JPS61205483A - 細胞外酵素の安定化 - Google Patents
細胞外酵素の安定化Info
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- JPS61205483A JPS61205483A JP61046042A JP4604286A JPS61205483A JP S61205483 A JPS61205483 A JP S61205483A JP 61046042 A JP61046042 A JP 61046042A JP 4604286 A JP4604286 A JP 4604286A JP S61205483 A JPS61205483 A JP S61205483A
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- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
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- C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
微生物により触媒される方法（以後、微生物−触媒方法
と称す）は、精化学薬品（ファインケミカル）または特
殊化学薬品として知られる種々の化学物質の製造に特に
有用である。
と称す）は、精化学薬品（ファインケミカル）または特
殊化学薬品として知られる種々の化学物質の製造に特に
有用である。
微生物−触媒方法の最も重要な商業的応用は食品産業で
あるだろう。この種の方法の例は固定化グルコースイソ
メラーゼによって触媒される高フルクトース含量コーン
シロップ（ＨＦＣ８）の製造である。この方法はグルコ
ースを大体等モルずつのフルクトースとグルコースの混
合物に転化するものであり、以後この混合物ｉ １（Ｆ
ｅ２と称する。
あるだろう。この種の方法の例は固定化グルコースイソ
メラーゼによって触媒される高フルクトース含量コーン
シロップ（ＨＦＣ８）の製造である。この方法はグルコ
ースを大体等モルずつのフルクトースとグルコースの混
合物に転化するものであり、以後この混合物ｉ １（Ｆ
ｅ２と称する。
微生物−触媒方法によって製造されるその他の化学物質
の例は食品添加物として、動物飼料において、および医
薬品において有用なレーアミノ酸である。アミノ酸を製
造する場合、化学的合成法は往々にして発酵法よりも簡
単であるが、化学的方法はほとんど濱にアミノ酸のラセ
ミ混合物をもたらす。このラセミ混合物はその後生物学
的に活性なＬ−アミノ酸を得るために分割しなければな
らない。−万、微生物−触媒方法は主ＫＬ−アミノ酸を
生産するであろう、 多くの様々な微生物−触媒方法を触媒する酵素の固定化
は、一般に目的生産物の収量増加をもたらし且つ酵素の
一体性（ｉｎｔθｇｒｉｔ７ ） ｋ保つであろう。細
胞外酵素に関する固定化は、その酵素が生産物から都合
よく分離できて再使用できるように、酵素を物理的また
は化学的に封じ込めることである。化学安定剤による酵
素の安定化も酵素の一体性を保つ。酵素の固定化または
安定化は酵素がまた生存微生物（細胞内）に存在する間
に、または酵素が無細胞状態で存在する時に行うことが
できる。固定化または安定化方法はこれらの２つの酵素
の状態により変わるであろう。従って、細胞内酵素に有
効な固定化または安定化条件が必ずしも細胞外酵素に適
するとは限らず、またその逆も同様である。
の例は食品添加物として、動物飼料において、および医
薬品において有用なレーアミノ酸である。アミノ酸を製
造する場合、化学的合成法は往々にして発酵法よりも簡
単であるが、化学的方法はほとんど濱にアミノ酸のラセ
ミ混合物をもたらす。このラセミ混合物はその後生物学
的に活性なＬ−アミノ酸を得るために分割しなければな
らない。−万、微生物−触媒方法は主ＫＬ−アミノ酸を
生産するであろう、 多くの様々な微生物−触媒方法を触媒する酵素の固定化
は、一般に目的生産物の収量増加をもたらし且つ酵素の
一体性（ｉｎｔθｇｒｉｔ７ ） ｋ保つであろう。細
胞外酵素に関する固定化は、その酵素が生産物から都合
よく分離できて再使用できるように、酵素を物理的また
は化学的に封じ込めることである。化学安定剤による酵
素の安定化も酵素の一体性を保つ。酵素の固定化または
安定化は酵素がまた生存微生物（細胞内）に存在する間
に、または酵素が無細胞状態で存在する時に行うことが
できる。固定化または安定化方法はこれらの２つの酵素
の状態により変わるであろう。従って、細胞内酵素に有
効な固定化または安定化条件が必ずしも細胞外酵素に適
するとは限らず、またその逆も同様である。
本発明に工れば、細胞外酵素の安定化が、供給原料流ま
たは酵素を分子量が少なくとも５００ダルトンのカルボ
キシアルキル化ポリマーまたはホスホノアルキル化ポリ
マーと接触させることにより達成される。本明細曹では
、カルボキシメチル化ポリアミンとグルコースイソメラ
ーゼを使用して、Ｄ−グルコースｉＤ−フルクトースに
転化する方法を詳細に例示する。比較的高分子量のポリ
マーは、グルコース基質溶液からのポリマー安定剤の分
離を可能にするーこのことは、ポリマー安定剤を例えば
イオン父換樹脂を用いて基質から取り出す必要性を排除
する。試験により、カルボキシメチル化プリフロックＯ
−３１（ＰｕｒｉｆｌｏｃＯ−３１；二塩化エチレンと
エチレンイミンオリゴマー混合物とを反応させることに
より製造したボｌｊアミンポリマーに対するダウ・ケミ
カル社の商標名）の存在下におけるグルコースイソメラ
ーゼの半減期は７６０時間であるが、前記ポリマーの不
存在下でのグルコースイソメラーゼの半減期は１２．７
時間であることが見出された。酵素半減期におけるこの
明らかな差異は、本発明の有用性およびそれにより得ら
れる生産物の有用性をはっきりと示すものである。
たは酵素を分子量が少なくとも５００ダルトンのカルボ
キシアルキル化ポリマーまたはホスホノアルキル化ポリ
マーと接触させることにより達成される。本明細曹では
、カルボキシメチル化ポリアミンとグルコースイソメラ
ーゼを使用して、Ｄ−グルコースｉＤ−フルクトースに
転化する方法を詳細に例示する。比較的高分子量のポリ
マーは、グルコース基質溶液からのポリマー安定剤の分
離を可能にするーこのことは、ポリマー安定剤を例えば
イオン父換樹脂を用いて基質から取り出す必要性を排除
する。試験により、カルボキシメチル化プリフロックＯ
−３１（ＰｕｒｉｆｌｏｃＯ−３１；二塩化エチレンと
エチレンイミンオリゴマー混合物とを反応させることに
より製造したボｌｊアミンポリマーに対するダウ・ケミ
カル社の商標名）の存在下におけるグルコースイソメラ
ーゼの半減期は７６０時間であるが、前記ポリマーの不
存在下でのグルコースイソメラーゼの半減期は１２．７
時間であることが見出された。酵素半減期におけるこの
明らかな差異は、本発明の有用性およびそれにより得ら
れる生産物の有用性をはっきりと示すものである。
本発明の高分子化学安定剤は細胞外酵素と共に反応器内
に保持され得るが、より好ましくは酵素より上流で反応
器内に保持される。酵素と安定剤とを隔離すると、有意
に高い酵素半減期が得られる。
に保持され得るが、より好ましくは酵素より上流で反応
器内に保持される。酵素と安定剤とを隔離すると、有意
に高い酵素半減期が得られる。
固定化酵素をポリマーの保護層で包膜することにより、
その固定化酵素をさらに安定化することができる。この
付加的な酵素安定化は、より低いｐＨ（例えばｐＨ６〜
８．５）で実施される方法に対して特に有利である。
その固定化酵素をさらに安定化することができる。この
付加的な酵素安定化は、より低いｐＨ（例えばｐＨ６〜
８．５）で実施される方法に対して特に有利である。
グルコースイソメラーゼは米国特許第４３０８３４９号
、第１欄、２６〜３２行に記載されるように多数の微生
物によって産生される。前記特許のアングラリエラ菌種
（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ ５ｐｅｃｉｅｓ ）ハ
特に優れ友グルコースイソメラーゼ産生菌であることが
見出された。一般に入手可能な当分野で知られた他の多
くのグルコースイソメラーゼ産生菌を使用して、グルコ
ースイソメラーゼを産生させることも可能である。
、第１欄、２６〜３２行に記載されるように多数の微生
物によって産生される。前記特許のアングラリエラ菌種
（Ａｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ ５ｐｅｃｉｅｓ ）ハ
特に優れ友グルコースイソメラーゼ産生菌であることが
見出された。一般に入手可能な当分野で知られた他の多
くのグルコースイソメラーゼ産生菌を使用して、グルコ
ースイソメラーゼを産生させることも可能である。
細胞外酵素は、好ましくは、本発明の高分子化学安定剤
から隔離される。本発明の高分子化学安定剤は、分子量
が少なくとも５００ダルトンのカルボキシアルキル化ポ
リマーまたはホスホノアルキル化ポリマーである。カル
ボキシアルキル化およびホスホノアルキル化は当分野で
よく知られており、例えば米国特許第３４２４７９０号
〔カルボキシメチル化ポリエチレンイミン（ＣＭ−ＰＫ
工）の製造方法を開示している〕およびウェスターバッ
ク（Ｗｅｓｔｅｒｂａｃｋ ）らのジャーナＡ／ａオプ
−７０ｈｅｍ、Ｓｏｃ、）８７．２５６７（１９６５）
’に参照されたい。上記のアルキルは−（ＯＨ２）：、
ｔ−（ここでｎ＝１〜３、好ましくはｎ＝１ ）ま比は
−（ＯＨＲ） −（ＯＨ，−一（ここでＲ＝メチル、エ
チル、プロピルまたはイングロビル、およびｎ ＝ ｌ
または２）である。
から隔離される。本発明の高分子化学安定剤は、分子量
が少なくとも５００ダルトンのカルボキシアルキル化ポ
リマーまたはホスホノアルキル化ポリマーである。カル
ボキシアルキル化およびホスホノアルキル化は当分野で
よく知られており、例えば米国特許第３４２４７９０号
〔カルボキシメチル化ポリエチレンイミン（ＣＭ−ＰＫ
工）の製造方法を開示している〕およびウェスターバッ
ク（Ｗｅｓｔｅｒｂａｃｋ ）らのジャーナＡ／ａオプ
−７０ｈｅｍ、Ｓｏｃ、）８７．２５６７（１９６５）
’に参照されたい。上記のアルキルは−（ＯＨ２）：、
ｔ−（ここでｎ＝１〜３、好ましくはｎ＝１ ）ま比は
−（ＯＨＲ） −（ＯＨ，−一（ここでＲ＝メチル、エ
チル、プロピルまたはイングロビル、およびｎ ＝ ｌ
または２）である。
高分子電解質（高分子化学安定剤）は完全にまたは部分
的にカルボキシメチル化される。高分子電解質の修飾量
（例えばポリエチレンイミンのカルボキンメチル化量）
は高分子電解質の０．１〜２．０当量の範囲でありうる
。これは異なる量のクロル酢酸（ｐＥ工全全窒素含量０
．１〜２．０当量）を高分子電解質と反応させることに
エリ達成される。
的にカルボキシメチル化される。高分子電解質の修飾量
（例えばポリエチレンイミンのカルボキンメチル化量）
は高分子電解質の０．１〜２．０当量の範囲でありうる
。これは異なる量のクロル酢酸（ｐＥ工全全窒素含量０
．１〜２．０当量）を高分子電解質と反応させることに
エリ達成される。
カルボキシメチル化の程度は、クロル酢酸対高分子電解
質の全窒素含量の比に比例する。
質の全窒素含量の比に比例する。
上記のように修飾されうる本発明の範囲内のポリマーは
陽イオン性高分子電解質として分類され、例えばポリア
ミン顕（第一、第二、第三および第四アミン類）；ポリ
リシンのようなポリアミノ酸類；ポリジメチルアミノプ
ロピルメタクリルアミドのような陽イオン性ポリアクリ
ルアミド類；トリエチレンテトラミンでアミン化され友
ポリ（塩化ビニル）のような陽イオン性ポリ（塩化ビニ
ル）；スチレン−ジメチルアミノプロピルメタクリルア
ミド（５０：５０）コポリマーのような陽イオン性コポ
リマー類；およびプリフロックＣ−３１のような陽イオ
ン性凝結剤である。ここに記載の方法に使用して、グル
コースイソメラーゼを安定化することが立証され友カル
ボキシメチル化高分子物質の例を表■に示す。
陽イオン性高分子電解質として分類され、例えばポリア
ミン顕（第一、第二、第三および第四アミン類）；ポリ
リシンのようなポリアミノ酸類；ポリジメチルアミノプ
ロピルメタクリルアミドのような陽イオン性ポリアクリ
ルアミド類；トリエチレンテトラミンでアミン化され友
ポリ（塩化ビニル）のような陽イオン性ポリ（塩化ビニ
ル）；スチレン−ジメチルアミノプロピルメタクリルア
ミド（５０：５０）コポリマーのような陽イオン性コポ
リマー類；およびプリフロックＣ−３１のような陽イオ
ン性凝結剤である。ここに記載の方法に使用して、グル
コースイソメラーゼを安定化することが立証され友カル
ボキシメチル化高分子物質の例を表■に示す。
表１
グルコースイソメラーゼの高分子化学安定剤＊＊
ＣＭ−プリフロックＣ！−３１７６０
ＣＭ−ＰＥＯＸ
（９５％加水分解） １０３２ンイ
ミン製品である。
ミン製品である。
ている。
固定化酵素の包膜（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）は酵
素の安定性を非゛イに高める。酵素の包膜に使用できる
ポリマーは、酵素の安定化に関してここで開示したもの
と同じポリマーである。
素の安定性を非゛イに高める。酵素の包膜に使用できる
ポリマーは、酵素の安定化に関してここで開示したもの
と同じポリマーである。
本発明を実施する場合、酵素は粗製破壊物から９５％以
上のタンパク質（グルコースイソメラーゼ）までのいろ
いろな純度状態において使用できる。
上のタンパク質（グルコースイソメラーゼ）までのいろ
いろな純度状態において使用できる。
本発明の高分子化学安定剤を使用してＤ−グルコースを
Ｄ−フルクトースに転化する好適な方法において、安定
剤は連続攪拌−タンク反応器の出口に限外濾過膜を設け
ることにより酵素エリも上流でその反応器内に保持され
る。この膜は高分子安定剤を保持するのに十分小さな孔
サイズのものでなければならない。基質原料流（例えば
グル１−ス）は本発明の高分子安定剤を収容し次反応器
内を通過する。安定剤は膜によって反応器中に保持され
、原料流は圧力勾配によって膜全強制通過される。アミ
コ／・グイアフロＰＭ −３０（ＡｍｉｃｏｎＤｉａｆ
ｌｏ ＰＭ −３０； ？サチューセッツ州、デンバー
ズ、アミコン社の商標名）膜および類似の膜が本発明方
法において便用できる。その後、原料流は酵素（例えば
グルコースイソメラーゼ）を収容し友第二反応器を通過
する。有利には、酵素は上記のように包膜される。酵素
がグルコースの一部分をフルクトースに転化し、このグ
ルコース／フルクトース混合物が上記のように第二の膜
を通過する。
Ｄ−フルクトースに転化する好適な方法において、安定
剤は連続攪拌−タンク反応器の出口に限外濾過膜を設け
ることにより酵素エリも上流でその反応器内に保持され
る。この膜は高分子安定剤を保持するのに十分小さな孔
サイズのものでなければならない。基質原料流（例えば
グル１−ス）は本発明の高分子安定剤を収容し次反応器
内を通過する。安定剤は膜によって反応器中に保持され
、原料流は圧力勾配によって膜全強制通過される。アミ
コ／・グイアフロＰＭ −３０（ＡｍｉｃｏｎＤｉａｆ
ｌｏ ＰＭ −３０； ？サチューセッツ州、デンバー
ズ、アミコン社の商標名）膜および類似の膜が本発明方
法において便用できる。その後、原料流は酵素（例えば
グルコースイソメラーゼ）を収容し友第二反応器を通過
する。有利には、酵素は上記のように包膜される。酵素
がグルコースの一部分をフルクトースに転化し、このグ
ルコース／フルクトース混合物が上記のように第二の膜
を通過する。
ｐ−グルコースｔ−ツーフルクトースに転化する方法の
パラメーターは次の通りである。
パラメーターは次の通りである。
反応器温度 ５０〜１００℃平均滞留時間
０．０５〜６時間原料流の圧力
０．１〜１００ ｐｓｉ（０，６８９憫８９．４７５７
ＫＰａ ）グルコース原料の濃度 １０〜６０％（
重量／容量）Ｍｇ の濃度 ０１１〜２０
ｍＭ原料流のｐＨ５，０〜９．０ ポリマ一分子量 ５００ダルトン以上上記温度よ
り低い反応器温度では酵素が触媒作用を行わず、またこ
れより高い温度では酵素が変性される。滞留時間は醇累
負荷の関数である。開業的応用においては、少なくとも
４２％のグルコースをフルクトースに異性化するのに十
分長い滞留時間でなければならないが、糖の分解を避け
るために不必要に長い滞留時間であってはならない。
０．０５〜６時間原料流の圧力
０．１〜１００ ｐｓｉ（０，６８９憫８９．４７５７
ＫＰａ ）グルコース原料の濃度 １０〜６０％（
重量／容量）Ｍｇ の濃度 ０１１〜２０
ｍＭ原料流のｐＨ５，０〜９．０ ポリマ一分子量 ５００ダルトン以上上記温度よ
り低い反応器温度では酵素が触媒作用を行わず、またこ
れより高い温度では酵素が変性される。滞留時間は醇累
負荷の関数である。開業的応用においては、少なくとも
４２％のグルコースをフルクトースに異性化するのに十
分長い滞留時間でなければならないが、糖の分解を避け
るために不必要に長い滞留時間であってはならない。
原料流の最低圧力は限外濾過を行う几めに必要であり、
そして必要とされる滞留時間、特定の膜、および原料流
の粘度により決定される。最高圧力は反応器の圧力限界
により決定される。原料流のグルコース濃度は水および
処理容量の節約のために出来るだけ高い方がよいが、粘
度または拡散率が反応器の性能を制限する場合はより低
い濃度も使用できる。高分子安定剤の濃度は経済的理由
から最小限に抑えるべきであるが、酵素を安定化する濃
度で存在しなければならない。マグネシウムイオンは一
般に酵素活性にとって必要であるが、経済性のために最
小限にすべきである。例えば硫酸マグネシウムや燐酸マ
グネシウムのような適当な塩が使用されろ。ｐＨは酵素
活性および安定性の友めに適度でなければならない。高
分子安定剤の分子量はその固定化および生産物からの分
離を容易にするように十分大きくなければならない。
そして必要とされる滞留時間、特定の膜、および原料流
の粘度により決定される。最高圧力は反応器の圧力限界
により決定される。原料流のグルコース濃度は水および
処理容量の節約のために出来るだけ高い方がよいが、粘
度または拡散率が反応器の性能を制限する場合はより低
い濃度も使用できる。高分子安定剤の濃度は経済的理由
から最小限に抑えるべきであるが、酵素を安定化する濃
度で存在しなければならない。マグネシウムイオンは一
般に酵素活性にとって必要であるが、経済性のために最
小限にすべきである。例えば硫酸マグネシウムや燐酸マ
グネシウムのような適当な塩が使用されろ。ｐＨは酵素
活性および安定性の友めに適度でなければならない。高
分子安定剤の分子量はその固定化および生産物からの分
離を容易にするように十分大きくなければならない。
高分子化学安定剤またはグルコースイソメラーゼは限外
ｆ過装置、微孔性支持体またはカプセルの中に封じ込め
ることにより固定化される。安定剤は樹脂ビーズや膜の
ような支持体に共有結合により付着することができる。
ｆ過装置、微孔性支持体またはカプセルの中に封じ込め
ることにより固定化される。安定剤は樹脂ビーズや膜の
ような支持体に共有結合により付着することができる。
グルコースイソメラーゼはイオン変換樹脂ビーズ、膜、
キレート化樹脂または金属含有担体（例えばシリカまた
はアルミナ）のようなイオン交換材料にイオンの相互作
用により結合される。これらの方法は全て当分野におい
てよく知られている。
キレート化樹脂または金属含有担体（例えばシリカまた
はアルミナ）のようなイオン交換材料にイオンの相互作
用により結合される。これらの方法は全て当分野におい
てよく知られている。
ま友、ポリマー安定剤は当分野で周知の方法全便ってそ
のポリマーを架橋して不溶性ビーズ全形成することによ
り、樹脂に変換できる。不溶性の細胞外酵素粒子と高分
子安定剤粒子とを一緒に混合して、塔反応器内で使用す
ることができる。
のポリマーを架橋して不溶性ビーズ全形成することによ
り、樹脂に変換できる。不溶性の細胞外酵素粒子と高分
子安定剤粒子とを一緒に混合して、塔反応器内で使用す
ることができる。
先に述べたように、高分子化学安定剤全酵素から隔離す
ることは、酵素の半減期を高め且つより効率の工い酵素
転化方法をもｔらすので、安定剤の使用にとって好まし
い方法である。
ることは、酵素の半減期を高め且つより効率の工い酵素
転化方法をもｔらすので、安定剤の使用にとって好まし
い方法である。
次の実施例は本発明の方法および生産物を例示するもの
である。特に指定しない限り、全ての百分率は重量基準
であり、全ての溶媒混合物の割合は容量基準である。
である。特に指定しない限り、全ての百分率は重量基準
であり、全ての溶媒混合物の割合は容量基準である。
イオン変換樹脂のダウエックスＭＷＡ −１（Ｄｏｗｅ
ｘＭＷＡ −１；マクロ孔性弱塩基性陰イオン変換樹脂
に対するダウ・ケミカル社の商標名）２００Ｆ（湿潤）
をメタノール１ｆｔ、水２００ｍｌ、 １．ＯＮ塩酸Ｚ
ｏｏｍ／および再度水１２で洗った。洗浄樹脂を振とう
浴中６０℃、 １５０ ｒｐｍにおいて燐酸ナトリウム
緩衝液Ｉｎ（０，１Ｍ＋ｐＨ７−０）中で２４時間平衡
化した。新しい緩衝液を用いてこの方法を２回以上繰り
返した。最後に、洗浄物のｐＨは約６．９であつ几。そ
の後、樹脂金ガラスｒ過器（丸目）上に集め、同じ緩衝
液５００ｒｘｌで洗い、吸引により乾燥した。
ｘＭＷＡ −１；マクロ孔性弱塩基性陰イオン変換樹脂
に対するダウ・ケミカル社の商標名）２００Ｆ（湿潤）
をメタノール１ｆｔ、水２００ｍｌ、 １．ＯＮ塩酸Ｚ
ｏｏｍ／および再度水１２で洗った。洗浄樹脂を振とう
浴中６０℃、 １５０ ｒｐｍにおいて燐酸ナトリウム
緩衝液Ｉｎ（０，１Ｍ＋ｐＨ７−０）中で２４時間平衡
化した。新しい緩衝液を用いてこの方法を２回以上繰り
返した。最後に、洗浄物のｐＨは約６．９であつ几。そ
の後、樹脂金ガラスｒ過器（丸目）上に集め、同じ緩衝
液５００ｒｘｌで洗い、吸引により乾燥した。
酵素全固定化するために、洗浄樹脂１３０ｙ’にグルコ
ースイソメラーゼ溶液（ＩＩＧＩＵ／ａｔの活性を有す
る；１．ＧＩＵは標準検定条件下１分あ７’Ｃ９１マイ
クロモルのグルコースのフルクトースへの異性化全触媒
するグルコースイソメラーゼ（Ｇ工）活性として定義さ
れる）１５００ｓｄの中ニ加工た。２．８２の７エルン
バツハフラスコ中のこのスラリー′Ｉ＆：６０℃、 １
５０ ｒｐｍで３０時間インキュベートした。終了時に
、固定化の完成を調べるために上清のＧＩ活性を検定し
た。上清は０．０４Ｇ工Ｕ／ｄ、すなわち初期活性の４
％であることが見出されｆｃ、ＭＷＡ−１固定化Ｇ工を
ガラスｆ過器上に集め、水１２で洗い、吸引乾燥した。
ースイソメラーゼ溶液（ＩＩＧＩＵ／ａｔの活性を有す
る；１．ＧＩＵは標準検定条件下１分あ７’Ｃ９１マイ
クロモルのグルコースのフルクトースへの異性化全触媒
するグルコースイソメラーゼ（Ｇ工）活性として定義さ
れる）１５００ｓｄの中ニ加工た。２．８２の７エルン
バツハフラスコ中のこのスラリー′Ｉ＆：６０℃、 １
５０ ｒｐｍで３０時間インキュベートした。終了時に
、固定化の完成を調べるために上清のＧＩ活性を検定し
た。上清は０．０４Ｇ工Ｕ／ｄ、すなわち初期活性の４
％であることが見出されｆｃ、ＭＷＡ−１固定化Ｇ工を
ガラスｆ過器上に集め、水１２で洗い、吸引乾燥した。
固定化酵素の活性は１０４ Ｇ］：Ｕ／ ｇ湿潤（４８
，５チ固形分）であった。
，５チ固形分）であった。
固定化グルコースイソメラーゼ４ｙ（湿潤）を塔反応器
（０，９Ｘ２５ｍ）に装填し、そして下記方法により予
備処理した基質溶液を用いて同定化酵素の安定性につい
て試験した。最初にグルコース溶液（３ｍＭ Ｍｇ
および０．０２％アジｆヒナトリウムを含有する５０Ｍ
量／容量％）は反応器の出口に設けた限外ｒ過膜（アミ
コン・ダイアフロＰＭ−３０）の使用により２００ｍ／
！連続攪拌−タンク反応器〔アミコン・スタイアート・
セル（Ａｍ１ｃｏｎ ５ｔｉｒｒｅｃｌ ｃｅｌｌ）、
モデルナ８２００゜アミコン社の商標名〕内に保持され
た高分子安定剤全通過させた。この実験において使用し
た安定剤はＣＭ ｉ ＰＥＩであり、グルコース溶液６
０２を予備処理する実験（約３０耐／時間で２０００時
間）に対しては３．５ミリ当量のＦＢＩ ｉ使用した。
（０，９Ｘ２５ｍ）に装填し、そして下記方法により予
備処理した基質溶液を用いて同定化酵素の安定性につい
て試験した。最初にグルコース溶液（３ｍＭ Ｍｇ
および０．０２％アジｆヒナトリウムを含有する５０Ｍ
量／容量％）は反応器の出口に設けた限外ｒ過膜（アミ
コン・ダイアフロＰＭ−３０）の使用により２００ｍ／
！連続攪拌−タンク反応器〔アミコン・スタイアート・
セル（Ａｍ１ｃｏｎ ５ｔｉｒｒｅｃｌ ｃｅｌｌ）、
モデルナ８２００゜アミコン社の商標名〕内に保持され
た高分子安定剤全通過させた。この実験において使用し
た安定剤はＣＭ ｉ ＰＥＩであり、グルコース溶液６
０２を予備処理する実験（約３０耐／時間で２０００時
間）に対しては３．５ミリ当量のＦＢＩ ｉ使用した。
予備処理グルコースを用いて６０℃で試験したときのＭ
ＷＡ、−１固定化ａ工の安定性は、未処理グルコース原
料を用いたものと比較し、種々の条件下での結果（半減
期）′（Ｉｌ−表■に示す。
ＷＡ、−１固定化ａ工の安定性は、未処理グルコース原
料を用いたものと比較し、種々の条件下での結果（半減
期）′（Ｉｌ−表■に示す。
実施例２
使用した固定化グルコースイソメラーゼおよび試験条件
は実施例１と同じであった。但し、ＣＭ−ＰＥＩ （３
，５ミリ当量のＰＫＩに等しい）の新しい試料全卵え、
使用したＣＭ−ＰＥＩは試験期間中３５０時間ごとに廃
棄した。従って、２０００時間の実験の間にＣＭ−ＰＥ
Ｉ’ｉ６回変えた。半減期を表■に示す。
は実施例１と同じであった。但し、ＣＭ−ＰＥＩ （３
，５ミリ当量のＰＫＩに等しい）の新しい試料全卵え、
使用したＣＭ−ＰＥＩは試験期間中３５０時間ごとに廃
棄した。従って、２０００時間の実験の間にＣＭ−ＰＥ
Ｉ’ｉ６回変えた。半減期を表■に示す。
表 ■
Claims (10)
- （１）基質原料流または細胞外酵素と、分子量が少なく
とも５００ダルトンのカルボキシアルキル化ポリマーま
たはホスホノアルキル化ポリマーと接触させることから
なる、原料流中の基質を目的生産物に転化するために使
用する細胞外酵素の安定化方法。 - （２）細胞外酵素がグルコースイソメラーゼであり、基
質がＤ−グルコースである特許請求の範囲第１項記載の
方法。 - （３）カルボキシアルキル化ポリマーまたはホスホノア
ルキル化ポリマーが陽イオン性高分子電解質であり、こ
の場合カルボキシアルキル化部分またはホスホノアルキ
ル化部分のアルキルは −（ＣＨ＿２）＿ｎ−（ｎ＝１〜３）または−（ＣＨＲ
）−（ＣＨ＿２）＿ｎ− （Ｒ＝メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピル、
およびｎ＝１または２）である、特許請求の範囲第１項
記載の方法。 - （４）細胞外酵素を固定化する特許請求の範囲第１項記
載の方法。 - （５）酵素をカルボキシアルキル化ポリマーまたはホス
ホノアルキル化ポリマーで包膜する、特許請求の範囲第
４項記載の方法。 - （６）細胞外酵素および分子量が少なくとも５００ダル
トンのカルボキシアルキル化ポリマーまたはホスホノア
ルキル化ポリマーからなる安定化された細胞外酵素。 - （７）ポリマーが陽イオン性高分子電解質であり、この
場合カルボキシアルキル化部分またはホスホノアルキル
化部分のアルキルが−（ＣＨ＿２）＿ｎ−（ｎ＝１〜３
）または−（ＣＨＲ）−（ＣＨ＿２）＿ｎ−（Ｒ＝メチ
ル、エチル、プロピル、またはイソプロピル、およびｎ
＝１または２）である、特許請求の範囲第６項記載の安
定化された細胞外酵素。 - （８）酵素がグルコースイソメラーゼである特許請求の
範囲第６項記載の安定化された細胞外酵素。 - （９）酵素が固定化されている特許請求の範囲第６項記
載の安定化された細胞外酵素。 - （１０）最初にＤ−グルコース含有原料流を、分子量が
少なくとも５００ダルトンのカルボキシアルキル化ポリ
マーまたはホスホノアルキル化ポリマーからなる安定剤
と接触させ、その後前記原料流をグルコースイソメラー
ゼと接触させることからなる、Ｄ−グルコースからのＤ
−フルクトースの製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/707,774 US4675292A (en) | 1985-03-04 | 1985-03-04 | Stabilization of glucose isomerase |
| US707774 | 1996-09-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61205483A true JPS61205483A (ja) | 1986-09-11 |
Family
ID=24843118
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61046042A Pending JPS61205483A (ja) | 1985-03-04 | 1986-03-03 | 細胞外酵素の安定化 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4675292A (ja) |
| EP (1) | EP0193925A3 (ja) |
| JP (1) | JPS61205483A (ja) |
| CA (1) | CA1280380C (ja) |
| DK (1) | DK84986A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013527885A (ja) * | 2010-04-15 | 2013-07-04 | バックマン・ラボラトリーズ・インターナショナル・インコーポレーテッド | 酵素とカチオン性凝結剤との組合せを用いた製紙プロセス及びシステム |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4950596A (en) * | 1985-03-04 | 1990-08-21 | The Dow Chemical Company | Stabilization of intracellular enzymes |
| IT208734Z2 (it) * | 1986-11-11 | 1988-05-28 | Mariplast Spa | Cono per tintura di filati in rocca con sede assiale per la guida dello stelo ed incavo per la compenetrazione di coni sovrapposti |
| US5089407A (en) * | 1987-12-11 | 1992-02-18 | Monsanto Company | Encapsulation of biological material in non-ionic polymer beads |
| FR2675997B1 (fr) * | 1991-05-03 | 1993-12-24 | Oreal | Composition topique anti radicaux libres a base de superoxyde-dismutase et d'un derive phosphonique. |
| DE69331597T2 (de) * | 1992-11-25 | 2002-09-12 | Chisso Corp | Methoden und Verwendung von poly-L-lysine als Enzymschutzmittel |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3935068A (en) * | 1973-01-02 | 1976-01-27 | R. J. Reynolds Tobacco Company | Continuous isomerization process utilizing immobilized flocculate enzyme |
| JPS5317674B2 (ja) * | 1973-05-30 | 1978-06-09 | ||
| US3982997A (en) * | 1974-09-18 | 1976-09-28 | Corning Glass Works | Immobilized glucose isomerase |
| US4077842A (en) * | 1976-03-19 | 1978-03-07 | Cory Robert Paul | Stabilized glucose isomerase enzyme concentrate |
| JPS52120190A (en) * | 1976-04-02 | 1977-10-08 | Cpc International Inc | Fixing method of glucose isomerase and cotinuous isomerization of glucose |
| US4308349A (en) * | 1978-03-09 | 1981-12-29 | The Dow Chemical Company | Isomerization of glucose to fructose using glucose isomerase from ampullariella |
| GB2019410B (en) * | 1978-04-19 | 1982-06-03 | Novo Industri As | Immobilized enzyme products |
| US4411996A (en) * | 1982-06-30 | 1983-10-25 | Nabisco Brands, Inc. | Process for isomerizing glucose |
| DK149079C (da) * | 1982-10-06 | 1986-06-23 | Novo Industri As | Fremgangsmaade til fremstilling af et immobiliseret enzympraeparat |
| GB8304069D0 (en) * | 1983-02-14 | 1983-03-16 | Ici Plc | Production of immobilised glucose isomerase |
-
1985
- 1985-03-04 US US06/707,774 patent/US4675292A/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-02-11 CA CA000501555A patent/CA1280380C/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-02-24 DK DK84986A patent/DK84986A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-03-03 JP JP61046042A patent/JPS61205483A/ja active Pending
- 1986-03-04 EP EP86102809A patent/EP0193925A3/en not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013527885A (ja) * | 2010-04-15 | 2013-07-04 | バックマン・ラボラトリーズ・インターナショナル・インコーポレーテッド | 酵素とカチオン性凝結剤との組合せを用いた製紙プロセス及びシステム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK84986A (da) | 1986-09-05 |
| DK84986D0 (da) | 1986-02-24 |
| US4675292A (en) | 1987-06-23 |
| CA1280380C (en) | 1991-02-19 |
| EP0193925A3 (en) | 1988-07-13 |
| EP0193925A2 (en) | 1986-09-10 |
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