹性蛋白酶，之后于真空度0.85～0.98MPa、转速15～60r/min、温度50℃下进行旋蒸脱溶酶解2h；
(4)离心分离：将步骤(3)酶解结束后的酶解液高温煮沸30min进行灭酶和杀菌，之后于10000rpm的条件下离心除去残渣，微滤后得到胶原蛋白肽酶解液。
(5)脱色、脱腥、脱盐：于步骤(4)离心分离后得到的胶原蛋白肽酶解液中加入1.5g、200目的木质活性炭，室温下60r/min搅拌2～3h，之后抽滤去除活性炭，再经离子交换树脂柱进一步脱色、脱盐、脱腥。
(6)浓缩干燥：对上一步处理后的酶解液，通过降膜浓缩后，进行喷雾干燥，制得无色无味的牦牛胶原蛋白肽样品。
本发明牦牛胶原蛋白肽中羟氨酸含量测定。
本发明牦牛胶原蛋白肽的羟脯氨酸含量测定选择羟脯氨酸含量检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)进行测定。
取0.2mg牦牛胶原蛋白肽样品，加入1mL的6mol/L盐酸的提取液，110℃烘箱2至6小时消化至透明状，16000rpm，25℃，离心20min，用10mol/L NaOH(约0.5mL)调节pH值至6～8范围内，蒸馏水定容至2mL，取上清待测。样品经水解产生游离的HYP，进一步被氯胺T氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应，产生红色化合物，在560nm处有特征吸收峰。通过测定样品水解液560nm吸光值，可计算HYP含量。
按照试剂盒的操作表进行测定，绘制出羟脯氨酸标准曲线，被测定的牦牛胶原蛋白肽样品通过说明书计算方式换算出羟脯氨酸含量。测定结果得出，本发明的牦牛胶原蛋白肽羟脯氨酸的含量大于10g/100g，具有较高的羟脯氨酸含量，可以满足人体羟脯氨酸外源性摄取，促进机体胶原蛋白的再生与修复，起到一定抗衰老功效。
实施例2
CCK8法检测牦牛牦牛胶原蛋白肽对人成纤维细胞增殖影响。
人成纤维细胞HFF-1于DMEM培养基(含10％胎牛血清)在5％CO2，恒温37℃的二氧化碳培养箱中培养。取传代后指数期生长期的成纤维细胞，调节细胞密度为2.5×104个/mL，接种于96孔板，每孔100μl于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后加入样品(样品溶解于DMEM培养液中，用0.22μm的滤器过滤)，使其终浓度达到0.312，3.12，12.5mg/mL。继续培养48后，吸出培养液加入100μl 10％CCK8，置于二氧化碳培养箱中培养培养2h，用多功能酶标仪于450nm检测吸光度(OD值)，最后计算各组的细胞存活率。每个实验组设置5个重复进行培养，对照组加入同体积的DMEM培养基。细胞生存率(％)＝(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100％，结果见图1。
由图1可知，牦牛胶原蛋白肽能明显促进人成纤维细胞的增殖。与对照组相比，不同浓度(0.312，3.12，12.5mg/mL)的牦牛胶原蛋白肽可以使人成纤维细胞促增殖率分别为32.0％，34.8％，24.0％。
实施例3
本发明牦牛胶原蛋白肽处理成纤维细胞后对胞内SOD活力测定。
本发明牦牛胶原蛋白肽处理成纤维细胞后对胞内SOD活力测定选择超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。
人成纤维细胞HFF-1于DMEM培养基(含10％胎牛血清)在5％CO2，恒温37℃的二氧化碳培养箱中培养。取传代后指数期生长期的成纤维细胞，调节细胞密度为1×106个/mL，接种于六孔板中，每孔100μl，于37℃，5％CO2的培养箱中培养24h后加入样品(样品溶解于DMEM培养液中，用0.22μm的滤器过滤)，使其终浓度达到0.312，3.12，12.5mg/mL。培养48h后，消化细胞重悬于1mL培养基中并细胞计数。计数完离心弃培养基，加入1ml试剂盒自带提取液，超声波破碎，8000g 4℃离心10分钟，取上清，置冰上待测SOD活力。该实验中，同时设置不含牦牛胶原蛋白肽的培养基作为对照，每组设置3个重复。操作方法按照说明书进行，结果见图2。
由图2可知，牦牛胶原蛋白肽能明显提高人成纤维细胞胞内SOD活力。与对照组比，不同浓度(0.312，3.12，12.5mg/mL)的牦牛胶原蛋白肽分别使人成纤维细胞胞内的SOD活力相对提高43.9％，82.7％，65.1％。
实施例4
本发明牦牛胶原蛋白肽体外清除DPPH自由基的能力测定。
本发明牦牛胶原蛋白肽外清除DPPH自由基的能力测定选择DPPH自由基清除能力检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。
用试剂盒自带提取液配制成不同浓度(2、10、20、30、40mg/mL)的牦牛胶原蛋白肽，离心后取上清按照试剂盒测定步骤操作，测定515nm处空白管、对照管和测定管的吸光值，且分别记为A空白、A对照和A测定。DPPH自由基清除率的计算公式为：
DPPH自由基清除率(％)＝[[A空白-(A测定-A对照)]/A空白]×100％，测定结果见图3。
由图3可知，牦牛胶原蛋白肽能起到明显的DPPH自由基清除效果。不同浓度(2、10、20、30、40mg/mL)的牦牛牦牛胶原蛋白肽对DPPH自由基分别起到46.5％，64.6％，74.8％，82.9％，92.3％的清除效果。
Claims (7)
1.一种牦牛胶原蛋白肽，其特征在于：
所述牦牛胶原蛋白肽的分子量小于3000Da；
所述牦牛胶原蛋白肽是从青藏高原牦牛的皮中提取；
所述牦牛胶原蛋白肽中羟脯氨酸含量大于10g/100g；
所述牦牛胶原蛋白肽具有抗衰老的功效。
2.如权利要求1所述的牦牛胶原蛋白肽，其特征在于所述牦牛胶原蛋白肽通过复合定向酶切技术提取。
3.如权利要求1所述的牦牛胶原蛋白肽，其特征在于所述青藏高原牦牛为纯天然生态环境，低温低氧强光养育。
4.如权利要求1所述牦牛胶原蛋白肽在抗衰老化妆品中的应用。
5.如权利要求1所述牦牛胶原蛋白肽在抗衰老保健品中的应用。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述化妆品包括精华，眼霜，防晒霜，面膜。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述抗衰老保健品包括固体冲剂，营养棒，口服液，胶囊。
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