CN113999884A - 一种甲鱼生物活性肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种甲鱼生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：原料预处理、超低温粉碎、发酵、真空浓缩、透析、灭菌与喷雾干燥。本发明提供的甲鱼生物活性肽的制备方法采用肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的组合对甲鱼蛋白进行发酵处理，同时添加了适合于肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵的发酵辅料，一方面肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株可产生多种不同的蛋白酶，从而使甲鱼蛋白分解成多种不同的小分子肽链，同时由于为菌种发酵获得，并非特定的蛋白酶水解，因此提高了甲鱼多肽的生物利用率和功效；同时肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种在发酵过程中可产生特殊的香味，可去除甲鱼的腥味，口感好。

Description

一种甲鱼生物活性肽的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种甲鱼生物活性肽的制备方法。
背景技术
蛋白质是人类膳食所必需的营养素，又是合成人体蛋白质所需氨基酸的主要氮源。蛋白质的营养价值取决于氨基酸的组成、含量、生物利用率及最小的氧化程度，此外还与氨基酸的蛋白来源、加工条件和其它膳食成分密切相关。蛋白质通过水解可大大提高其营养价值及商业价值。水解产物中的短肽是更适合人类需求的蛋白源，水解物中常含有生物活性肽，具有特殊的生理功能。生物活性肽指能够调节生物机体的生命活动或具有某些生理活性作用的一类肽的总称。这些生物活性肽大多以非活性状态存在于蛋白质长链中，当被酶解成适当的长度时，它们的生理活性才会表现出来。生物活性肽在人体代谢与人体机能方面的调节功能已引起科研工作者相当大的关注，小肽类(2～7个氨基酸)在人体吸收代谢中具有重要的生理功能。如酪蛋白磷酪肽，保证Ca2+在人体内以离子形式存在，便于人体吸收；降血压肽能够消除人体血管内的紧张素，使血管舒张，降低血压；乳球菌肽具有广泛的抑菌作用。目前人们认同的活性肽的定义是对肌体构成一套高度自动化的物质，是沟通细胞间、血管间联系的信使，为外分泌、内分泌、神经系统行使传递功能，从而使肌体组成了高度严密的系统，促使生物体生长、发育和繁殖的正常进行。而且某些短肽在食品感官上有重要的作用。在活性肽的制备过程中，酶水解法是一种重要的方法。近年来通过对动植物源蛋白原料进行适当方法的水解，已经有大量具有重要生物活性的短肽被释放和辨认出来。然而蛋白水解物能否获得广泛应用还与其感官特性、加工适性及潜在活性成分最大程度的释放和最大程度保留(不被降解)等因素密切相关。
甲鱼肉质鲜嫩味美，营养丰富，含有蛋白质、多种矿物质元素及多种不饱和脂肪酸，具有强身健体、提高免疫、延年益寿、防癌抗癌的功效，是一种良好的药食同源的佳品。在动物性食品中，甲鱼蛋白含量居于前位，且甲鱼为冷血动物，经过规范化和标准化养殖，其蛋白的安全性更胜一筹，可以作为制备高品质肽产品的优质原料。以甲鱼为原料水解生产的甲鱼多肽，特别是小分子多肽，更具易被人体肠道消化吸收或被皮肤所直接吸收，其中被肠道消化吸收的小分子多肽除了保留很高的营养价值及药用价值外，还具有较强的抑制血管紧张素转换酶(ACE)活性以达到降低血压或阻止血压上升，其抗氧化活性能延缓衰老、提高免疫等能力；而被皮肤直接吸收的小分子多肽除提供丰富营养外，更对皮肤有明显的护肤防皱、保滋润的功能。
随着现代生物学的发展，越来越多的人利用生物酶解技术酶解甲鱼蛋白质，从而获得许多具有生理功能的生物活性多肽，增加原有蛋白质中没有的生物学功能，具有很高的经济价值。近年来，虽有采用酶法制取甲鱼多肽的有关报道，然而，由于现有工艺都只单纯应用酶法的水解方法，其工艺简单造成酶解不彻底，产品得率低；同时，采用特定的蛋白酶进行水解，选择性不强，造成酶解后的小分子肽生物利用度不高、生物活性不高，因此，如何获得生物活性高的甲鱼活性肽，是亟待解决的问题。
发明内容
技术问题：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种甲鱼生物活性肽的制备方法。
技术方案：本发明提供一种甲鱼生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：鲜活甲鱼断食清养后，经去除、去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，再用搅拌机绞碎，再用乙醇溶液脱脂；
(2)超低温粉碎：脱脂后的甲鱼碎末经超低温粉碎后，投入反应釜内，加入10-20倍重量的水，加热至80℃保温半小时后降温至室温，得浆液；
(3)发酵：调节浆液pH至3.0-5.5，向浆液中添加发酵辅料，搅拌均匀，再加入肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)发酵，灭菌后离心，上清液即为发酵液；
(4)真空浓缩：将发酵液置于真空浓缩机内，50-70℃下减压浓缩至多肽浓度为30-40％的浓缩液；
(5)透析：在0.25～0.28MPa压力下，将浓缩液用透过分子质量为1KDa的超滤膜超滤，超滤液经柱层析分离后取洗脱峰分管收集；
(6)灭菌与喷雾干燥：将收集到的不同分子量的多肽在温度135-140℃下灭菌，灭菌液送入喷雾干燥机内喷干，即得不同分子量的甲鱼生物活性肽。
步骤(1)中，脱脂操作为：将粉碎后的甲鱼按照肉液比1:5～7的比例与乙醇溶液混合均匀，在25～28℃温度下反应3～5h，过滤、离心，乙醇溶液的体积浓度≥95％。
步骤(3)中，所述发酵辅料的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的4-8％，肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的1-3％，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的0.5-1.5％。
步骤(3)中，所述发酵辅料包括经均质、巴氏杀菌的牛乳10-20份，高粱10-20份，大麦5-10份，NaCl 5-10份，葡萄糖10-20份，K2HPO4 2-4份，CaCl2 2-4份。
其中，牛乳均质、巴氏杀菌工艺条件为：在压力14MPa～21MPa、温度40～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，将灭菌后的牛乳冷却至21～30℃，待用。
步骤(3)中，发酵条件为：发酵摇床转速为120～160r/min，发酵温度为28～30℃，发酵时间为48～72h。
步骤(5)中，柱层析操作为：用蒸馏水平衡后装柱(16mm×500mm)，上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰。
步骤(6)中，喷干条件为：进口温度为200-220℃，出口温度为80-100℃。
有益效果：本发明提供的甲鱼生物活性肽的制备方法采用肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的组合对甲鱼蛋白进行发酵处理，同时添加了适合于肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵的发酵辅料，一方面肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株可产生多种不同的蛋白酶，从而使甲鱼蛋白分解成多种不同的小分子肽链，同时由于为菌种发酵获得，并非特定的蛋白酶水解，因此提高了甲鱼多肽的生物利用率和功效；同时肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种在发酵过程中可产生特殊的香味，可去除甲鱼的腥味，口感好。
具体实施方式
下面对本发明作出进一步说明。
本申请中使用的微生物均为市售：
乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)，购自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号CCTCC DB 20082459；
肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)，购自中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号CCTCC AF 93012。
实施例1
甲鱼生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：鲜活甲鱼断食清养后，经去除、去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，再用搅拌机绞碎，再用乙醇溶液脱脂；
脱脂操作为：将粉碎后的甲鱼按照肉液比1:6的比例与乙醇溶液混合均匀，在25～28℃温度下反应4h，过滤、离心，乙醇溶液的体积浓度为98％。
(2)超低温粉碎：脱脂后的甲鱼碎末经超低温粉碎后，投入反应釜内，加入15倍重量的水，加热至80℃保温半小时后降温至室温，得浆液；
(3)发酵：调节浆液pH至4，向浆液中添加发酵辅料，搅拌均匀，再加入肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)发酵，灭菌后离心，上清液即为发酵液；
所述发酵辅料的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的6％，肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的2％，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的1％。
所述发酵辅料包括经均质、巴氏杀菌的牛乳15份，高粱15份，大麦7.5份，NaCl 7.5份，葡萄糖15份，K2HPO4 3份，CaCl2 3份。
其中，牛乳均质、巴氏杀菌工艺条件为：在压力18MPa、温度60℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，将灭菌后的牛乳冷却至25℃，待用。
发酵条件为：发酵摇床转速为140r/min，发酵温度为28～30℃，发酵时间为60h。
(4)真空浓缩：将发酵液置于真空浓缩机内，60℃下减压浓缩至多肽浓度为35％的浓缩液；
(5)透析：在0.25～0.28MPa压力下，将浓缩液用透过分子质量为1KDa的超滤膜超滤，超滤液经柱层析分离后取洗脱峰分管收集；
柱层析操作为：用蒸馏水平衡后装柱(16mm×500mm)，上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰。
(6)灭菌与喷雾干燥：将收集到的不同分子量的多肽在温度135-140℃下灭菌，灭菌液送入喷雾干燥机内喷干，即得不同分子量的甲鱼生物活性肽；
喷干条件为：进口温度为210℃，出口温度为90℃。
实施例2
甲鱼生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：鲜活甲鱼断食清养后，经去除、去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，再用搅拌机绞碎，再用乙醇溶液脱脂；
脱脂操作为：将粉碎后的甲鱼按照肉液比1:5的比例与乙醇溶液混合均匀，在25～28℃温度下反应3h，过滤、离心，乙醇溶液的体积浓度95％。
(2)超低温粉碎：脱脂后的甲鱼碎末经超低温粉碎后，投入反应釜内，加入10倍重量的水，加热至80℃保温半小时后降温至室温，得浆液；
(3)发酵：调节浆液pH至5.5，向浆液中添加发酵辅料，搅拌均匀，再加入肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)发酵，灭菌后离心，上清液即为发酵液；
所述发酵辅料的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的4％，肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的1％，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的0.5％。
所述发酵辅料包括经均质、巴氏杀菌的牛乳10份，高粱20份，大麦5份，NaCl 5份，葡萄糖20份，K2HPO4 2份，CaCl2 4份。
其中，牛乳均质、巴氏杀菌工艺条件为：在压力14MPa、温度85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，将灭菌后的牛乳冷却至21℃，待用。
发酵条件为：发酵摇床转速为160r/min，发酵温度为28～30℃，发酵时间为48h。
(4)真空浓缩：将发酵液置于真空浓缩机内，50℃下减压浓缩至多肽浓度为30％的浓缩液；
(5)透析：在0.25～0.28MPa压力下，将浓缩液用透过分子质量为1KDa的超滤膜超滤，超滤液经柱层析分离后取洗脱峰分管收集；
柱层析操作为：用蒸馏水平衡后装柱(16mm×500mm)，上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰。
(6)灭菌与喷雾干燥：将收集到的不同分子量的多肽在温度135-140℃下灭菌，灭菌液送入喷雾干燥机内喷干，即得不同分子量的甲鱼生物活性肽；
喷干条件为：进口温度为200℃，出口温度为80℃。
实施例3
甲鱼生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：鲜活甲鱼断食清养后，经去除、去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，再用搅拌机绞碎，再用乙醇溶液脱脂；
脱脂操作为：将粉碎后的甲鱼按照肉液比1:7的比例与乙醇溶液混合均匀，在25～28℃温度下反应5h，过滤、离心，乙醇溶液的体积浓度98％。
(2)超低温粉碎：脱脂后的甲鱼碎末经超低温粉碎后，投入反应釜内，加入20倍重量的水，加热至80℃保温半小时后降温至室温，得浆液；
(3)发酵：调节浆液pH至3.0，向浆液中添加发酵辅料，搅拌均匀，再加入肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)发酵，灭菌后离心，上清液即为发酵液；
所述发酵辅料的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的8％，肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的3％，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的1.5％。
所述发酵辅料包括经均质、巴氏杀菌的牛乳20份，高粱10份，大麦10份，NaCl 10份，葡萄糖10份，K2HPO4 4份，CaCl2 2份。
其中，牛乳均质、巴氏杀菌工艺条件为：在压力21MPa、温度40℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，将灭菌后的牛乳冷却至21℃，待用。
发酵条件为：发酵摇床转速为160r/min，发酵温度为28～30℃，发酵时间为72h。
(4)真空浓缩：将发酵液置于真空浓缩机内，70℃下减压浓缩至多肽浓度为40％的浓缩液；
(5)透析：在0.25～0.28MPa压力下，将浓缩液用透过分子质量为1KDa的超滤膜超滤，超滤液经柱层析分离后取洗脱峰分管收集；
柱层析操作为：用蒸馏水平衡后装柱(16mm×500mm)，上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰。
(6)灭菌与喷雾干燥：将收集到的不同分子量的多肽在温度135-140℃下灭菌，灭菌液送入喷雾干燥机内喷干，即得不同分子量的甲鱼生物活性肽；
喷干条件为：进口温度为220℃，出口温度为100℃。
对比例1
甲鱼生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：鲜活甲鱼断食清养后，经去除、去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，再用搅拌机绞碎，再用乙醇溶液脱脂；
脱脂操作为：将粉碎后的甲鱼按照肉液比1:6的比例与乙醇溶液混合均匀，在25～28℃温度下反应4h，过滤、离心，乙醇溶液的体积浓度为98％。
(2)超低温粉碎：脱脂后的甲鱼碎末经超低温粉碎后，投入反应釜内，加入15倍重量的水，加热至80℃保温半小时后降温至室温，得浆液；
(3)发酵：调节浆液pH至4，向浆液中添加发酵辅料，搅拌均匀，再加入肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)发酵，灭菌后离心，上清液即为发酵液；
所述发酵辅料的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的6％，肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的2％。
所述发酵辅料包括经均质、巴氏杀菌的牛乳15份，高粱15份，大麦7.5份，NaCl 7.5份，葡萄糖15份，K2HPO4 3份，CaCl2 3份。
其中，牛乳均质、巴氏杀菌工艺条件为：在压力18MPa、温度60℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，将灭菌后的牛乳冷却至25℃，待用。
发酵条件为：发酵摇床转速为140r/min，发酵温度为28～30℃，发酵时间为60h。
(4)真空浓缩：将发酵液置于真空浓缩机内，60℃下减压浓缩至多肽浓度为35％的浓缩液；
(5)透析：在0.25～0.28MPa压力下，将浓缩液用透过分子质量为1KDa的超滤膜超滤，超滤液经柱层析分离后取洗脱峰分管收集；
柱层析操作为：用蒸馏水平衡后装柱(16mm×500mm)，上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰。
(6)灭菌与喷雾干燥：将收集到的不同分子量的多肽在温度135-140℃下灭菌，灭菌液送入喷雾干燥机内喷干，即得不同分子量的甲鱼生物活性肽；
喷干条件为：进口温度为210℃，出口温度为90℃。
对比例2
甲鱼生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：鲜活甲鱼断食清养后，经去除、去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，再用搅拌机绞碎，再用乙醇溶液脱脂；
脱脂操作为：将粉碎后的甲鱼按照肉液比1:6的比例与乙醇溶液混合均匀，在25～28℃温度下反应4h，过滤、离心，乙醇溶液的体积浓度为98％。
(2)超低温粉碎：脱脂后的甲鱼碎末经超低温粉碎后，投入反应釜内，加入15倍重量的水，加热至80℃保温半小时后降温至室温，得浆液；
(3)发酵：调节浆液pH至4，向浆液中添加发酵辅料，搅拌均匀，再加入乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)发酵，灭菌后离心，上清液即为发酵液；
所述发酵辅料的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的6％，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的3％。
所述发酵辅料包括经均质、巴氏杀菌的牛乳15份，高粱15份，大麦7.5份，NaCl 7.5份，葡萄糖15份，K2HPO4 3份，CaCl2 3份。
其中，牛乳均质、巴氏杀菌工艺条件为：在压力18MPa、温度60℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，将灭菌后的牛乳冷却至25℃，待用。
发酵条件为：发酵摇床转速为140r/min，发酵温度为28～30℃，发酵时间为60h。
(4)真空浓缩：将发酵液置于真空浓缩机内，60℃下减压浓缩至多肽浓度为35％的浓缩液；
(5)透析：在0.25～0.28MPa压力下，将浓缩液用透过分子质量为1KDa的超滤膜超滤，超滤液经柱层析分离后取洗脱峰分管收集；
柱层析操作为：用蒸馏水平衡后装柱(16mm×500mm)，上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰。
(6)灭菌与喷雾干燥：将收集到的不同分子量的多肽在温度135-140℃下灭菌，灭菌液送入喷雾干燥机内喷干，即得不同分子量的甲鱼生物活性肽；
喷干条件为：进口温度为210℃，出口温度为90℃。
对比例3
甲鱼生物活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：鲜活甲鱼断食清养后，经去除、去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，再用搅拌机绞碎，再用乙醇溶液脱脂；
脱脂操作为：将粉碎后的甲鱼按照肉液比1:6的比例与乙醇溶液混合均匀，在25～28℃温度下反应4h，过滤、离心，乙醇溶液的体积浓度为98％。
(2)超低温粉碎：脱脂后的甲鱼碎末经超低温粉碎后，投入反应釜内，加入15倍重量的水，加热至80℃保温半小时后降温至室温，得浆液；
(3)酶解：将浆液低温调整至含水量为70％，添加2500U/g酸性蛋白酶，再加入(R)-1,1’-联萘-2,2’-酚基二异丙氧钛，微波辅助酶解，酶解结束后灭酶得酶解液；
(4)真空浓缩：将酶解置于真空浓缩机内，60℃下减压浓缩至多肽浓度为35％的浓缩液；
(5)透析：在0.25～0.28MPa压力下，将浓缩液用透过分子质量为1KDa的超滤膜超滤，超滤液经柱层析分离后取洗脱峰分管收集；
柱层析操作为：用蒸馏水平衡后装柱(16mm×500mm)，上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰。
(6)灭菌与喷雾干燥：将收集到的不同分子量的多肽在温度135-140℃下灭菌，灭菌液送入喷雾干燥机内喷干，即得不同分子量的甲鱼生物活性肽；
喷干条件为：进口温度为210℃，出口温度为90℃。
实验例测试实施例1至3以及对比例1至3制得的甲鱼生物活性肽的特性。
测试方法：
1、ACE抑制率的体外检测方法(l)试剂的配制
硼酸钠缓冲溶液：用去离于水配制，其中含硼酸钠浓度为0.1mol/L、NaCl浓度为375mmol/L,然后用浓度为6mol/L的NaOH调pH值为8.3。
ACE试剂：粉状物,将0.1U的ACE用2mL的去离子水溶解，配成0.05U/L，分装后于-20℃保藏。
HHL试剂：溶于硼酸钠缓冲溶液，配成浓度为8.3mmol/L，分装后于-20℃保藏。
(2)测定方法
将ACE试剂25μl、HHL 75μl加入到试管中，在37℃水浴中反应30min，反应结束后马上加入浓度为1mol/L的HCl以终止反应；然后于试管中加入乙酸乙酯1.7mL，旋涡混合后进行离心(4000r/min，10min)；吸取1.4mL乙酸乙酯层于另一试管中，放入烘箱中，120℃挥发溶剂30min，拿出冷却后加入去离子水3mL，旋涡混合后在228nm下测定其吸光值，计算公式为：ACE抑制率％＝(Ab-Aa)/(Ab-Ac)×100％
式中：Ab为在反应中不加抑制剂的光密度值；Aa为在反应中ACE和ACE抑制剂同时存在的光密度值；Ac为ACE与HHL空白反应的光密度值。
2、羟自由基清除率测定
在试管中加入0.5mL 10mmol/L水杨酸-乙醇溶液，0.5mL酶解液，0.5mL 10mmol/LFeSO4溶液，3.5mL蒸馏水，最后加入5mL 100mmol/L H2O2启动Fenton反应，摇匀后于510nm处测定吸光度A1；取0.5mL的蒸馏水代替10mmol/L FeSO4溶液所测得的吸光度为A2；取0.5mL的蒸馏水代替酶解液所测得的吸光度为A3。羟自由基的清除率P(％)表示为：P(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100％
3、氧自由基清除率测定
取4.5mL pH8.2 50mmol/L Tris-HCl缓冲液，4.2mL蒸馏水，混匀后在25℃水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃水浴中预热过的30mmol/L邻苯三酚0.3mL(以10mmol/LHCl配制)，空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚的HCl溶液，迅速摇匀后倒入比色杯，325nm处每隔30s测定吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加，在加入邻苯三酚前先加入1mL的酶解液，蒸馏水减少，然后按上述方法计算抑制率。
抑制率(％)＝(△A0-△A)/△A0×100％其中：△A0：空白溶液的吸光度随时间的变化率；△A：样品溶液的吸光度随时间的变化率。
3、DPPH·清除率测定
取酶解液2mL及1×10-4mol/L DPPH·溶液(用95％乙醇配制)2mL加入同一具塞试管中摇匀，在室温下密闭静置30min，于517nm波长下测定吸光度。
DPPH·清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
其中：A1：酶解液+DPPH·溶液的吸光度；A2：酶解液+95％乙醇溶液的吸光度；A0：DPPH·溶液+蒸馏水的吸光度。
4、总还原能力的测定
采用铁氰化钾法测定。取一定浓度的样品加入2.5mL 0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液和2.5mL 5％铁氰化钾溶液，混匀，在50℃保温20min后加入2.5mL 10％的三氯乙酸，混合后，以3000r/min离心10min,取上清液2.5mL，加入0.5mL 0.1％的三氯化铁，然后在700nm波长处比色测吸光度A值。A越大，则样品的还原能力越强。
测试结果：
Figure BDA0003340359800000111
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种甲鱼生物活性肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)原料预处理：鲜活甲鱼断食清养后，经去除、去壳、去皮、剔骨，并去除肉眼可见的脂肪粒后，再用搅拌机绞碎，再用乙醇溶液脱脂；
(2)超低温粉碎：脱脂后的甲鱼碎末经超低温粉碎后，投入反应釜内，加入10-20倍重量的水，加热至80℃保温半小时后降温至室温，得浆液；
(3)发酵：调节浆液pH至3.0-5.5，向浆液中添加发酵辅料，搅拌均匀，再加入肉桂色曲霉(Aspergillus cinnamomeus)和乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)发酵，灭菌后离心，上清液即为发酵液；
(4)真空浓缩：将发酵液置于真空浓缩机内，50-70℃下减压浓缩至多肽浓度为30-40％的浓缩液；
(5)透析：在0.25～0.28MPa压力下，将浓缩液用透过分子质量为1KDa的超滤膜超滤，超滤液经柱层析分离后取洗脱峰分管收集；
(6)灭菌与喷雾干燥：将收集到的不同分子量的多肽在温度135-140℃下灭菌，
灭菌液送入喷雾干燥机内喷干，即得不同分子量的甲鱼生物活性肽。
2.根据权利要求1所述的一种甲鱼生物活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，脱脂操作为：将粉碎后的甲鱼按照肉液比1:5～7的比例与乙醇溶液混合均匀，在25～28℃温度下反应3～5h，过滤、离心，乙醇溶液的体积浓度≥95％。
3.根据权利要求1所述的一种甲鱼生物活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述发酵辅料的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的4-8％，肉桂色曲霉(Aspergilluscinnamomeus)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的1-3％，乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)的加入量为脱脂后的甲鱼碎末质量的0.5-1.5％。
4.根据权利要求1所述的一种甲鱼生物活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述发酵辅料包括经均质、巴氏杀菌的牛乳10-20份，高粱10-20份，大麦5-10份，NaCl 5-10份，葡萄糖10-20份，K2HPO4 2-4份，CaCl2 2-4份。
5.根据权利要求4所述的一种甲鱼生物活性肽的制备方法，其特征在于：牛乳均质、巴氏杀菌工艺条件为：在压力14MPa～21MPa、温度40～85℃的条件下均质后进行巴氏杀菌，将灭菌后的牛乳冷却至21～30℃，待用。
6.根据权利要求1所述的一种甲鱼生物活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，发酵条件为：发酵摇床转速为120～160r/min，发酵温度为28～30℃，发酵时间为48～72h。
7.根据权利要求1所述的一种甲鱼生物活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，柱层析操作为：用蒸馏水平衡后装柱(16mm×500mm)，上样质量浓度2～3mg/mL，上样量2mL，洗脱液为蒸馏水，流速20～25mL/h，在220nm处检测，收集洗脱峰。
8.根据权利要求1所述的一种甲鱼生物活性肽的制备方法，其特征在于：步骤(6)中，喷干条件为：进口温度为200-220℃，出口温度为80-100℃。
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