CN111685286B - 一种具有降血脂功能的牡蛎肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有降血脂功能的牡蛎肽及其制备方法和应用，本发明采用固定化复合蛋白酶水解牡蛎蛋白制备牡蛎肽，并对牡蛎肽进行结构修饰，提高牡蛎肽的降血脂活性。本发明利用壳聚糖固定化复合蛋白酶精准高效水解牡蛎蛋白，兼具蛋白酶水解与壳聚糖脱色去腥功能，不需要高温、强酸、强碱等灭酶工艺和单独的脱色去腥工艺，避免灭酶工艺引起的颜色褐变及副产物产生。本发明制备的牡蛎肽蛋白含量高，感官风味优良，经过修饰反应显著提高牡蛎肽的降血脂活性，可以广泛应用于保健食品或食品开发，具有广阔的研究应用前景。

Description

一种具有降血脂功能的牡蛎肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物加工技术领域，具体涉及一种具有降血脂功能的牡蛎肽及其制备方法和应用。
背景技术
《中国心血管报告2017》显示，我国心血管病患病率近年来持续上升，据推算目前全国约2.9亿患病，心血管病导致的死亡占据城乡居民死亡原因的首位，而高血脂症是导致心血管疾病最重要的危险因素之一。高血脂症是指血浆中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)增高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)降低的症状，可引起动脉粥样硬化、心脏病、中风和脂肪肝高血脂症会诱发动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗塞和脑血栓、中风、脂肪肝和糖尿病等疾病，严重危害到人类健康。高血脂症的治疗方式分为药物和非药物治疗两大类，一线用药多为化学药，虽然疗效显著，但是其对肝脏和肾脏有一定的损害，限制其长期的临床应用，因此人们越来越倾向于寻找天然来源的降血脂物质，药食同源降血脂食品因食用安全、几乎无毒副作用，成为降脂研究领域的热点，大豆肽在降血脂食品中已有广泛应用。
海洋是生物资源的宝库，海洋生态环境复杂多变，独特的环境赋予海洋生物独特的结构和生理活性，其中也包含许多结构新颖、活性显著的活性肽序列。牡蛎是世界第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。牡蛎含有丰富的营养物质，牡蛎蛋白氨基酸组成完全，尤其是含有丰富的牛磺酸，质量优于牛乳和人乳，素有“海中牛奶”之称，牡蛎不仅营养丰富，而且具有独特的生理保健功能和药用价值，被我国卫生部批准第一批列为既是药品又可作为食品的保健品之一。随着生物酶制剂及酶工程产业的发展，利用生物酶水解牡蛎制备牡蛎肽成为近年来研究热点，牡蛎肽保留了牡蛎原有的维生素、牛磺酸等营养成份，可不需消化或稍加消化即可吸收，更容易被吸收利用和发挥生物功能，现代医学研究表明，牡蛎肽具有抗氧化、降血压、降血糖、增强免疫力、抗肿瘤等多种生物活性，但牡蛎肽在降血脂方面的研究应用未见报道。
现有技术中虽然有多种牡蛎肽的制备方法，但是目前公开的牡蛎肽及其制备方法存在如下技术问题：
1)蛋白酶均采用游离蛋白酶，需要高温、强酸&强碱等灭酶工艺处理，而灭酶工艺通常会引起水解液发生系列生化反应，不仅容易颜色褐变，影响产品色泽和品质，还容易产生有害物质。
2)牡蛎酶解液腥味较重、颜色深，需要专门的脱色去腥工艺处理，容易引起产品损失，收率降低。
3)大豆活性肽是指大豆蛋白经蛋白酶水解、分离纯化等处理后得到的一种由3～6个氨基酸组成的小分子量低聚肽混合物，平均分子量小于1000Da，主要分布于300-700Da，其生理活性取决于相对分子质量大小及氨基酸序列。由2-3个氨基酸组成的大豆蛋白二肽、三肽(分子量200-300Da)，具有抑制肠道内胆固醇的吸收，刺激甲状腺素的分泌增加，促进胆汁酸化并排出体外，能降低血脂的浓度和粘稠度，防止血凝块的产生和破坏血凝块，从而达到抗血栓形成、降低血清胆固醇和调节血脂的目的，但大豆肽苦味大，影响了其在功能产品中的开发应用。海洋来源活性牡蛎肽在抗氧化、降血压、降血糖、促进生长发育等活性功能研究较多，但牡蛎活性肽的降血脂功能研究应用较少，利用生物转化技术制备高活性降血脂牡蛎肽未见报道，严重限制了牡蛎活性肽在功能食品与食品中应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种具有降血脂功能的牡蛎肽及其制备方法和应用。本发明采用固定化复合蛋白酶水解牡蛎蛋白制备牡蛎肽，并利用生物转化技术对牡蛎肽进行结构修饰，提高牡蛎肽的降血脂活性，可以应用于食品、保健食品及药品的研发，具有广阔的研究应用前景。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
一种具有降血脂功能的牡蛎肽的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将新鲜牡蛎浸泡脱盐，然后洗净、脱壳、去内脏得脱盐牡蛎肉，将脱盐牡蛎肉匀浆得牡蛎浆液；
(2)向牡蛎浆液中加水，然后加入复合蛋白酶，保温酶解，离心得到的上清液即为牡蛎酶解液；
(3)将牡蛎酶解液用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜超滤，收集滤出液，将滤出液浓缩得浓缩液；
(4)向浓缩液中加入含硫氨基酸和木瓜蛋白酶，保温反应，离心得到修饰牡蛎肽；
(5)将修饰牡蛎肽喷雾干燥得牡蛎肽。
进一步的，所述步骤(2)中复合蛋白酶占脱盐牡蛎肉的重量比为0.2-1‰。
进一步的，所述步骤(2)中复合蛋白酶包括胰酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶，胰酶：木瓜蛋白酶：风味蛋白酶的重量比为3～5∶1∶1～2。
进一步的，所述步骤(2)中复合蛋白酶为壳聚糖固定化复合蛋白酶；所述壳聚糖固定化复合蛋白酶为壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶或磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶。
进一步的，所述步骤(3)中浓缩液中可溶性固形物含量为10-50％。
进一步的，所述步骤(4)中含硫氨基酸占脱盐牡蛎肉的重量比为0.1-0.8‰，木瓜蛋白酶占脱盐牡蛎肉的重量比为0.2-1‰。
进一步的，所述步骤(4)中所述含硫氨基酸为甲硫氨酸、半胱氨酸、胱氨酸中的一种或多种。
本发明提供了所述的制备方法制得的牡蛎肽，所述牡蛎肽中分子量小于1000道尔顿的成分占80％以上，所述牡蛎肽中蛋白含量大于80％，灰分含量小于7％。
本发明还提供了所述的牡蛎肽在制备降血脂牡蛎肽功能产品中的应用。
进一步的，所述牡蛎肽功能产品能够降低TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平。
进一步的，所述步骤(2)酶解的温度为40-55℃，pH为6-8，时间为3-6小时。
进一步的，所述步骤(2)中复合蛋白酶为磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶。
进一步的，所述步骤(3)中浓缩的具体方法为：将滤出液用截留分子量为200-300Da的纳滤膜纳滤得到浓缩液或将滤出液减压浓缩得到浓缩液。
进一步的，所述步骤(4)中保温反应温度为35-50℃，pH为5.5-7.5，时间为1-2小时。
进一步的，所述步骤(4)中木瓜蛋白酶为壳聚糖固定化木瓜蛋白酶，壳聚糖固定化木瓜蛋白酶为壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶或磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶。
进一步的，所述牡蛎肽功能产品的剂型为口服液、胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、粉剂或颗粒剂。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
本发明利用壳聚糖固定化复合蛋白酶精准高效水解牡蛎蛋白，兼具蛋白酶水解与壳聚糖脱色去腥功能，不需要高温、强酸、强碱等灭酶工艺和单独的脱色去腥工艺，避免灭酶工艺引起的颜色褐变及副产物产生。本工艺简单温和，能耗低，蛋白酶可重复利用，生产成本低，适合于工业化生产。
本发明制备的牡蛎肽蛋白含量高，而且基本完全保留牡蛎本身的牛磺酸、维生素等营养功效成分，感官风味优良，经过修饰反应可增加牡蛎肽中含硫氨基酸含量，通过生物代谢可转化为牛磺酸等降血脂活性物质，显著提高牡蛎肽的降血脂活性。本发明在牡蛎肽本身具有的生物活性物质和生物活性功能基础上，创造性的通过生物转化技术赋予牡蛎肽独特的降血脂活性，而且感官风味优良，与已有大豆活性肽等活性蛋白肽相比在质量、风味等方面具有明显优势，可以广泛应用于保健食品或食品开发，具有广阔的研究应用前景。
附图说明
图1为牡蛎肽分子量与分子量分布示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。如无特别说明，本发明所述浓度均为质量体积浓度。
在本发明中，蛋白酶活力采用GB23527蛋白酶制剂中规定的福林法测定，蛋白酶活力以蛋白酶活力单位表示，定义为1g固体酶粉，在一定温度和pH条件下，1min水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g表示。蛋白含量采用凯氏定氮法测定。氨基酸态氮含量采用中性甲醛滴定法测定。
水解度计算公式为：
Figure BDA0002491619910000041
蛋白回收率计算公式为：
Figure BDA0002491619910000042
实施例1：壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶和壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶的制备
将200g壳聚糖溶解在10L 1％的乙酸溶液中，高速搅拌混匀至壳聚糖完全溶解。将壳聚糖溶液缓慢滴入30L 1mol/L的氢氧化钠溶液中，搅拌反应1h，得到大小形成均匀的颗粒，用纯化水洗涤壳聚糖微球至中性，静置收集微球；将微球加入到10L 0.2％戊二醛溶液(w/v)中，在室温下搅拌反应3-5小时，收集壳聚糖微球，用纯化水洗涤壳聚糖微球至中性，然后50℃真空干燥得到壳聚糖微粒。
蛋白酶固定化：将重量比为3.5∶1∶1.5(w∶w∶w)的胰酶：木瓜蛋白酶∶风味蛋白酶混合均匀得到复合蛋白酶。取10g复合蛋白酶和10g木瓜蛋白酶分别溶解于1L5mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，然后分别将100g壳聚糖微粒加入到蛋白酶溶液中，20℃搅拌反应6小时进行固定。静置收集壳聚糖微粒，用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，分别得壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶和壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶，4℃下保存备用。分别计算初始蛋白含量和游离蛋白含量，得到壳聚糖微粒的蛋白酶负载能力约为0.095g/g，固定化酶活力回收率约为90％，固定化效率高。
实施例2.磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶和磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶的制备
将100g壳聚糖溶解在10L 5％的乙酸溶液中，然后将100g Fe3O4颗粒加入到壳聚糖溶液中，高速搅拌混匀，制备Fe3O4-壳聚糖混合物；将Fe3O4-壳聚糖混合物缓慢滴加到30L矿物油(含1％tween 80)中，高压均质机均质乳化得到Fe3O4-壳聚糖乳液。将500mL戊二醛溶液(25％，w/v)加入到乳液中，在室温下搅拌反应3-5小时，用永磁体将制备的磁性Fe3O4-壳聚糖微粒从反应混合物中分离出来，依次用丙酮、纯化水洗涤微粒，然后50℃真空干燥得到磁性Fe3O4-壳聚糖微粒。
蛋白酶固定化：将重量比为4∶1∶1(w∶w∶w)的胰酶：木瓜蛋白酶∶风味蛋白酶混合均匀得到复合蛋白酶。取10g复合蛋白酶和10g木瓜蛋白酶分别溶解于10L5mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中，然后分别将100g磁性Fe3O4-壳聚糖微粒加入到蛋白酶溶液中，20℃搅拌反应6小时进行固定。通过永磁体吸附收集固定化酶磁性Fe3O4-壳聚糖微粒，用磷酸盐缓冲液洗涤2-3次，得磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶和磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶，4℃下保存备用。分别计算初始蛋白含量和游离蛋白含量，得到磁性Fe3O4-壳聚糖微粒的蛋白酶负载能力约为0.1g/g，固定化酶活力回收率高达95％，固定化效率高。
实施例3：壳聚糖微粒固定化蛋白酶酶解制备牡蛎肽
向250kg新鲜牡蛎中加入500kg清水，浸泡0.7小时，然后将水放掉；重复用清水浸泡3次得脱盐牡蛎；将脱盐牡蛎脱壳，去内脏得脱盐牡蛎肉，用组织捣碎机将脱盐牡蛎肉匀浆得牡蛎浆液。
向20kg牡蛎浆液中加入20L水混合均匀，调节牡蛎浆液温度为48℃，pH 6.8，搅拌下加入实施例1制备的壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶60g(含复合蛋白酶5.7g)，保温反应4小时，反应结束迅速冷却至室温，10000rpm离心10分钟去除未降解固形物和固定化酶，收集上清液即为牡蛎酶解液。酶解液水解度为27.5％，可溶性蛋白回收率为65.2％。
将牡蛎酶解液用孔径为0.45um过滤膜过滤，然后用截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，收集超滤滤出液；然后将超滤滤出液用截留分子量为200-300Da的纳滤膜纳滤，浓缩至可溶性固形物含量为35％的浓缩液。取少量浓缩液喷雾干燥得牡蛎肽中间产品。牡蛎肽中间产品蛋白含量80.1％，灰分含量5.9％。
调节浓缩液温度38℃，pH 6.0，搅拌下加入半胱氨酸6g和实施例1制备的壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶60g(含木瓜蛋白酶5.7g)，保温反应2小时，反应结束迅速冷却至室温，10000rpm离心10分钟去除固形物和酶，收集上清液即为修饰牡蛎肽。将修饰牡蛎肽溶液喷雾干燥得牡蛎肽粉。收集牡蛎肽0.57kg，收率较高，蛋白含量为81.5％，灰分含量为6.1％。
实施例4：磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化蛋白酶酶解制备牡蛎肽
向250kg新鲜牡蛎中加入500kg清水，浸泡1小时，然后将水放掉；重复用清水浸泡2次得脱盐牡蛎；将脱盐牡蛎脱壳，去内脏得脱盐牡蛎肉，用组织捣碎机将脱盐牡蛎肉匀浆得牡蛎浆液。
向20kg牡蛎浆液中加入40L水混合均匀，调节牡蛎浆液温度为50℃，pH 7.0，搅拌下加入实施例2制备的磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶100g(含复合蛋白酶10g)，保温反应5小时，反应结束迅速冷却至室温，10000rpm离心10分钟去除未降解固形物和固定化酶，上清液即为牡蛎酶解液。酶解液水解度为29.2％，可溶性蛋白回收率为72.5％。
将牡蛎酶解液用孔径为0.45um过滤膜过滤，然后用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜超滤，收集滤出液；将滤出液在50℃减压浓缩至可溶性固形物含量为25％的浓缩液。取少量浓缩液喷雾干燥得牡蛎肽中间产品。牡蛎肽中间产品蛋白含量81.2％，灰分含量6.5％。
调节浓缩液温度42℃，pH 7.0，搅拌下加入甲硫氨酸10g和实施例2制备的磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶100g(含木瓜蛋白酶10g)，保温反应1小时，迅速冷却至室温，10000rpm离心10分钟去除固形物和酶，收集上清液即为修饰牡蛎肽溶液。将修饰牡蛎肽溶液喷雾干燥得牡蛎肽粉。收集牡蛎肽0.65kg，收率高，蛋白含量为84.5％，灰分含量为6.6％。
实验例5：牡蛎肽工艺质量比较
对比例1.复合蛋白酶酶解制备牡蛎肽
向250kg新鲜牡蛎中加入500kg清水，浸泡1小时，然后将水放掉；重复用清水浸泡2次得脱盐牡蛎；将脱盐牡蛎脱壳，去内脏得脱盐牡蛎肉，用组织捣碎机将脱盐牡蛎肉匀浆得牡蛎浆液。
向20kg牡蛎浆液中加入40L水混合均匀，调节牡蛎浆液温度为48℃，pH 7.0，搅拌下加入复合蛋白酶10g，保温反应5小时，反应结束后在95-100℃保温10分钟灭酶，灭酶结束迅速冷却到室温，10000rpm离心10分钟去除未降解固形物，上清液即为牡蛎酶解液。酶解液水解度为29.7％，可溶性蛋白回收率为68.4％。
将牡蛎酶解液用孔径为0.45um过滤膜过滤，然后用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜超滤，收集滤出液；将滤出液在50℃下减压浓缩至可溶性固形物含量为25％的浓缩液。取少量浓缩液喷雾干燥得牡蛎肽中间产品。牡蛎肽中间产品蛋白含量80.4％，灰分含量6.3％。
调节浓缩液温度40℃，pH 6.5，搅拌下加入甲硫氨酸10g和木瓜蛋白酶10g，保温反应1小时，反应结束后在95-100℃保温10分钟灭酶，10000rpm离心10分钟去除固形物，收集上清液即为修饰牡蛎肽。将修饰牡蛎肽溶液喷雾干燥得牡蛎肽粉。收集牡蛎肽0.61kg，收率较高，蛋白含量为82.6％，灰分含量为6.2％。
对比例2.复合蛋白酶酶解、活性炭吸附制备牡蛎肽
向250kg新鲜牡蛎中加入500kg清水，浸泡0.5小时，然后将水放掉；重复用清水浸泡3次得脱盐牡蛎；将脱盐牡蛎脱壳，去内脏得脱盐牡蛎肉，用组织捣碎机将脱盐牡蛎肉匀浆得牡蛎浆液。
向20kg牡蛎浆液中加入40L水混合均匀，调节牡蛎浆液温度为50℃，pH 7.5，搅拌下加入复合蛋白酶10g，保温反应5小时，反应结束后在95-100℃保温10分钟灭酶，灭酶结束迅速冷却到室温，10000rpm离心10分钟去除未降解固形物，上清液即为牡蛎酶解液。酶解液水解度为29.3％，可溶性蛋白回收率为69.5％。
调节酶解液温度55℃，pH6.5，加入1％的活性炭吸附1小时，依次用孔径为1um，0.45um的过滤膜过滤去除活性炭，收集脱色酶解液。
用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜超滤脱色后酶解液，收集滤出液；将滤出液在50℃下减压浓缩至可溶性固形物含量为25％的浓缩液。取少量浓缩液喷雾干燥得牡蛎肽中间产品。牡蛎肽中间产品蛋白含量65.4％，灰分含量6.5％。
调节浓缩液温度37℃，pH 6.0，搅拌下加入甲硫氨酸10g和木瓜蛋白酶10g，保温反应1小时，反应结束后在95-100℃保温10分钟灭酶，10000rpm离心10分钟去除固形物，收集上清液即为修饰牡蛎肽。将修饰牡蛎肽溶液喷雾干燥得牡蛎肽粉。收集牡蛎肽0.36kg，收率较低，蛋白含量为70.2％，灰分含量为6.9％。
将实施例4与对比例1、对比例2的牡蛎肽制备工艺进行研究，将制备的牡蛎肽中间产品，牡蛎肽产品的重量、感官风味、蛋白、灰分含量等指标进行研究，实验结果见表1。
表1.牡蛎肽质量指标
Figure BDA0002491619910000081
注：S4-1实施例4制备的牡蛎肽中间产品；S4-2实施例4制备的牡蛎肽产品；
B1-1对比例1制备的牡蛎肽中间产品；B1-2对比例1制备的牡蛎肽产品；
B2-1对比例2制备的牡蛎肽中间产品；B2-2对比例2制备的牡蛎肽产品；
实验结果表明：固定化复合蛋白酶与游离复合蛋白酶都可以高效降解牡蛎制备牡蛎肽，水解度较高。在投料量相同的情况下，实施例4通过壳聚糖固定化蛋白酶水解牡蛎蛋白制备的牡蛎肽收率高，与对比例1中采用游离蛋白酶制备的牡蛎肽收率相似，明显高于对比例通过活性炭脱色去腥工艺制备的牡蛎肽产品。通过固定化酶制备的牡蛎肽蛋白含量高于80％，与对比例1制备的牡蛎肽相似，高于对比例2制备的同等品质的牡蛎肽。原因可能是增加活性炭吸附工艺在脱色去腥的同时，也会吸附大量的肽，造成产品损失，收率和蛋白含量降低。
实施例4通过壳聚糖固定化蛋白酶降解牡蛎制备的牡蛎肽的感官风味与对比例2通过复合蛋白酶酶解、活性炭脱色工艺制备的牡蛎肽感官风味相似，明显优于对比例1中游离蛋白酶制备的牡蛎肽。原因可能是固定化酶水解牡蛎蛋白制备牡蛎肽，不需要单独的高温灭酶工艺，不会引起严重的褐变反应，颜色加深且产生大量副产物，而且在酶解的同时壳聚糖发挥吸附脱色去腥功能，可以显著改善产品的感官风味。
经过浸泡脱盐工艺处理牡蛎肉，通过本发明实施例与对比例制备的牡蛎肽灰分含量均低于7％，表明浸泡拖延工艺可行，可以显著降低产品灰分含量，提高产品品质。综上分析，本发明通过壳聚糖固定化复合蛋白酶酶解牡蛎制备牡蛎肽，可以高效降解牡蛎蛋白，产品收率高，蛋白含量高，产品感官风味优良，是一种优良的海洋蛋白肽资源。与公开技术相比，本发明技术可以显著改善产品质量与收率，具有明显的技术优势。
实施例6：牡蛎肽分子量测定
采用凝胶渗透色谱法(GPC)测定实施例4制备的牡蛎肽分子量与分子量分布，以使用TSKgel G2000 SWXL(300mm×7.8mm)色谱柱，流动相为乙腈：水：三氟乙酸＝40∶60∶0.05；流速为1.00mL/min，柱温：30℃，检测波长220nm，进样体积为10μL，以尿嘧啶(Mw：112.09)，还原型谷胱甘肽(Mw：307.32)，杆菌酶(Mw：1 422.69)，抑肽酶(Mw：6 511.44)，细胞色素C(Mw：12 384)做标准曲线，GPC软件分析测定牡蛎肽分子量，牡蛎肽分子量与分子量分布图谱见图1，数据见表2。
表2.牡蛎肽分子量与分子量分布
Figure BDA0002491619910000091
由图1和表2可知，实施例4制备的牡蛎肽重均分子量(Mw)为853Da，主要分布在300-1000Da之间。分子量低于1000Da的占牡蛎肽的83.5％，分子量在5000Da以下占99.3％，表明壳聚糖固定化复合蛋白酶酶解效果显著，获得的牡蛎肽分子量小，研究表明分子量是影响肠道对肽吸收能力最关键的因素，分子量小于1000Da的寡肽可以直接被吸收，且吸收速率是游离氨基酸的2倍左右，具有更高的营养价值和潜在的生物活性。
实施例7：降血脂牡蛎肽功能产品
称取将本发明实施例4制备的牡蛎肽粉45g，红曲10g，纳豆冻干粉25g，植物甾醇5g，辅料15g；将原辅料混合均匀，得中间产品，即牡蛎肽粉剂；将中间产品造粒，得牡蛎肽颗粒剂；将中间产品灌装胶囊，得牡蛎肽胶囊剂；将中间产品造粒、压片，得牡蛎肽片剂。
实验例8：牡蛎肽降血脂功能研究
取体重180±10g的雄性Wistar大鼠120只，在实验环境下先喂养基础饲料7天，按照体重均衡的原则分为12组，每组10只。然后按照表3分组给予饲料和实验样品。
表3.分组给予雄性Wistar大鼠饲料和灌胃方法
组别 饲料种类 灌胃方法
正常对照组(N) 基础饲料 每天灌胃蒸馏水
高脂饲料组(M) 高脂饲料 每天灌胃蒸馏水
阳性对照组(P) 高脂饲料 每天灌胃8mg/kg.bw洛伐他汀
牡蛎肽中间产品低剂量组(S1-L) 高脂饲料 每天灌胃0.5g/kg.bw牡蛎肽中间产品
牡蛎肽中间产品中剂量组(S1-M) 高脂饲料 每天灌胃1g/kg.bw牡蛎肽中间产品
牡蛎肽中间产品高剂量组(S1-H) 高脂饲料 每天灌胃2g/kg.bw牡蛎肽中间产品
牡蛎肽低剂量组(S2-L) 高脂饲料 每天灌胃0.5g/kg.bw牡蛎肽
牡蛎肽中剂量组(S2-M) 高脂饲料 每天灌胃1g/kg.bw牡蛎肽
牡蛎肽高剂量组(S2-H) 高脂饲料 每天灌胃2g/kg.bw牡蛎肽
牡蛎肽功能产品低剂量组(S3-L) 高脂饲料 每天灌胃0.5g/kg.bw牡蛎肽功能产品
牡蛎肽功能产品中剂量组(S3-M) 高脂饲料 每天灌胃1g/kg.bw牡蛎肽功能产品
牡蛎肽功能产品高剂量组(S3-H) 高脂饲料 每天灌胃2g/kg.bw牡蛎肽功能产品
注：高脂饲料配方为基础饲料79％、蛋黄粉10％、熟猪油10％、胆固醇1％，自行配制。
每组饲喂35天，自由饮水，每隔2天称量实验动物体重，实验结束禁食12小时，断尾取血，血液静置30min后，3000r/min离心15min，分离血清，按照南京建成生物工程研究所的试剂盒方法测定血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。
实验过程中实验大鼠体重变化见表4。
表4.实验大鼠体重及肝脏指数
组别 D0体重/g D35体重/g 肝脏指数(g/100g)
正常对照组(N) 195.26±8.25 <![CDATA[292.38±11.32<sup>*</sup>]]> <![CDATA[3.15±0.32<sup>*</sup>]]>
高脂饲料组(M) 194.40±9.42 318.78±14.15 3.66±0.21
阳性对照组(P) 193.85±7.86 <![CDATA[295.62±10.28<sup>*</sup>]]> <![CDATA[3.25±0.28<sup>*</sup>]]>
牡蛎肽中间产品低剂量组(S1-L) 196.32±8.57 312.75±12.24 3.56±0.18
牡蛎肽中间产品中剂量组(S1-M) 194.86±7.38 309.23±11.75 3.55±0.31
牡蛎肽中间产品高剂量组(S1-H) 193.82±9.20 310.32±13.11 3.48±0.17
牡蛎肽低剂量组(S2-L) 194.20±8.34 308.15±15.06 3.46±0.25
牡蛎肽中剂量组(S2-M) 196.22±7.32 301.54±11.43 3.41±0.23
牡蛎肽高剂量组(S2-H) 193.68±8.42 <![CDATA[297.82±13.64<sup>*</sup>]]> 3.28±0.19
牡蛎肽功能产品低剂量组(S3-L) 195.08±7.47 298.63±11.15 3.51±0.30
牡蛎肽功能产品中剂量组(S3-M) 194.42±8.66 <![CDATA[297.02±10.15<sup>*</sup>]]> 3.27±0.26
牡蛎肽功能产品高剂量组(S3-H) 195.51±8.22 <![CDATA[295.69±12.88<sup>*</sup>]]> <![CDATA[3.21±0.22<sup>*</sup>]]>
注：*表示与高脂饲料组差异显著(P＜0.05)
由表4可知，实验开始时(D0)各组大鼠体重无显著性差异(P＞0.05)，实验中，各组大鼠生长良好，体重稳定增加，实验结束时，高脂饲料组大鼠体重显著高于正常对照组，证明高脂饲料可引起大鼠肥胖；阳性药物组、S2-H组、S3-M组和S3-H组大鼠体重显著低于高脂饲料组(P＜0.05)，说明阳性药洛伐他汀、牡蛎肽高剂量组、牡蛎肽功能产品中、高剂量组可以控制高脂饮食大鼠体重。正常对照组、阳性对照组、牡蛎肽功能产品高剂量组肝脏指数显著低于高脂模型组(P＜0.05)，其余各组与高脂模型组差异不显著。
实验动物血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)4项血脂指标数据见表5。
表5.血清血脂水平
Figure BDA0002491619910000111
Figure BDA0002491619910000121
注：*表示与高脂饲料组差异显著(P＜0.05)，**表示与高脂饲料组差异极显著(P＜0.01)
由表5可知，与正常对照组相比，高脂饲料组大鼠血清TC、TG、LDL-C含量显著升高，HDL-C水平显著降低，证明模型诱导成功。阳性药物洛伐他汀可以极显著降低大鼠血清TC及LDL-C水平(P＜0.01)，同时显著降低TG水平(P＜0.05)并显著提高HDL-C水平(P＜0.05)。牡蛎肽中间产品高剂量组大鼠血清LDL-C水平显著低于高脂饲料组(P＜0.05)，血清TC、TG、HDL-C三项指标均有一定程度的改善，但不具有显著性(P＞0.05)；牡蛎肽低剂量组血清各项指标与高脂模型组无显著性差异(P＞0.05)，牡蛎肽中剂量组血清TC及LDL-C水平显著降低(P＜0.05)，牡蛎肽高剂量组血清TC、TG及LDL-C水平均显著降低(P＜0.05)，HDL-C水平提高，但与高脂模型组差异不具有统计学意义(P＞0.05)；S3低、中、高剂量组均有一定效果，且作用效果呈剂量依赖性，与高脂模型组相比，牡蛎肽功能产品低剂量组大鼠血清TC及LDL-C水平显著降低(P＜0.05)，牡蛎肽功能产品中、高剂量组大鼠TC和LDL-C水平均极显著降低(P＜0.01)，TG水平显著降低((P＜0.05)，牡蛎肽功能产品高剂量组大鼠血清HDL-C水平显著提高(P＜0.05)。
上述实验结果表明：牡蛎肽中间产品可以降低血脂指标，但效果不明显；牡蛎肽具有显著的降血脂效果，说明通过本发明生物转化技术提高了牡蛎肽的降血脂活性；本发明制备的牡蛎肽功能产品具有显著的降血脂功能，且具有剂量依赖性，表明牡蛎肽可以用于降血脂产品。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所表述的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种具有降血脂功能的牡蛎肽的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
（1）向250kg新鲜牡蛎中加入500kg清水，浸泡1小时，然后将水放掉；重复用清水浸泡2次得脱盐牡蛎；将脱盐牡蛎脱壳，去内脏得脱盐牡蛎肉，用组织捣碎机将脱盐牡蛎肉匀浆得牡蛎浆液；
（2）向20kg牡蛎浆液中加入40L水混合均匀，调节牡蛎浆液温度为50℃，pH 7.0，搅拌下加入磁性Fe3O4 -壳聚糖微粒固定化复合蛋白酶100g，其中含复合蛋白酶10g，保温反应5小时，反应结束迅速冷却至室温，10000rpm离心10分钟去除未降解固形物和固定化酶，上清液即为牡蛎酶解液；
所述复合蛋白酶是重量比为4∶1∶1的胰酶：木瓜蛋白酶∶风味蛋白酶混合均匀得到的；
（3）将牡蛎酶解液用孔径为0.45um过滤膜过滤，然后用截留分子量为1000道尔顿的超滤膜超滤，收集滤出液；将滤出液在50℃减压浓缩至可溶性固形物含量为25％的浓缩液；
（4）调节浓缩液温度42℃，pH 7.0，搅拌下加入甲硫氨酸10g和磁性Fe3O4-壳聚糖微粒固定化木瓜蛋白酶100g，其中含木瓜蛋白酶10g，保温反应1小时，迅速冷却至室温，10000rpm离心10分钟去除固形物和酶，收集上清液即为修饰牡蛎肽溶液；
（5）将修饰牡蛎肽喷雾干燥得牡蛎肽。
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