CN109517869A - 一种用固定化酶生产牡蛎ace抑制肽的方法 - Google Patents

一种用固定化酶生产牡蛎ace抑制肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用固定化酶生产牡蛎ACE抑制肽的方法，包括制备固定化木瓜蛋白酶、制备牡蛎蛋白溶液，然后利用二者生产牡蛎ACE抑制肽的步骤。采用这种固定化技术，酶活性收率高，固定化酶稳定性好，用该固定化酶生产牡蛎ACE抑制肽，可以回收并重复利用酶，降低生产成本。

Description

一种用固定化酶生产牡蛎ACE抑制肽的方法
技术领域
本发明涉及牡蛎ACE抑制肽的生产，具体地说是一种用固定化酶生产牡蛎ACE 抑制肽的方法。
背景技术
牡蛎是一种营养价值极高的海洋产品，自古以来牡蛎就因其营养保健性深受广大群众的喜爱。利用现代科学方法研究牡蛎生物活性成分的过程中，发现其氨基酸组成完善，特别是富含多种具有重要生理活性的氨基酸，具有如提高记忆力、增强机体免疫力、抗疲劳、抗氧化、降血压、降血脂、降血糖、保肝、利胆、明目等多种生物活性功能。因此牡蛎作为一种经济型贝类，其蛋白质在海洋保健食品和海洋药物开发上，具有极大的开发潜力。
近20年来，已有不少研究学者对牡蛎蛋白进行酶解，获取牡蛎寡肽，如抗HIV-1 寡肽、抗氧化寡肽和ACE抑制寡肽。ACE是一种Zn-依赖型、胞外分泌的二肽羧肽酶，其可将AngI转化为Ang II，Ang II与G-蛋白偶联受体ATR结合作用到靶细胞上，引起一系列升血压的过程。同时，ACE还能使一系列具有降血压作用的血管舒缓肽失活，引起机体血压的进一步升高。因此，ACE活性的抑制可有效的缓解高血压及其相关疾病。
目前已发现可利用木瓜蛋白酶酶解牡蛎蛋白生产牡蛎ACE抑制肽。但利用游离酶在酶解反应完成后无法回收，造成牡蛎ACE抑制肽的生产成本高，产品价格高，不利于工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一种用固定化酶生产牡蛎ACE抑制肽的方法，所述方法包括如下步骤：
①以过碘酸盐将木瓜蛋白酶氨基酸上的羟基氧化成醛基，并使醛基与具有游离氨基的固定化载体进行偶联反应，然后利用硼氢化钠对木瓜蛋白酶分子与固定化载体间形成的希夫碱进行还原反应，得到稳定的固定化木瓜蛋白酶；
②按5～3g:100ml的比例将牡蛎蛋白溶于水或pH4.5-6.0的弱酸性溶液，得牡蛎蛋白溶液；
③按照1～10g:100ml的比例将固定化木瓜蛋白酶与牡蛎蛋白溶液进行反应，讲解底物，产出牡蛎ACE抑制肽。
本发明的方法所采用的固定化介质价格低廉，固定化酶方法简单有效。采用这种技术生产牡蛎ACE抑制肽，可以回收并重复利用酶，降低生产成本。该方法采用固定化酶，适合间歇或连续等多种反应方式及搅拌、填充床或流化床、膜生物反应器等各种反应器，适应于规模化生产。
附图说明
本发明附图1幅：
图1为高碘酸钠加入量与酶活力保留的关系示意图。
具体实施方式
一种用固定化酶生产牡蛎ACE抑制肽的方法，包括“氧化-固定化-还原”三步法固定化木瓜蛋白酶，并利用该固定化酶生产牡蛎ACE抑制肽；
首先需要制备固定化木瓜蛋白酶，包括：以过碘酸盐将木瓜蛋白酶氨基酸上的羟基氧化成醛基，并使醛基与具有游离氨基的固定化载体进行偶联反应，然后利用硼氢化钠对木瓜蛋白酶分子与固定化载体间形成的希夫碱进行还原反应，得到稳定的固定化木瓜蛋白酶。
其中，所述的醛基通过下述步骤形成：在0.01～0.2M的pH3.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，0.5～5mg/ml的木瓜蛋白酶与5～50mM的过碘酸盐于室温下避光反应0.5～2 小时，然后按照反应体系体积加入0.25～0.4ml/ml的乙二醇后反应1～5分钟；反应结束后，反应体系于0～4℃用蒸馏水透析脱盐。
其中，所述的具有游离氨基的固定化载体的制备方法是：将固定化载体与耦联剂反应，使固定化介质表面具有游离氨基；所述反应在有机相或水相体系中进行，耦联剂与反应体系的比例为3～20g/100ml计，体系中耦联剂的用量为3-20％w/v，反应温度为20-110℃，反应时间5-24小时。所述耦联剂优选为氨丙基三乙氧基硅烷、环氧氯丙烷、戊二醛或聚乙烯亚胺。所述的固定化载体为无机或有机的多孔或微孔材料。选自分子筛、氧化铝、玻璃珠、吸附树脂或离子交换树脂。
其中，所述的偶联反应是：将具有游离氨基的固定化载体浸没于0.01～0.2M的 pH7.0～9.0的磷酸盐缓冲液液中，按照2～10mg酶/g载体的比例加入经氧化反应的木瓜蛋白酶，于0～25℃条件下反应2～24小时。
其中，所述的还原反应是：向前述反应后的体系中按照0.1～0.5g/100ml的比例加入硼氢化钠，室温反应30～60分钟，得到稳定的固定化木瓜蛋白酶。
其次，制备牡蛎蛋白溶液，按5～3g:100ml的比例将牡蛎蛋白溶于水或pH4.5-6.0的弱酸性溶液，得牡蛎蛋白溶液。
最后，按照1～10g:100ml的比例将固定化木瓜蛋白酶与牡蛎蛋白溶液进行反应，降解底物，产出牡蛎ACE抑制肽。反应可以在搅拌釜中进行间歇或连续搅拌反应，或是将固定化酶装入填充床或流化床或膜生物反应器中，将牡蛎蛋白溶液泵入反应器进行的间歇或连续反应。
与现有技术相比，本发明的固定化技术，酶活性收率高，固定化酶稳定性好，用该固定化酶生产牡蛎ACE抑制肽，可以回收并重复利用酶，降低生产成本。固定化木瓜蛋白酶可以重复使用，降低牡蛎ACE抑制肽的生产成本。并且固定化木瓜蛋白酶反应过程较游离酶反应过程操作灵活，可选择多种反应方式及反应器，有利于实现工业化生产。
下面通过实例对本发明的技术进一步说明。
实施例1：木瓜蛋白酶的活化
取木瓜蛋白酶溶解于0.1M，pH4.5醋酸盐缓冲液中，体系中木瓜蛋白酶量为2.5mg/ml，制成酶活性为3863U/ml的溶液，加入不同量的高碘酸钠(体系中过碘酸盐的用量为0-50mM)，室温下避光氧化1小时之后，每1ml溶液加入0.25ml乙二醇反应2分钟，反应结束后溶液在4℃用蒸馏水透析过夜。如图1所示，高碘酸钠加入量与酶活力保留的关系为在高碘酸钠用量在0-20mM范围时，酶活力保留较高(95％以上)，高碘酸钠用量在30-50mM范围是酶活力损失较大(酶活力保留79-65％)，但该条件下酶分子中产生的醛基量多。
实施例2：多孔氧化铝微球固定化木瓜蛋白酶
将预先脱水脱气的18目多孔氧化铝微球装入玻璃容器，加入30％(v/v)氨丙基三乙氧基硅烷甲苯溶液至浸没多孔氧化铝微球，加热使甲苯回流12h。取已反应完毕的多孔氧化铝微球，依次用甲苯、异丙醇、水洗涤，即为活化的多孔氧化铝微球。将已活化的多孔氧化铝微球和活化木瓜蛋白酶加入到磷酸盐缓冲液中(0.2M，pH7.8；酶浓度2mg/ml，总酶量6mg酶/克湿重活化的多孔氧化铝微球)，4℃反应24h，间歇搅拌，反应完成后，加入0.1％(W/V)硼氢化钠，室温反应40分钟，还原希夫碱，得到稳定的固定化木瓜蛋白酶。酶活收率30％。
实施例3：分子筛固定化木瓜蛋白酶
取分子筛，同实施例2方法活化，将已活化的分子筛和活化木瓜蛋白酶加入到磷酸盐缓冲液中(0.2M，pH7.8；酶浓度2mg/ml，总酶量4mg酶/克湿重活化的分子筛)，4℃反应24h，间歇搅拌，反应完成后，加入0.1％(W/V)硼氢化钠，室温反应40分钟，还原希夫碱，得到稳定的固定化木瓜蛋白酶。酶活收率20-30％。
实施例4：多孔玻璃珠固定化木瓜蛋白酶
取多孔玻璃珠同实施例3方法固定化木瓜蛋白酶，酶活收率20％。
实施例5：异丁烯酸酯交联树脂固定化木瓜蛋白酶
缩水甘油-异丁烯酸酯交联树脂，内表面经聚乙烯亚胺处理带有游离氨基 (ZH-HA，香港GeneRad Biotech laboratory Ltd提供)，取0.5克ZH-HA载体，加入到10ml0.1mol/L磷酸二氢钾溶液中(pH 7.8)，维持该pH值，静置1小时，过滤，抽干；将该载体加入到已活化的木瓜蛋白酶溶液中(2575单位酶溶于20mM/ml pH 7.8 磷酸盐缓冲液中)，室温，于低速摇床反应5小时；反应结束后用加入0.2％(W/V)硼氢化钠，室温反应20分钟，得到稳定的固定化木瓜蛋白酶。酶活收率23％。
实施例6：离子交换树脂固定化木瓜蛋白酶
取离子交换树脂D392，依次用乙醇，水，1N氢氧化钠，5％氯化钠，1N盐酸， 1N氢氧化钠，水清洗；脱气；将树脂悬浮于pH7.8，0.2M磷酸盐缓冲液中，加入已活化木瓜蛋白酶4℃反应24h，间歇搅拌，酶用量为5mg/ml树脂。
实施例7：固定化木瓜蛋白酶降解牡蛎蛋白反应1
在玻璃反应器中，将5-30g牡蛎蛋白溶于100ml的水或弱酸性溶液(pH4.5-6.0 的醋酸盐缓冲液)中，加入4ml实施例5所述的固定化木瓜蛋白酶，60℃搅拌反应 2h，20％以上的牡蛎蛋白被水解成具有ACE抑制活性的寡肽；反应液过滤回收固定化酶，用水清洗后重新投入反应器进行上述反应，50批操作之后，固定化酶仍保持了原有的催化活力。
实施例8：固定化木瓜蛋白酶降解牡蛎蛋白反应2
在不锈钢反应器中，将300g牡蛎蛋白溶于2000ml的水溶液中；将80ml实施例 5所述的固定化木瓜蛋白酶装入玻璃柱中，制成固定化酶柱；将牡蛎蛋白溶液泵入固定化酶柱进行反应，反应流出液回到不锈钢反应器中，如此循环反应，反应温度60℃，反应时间6h；反应完成后，放掉反应液，用水清洗固定化酶柱，重新开始上述反应；共进行14批反应，固定化酶活性仍保留80％以上。

Claims (10)

1.一种用固定化酶生产牡蛎ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
①以过碘酸盐将木瓜蛋白酶氨基酸上的羟基氧化成醛基，并使醛基与具有游离氨基的固定化载体进行偶联反应，然后利用硼氢化钠对木瓜蛋白酶分子与固定化载体间形成的希夫碱进行还原反应，得到稳定的固定化木瓜蛋白酶；
②按5～3g:100ml的比例将牡蛎蛋白溶于水或pH4.5-6.0的弱酸性溶液，得牡蛎蛋白溶液；
③按照1～10g:100ml的比例将固定化木瓜蛋白酶与牡蛎蛋白溶液进行反应，讲解底物，产出牡蛎ACE抑制肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的过碘酸盐为高碘酸钠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤②中的弱酸性溶液为醋酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定化载体无机或有机的多孔或微孔材料。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的固定化载体选自分子筛、氧化铝、玻璃珠、吸附树脂或离子交换树脂。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中醛基通过下述步骤形成：在0.01～0.2M的pH3.0～6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，0.5～5mg/ml的木瓜蛋白酶与5～50mM的过碘酸盐于室温下避光反应0.5～2小时，然后按照反应体系体积加入0.25～0.4ml/ml的乙二醇后反应1～5分钟；反应结束后，反应体系于0～4℃用蒸馏水透析脱盐。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中所述的具有游离氨基的固定化载体的制备方法是：将固定化载体与耦联剂反应，使固定化介质表面具有游离氨基；所述反应在有机相或水相体系中进行，耦联剂与反应体系的比例为3～20g/100ml计，体系中耦联剂的用量为3-20％w/v，反应温度为20-110℃，反应时间5-24小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述耦联剂为氨丙基三乙氧基硅烷、环氧氯丙烷、戊二醛或聚乙烯亚胺。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的偶联反应是：将具有游离氨基的固定化载体浸没于0.01～0.2M的pH 7.0～9.0的磷酸盐缓冲液液中，按照2～10mg酶/g载体的比例加入经氧化反应的木瓜蛋白酶，于0～25℃条件下反应2～24小时。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的还原反应是：向前述反应后的体系中按照0.1～0.5g/100ml的比例加入硼氢化钠，室温反应30～60分钟，得到稳定的固定化木瓜蛋白酶。
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