JPS6219835B2

JPS6219835B2 -

Info

Publication number: JPS6219835B2
Application number: JP55112024A
Authority: JP
Inventors: Ichiro Senhata; Tetsuya Tosa; Takao Mori; Mototeru Fujimura
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1980-08-13
Filing date: 1980-08-13
Publication date: 1987-05-01
Also published as: US4390626A; GB2082188A; FR2488619A1; DE3131908A1; JPS5736986A; FR2488619B1; GB2082188B

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な固定化アミノアシラーゼ剤およ
びその製法に関する。アミノアシラーゼはα−（Ｎ−アシル）−Ｌ−ア
ミノ酸を加水分解してＬ−アミノ酸に転換せしめ
る酵素であり、DL−アミノ酸の光学分割などに
利用されている。近年、アミノアシラーゼを固定化して酵素反応
を連続的に行なおうとする試みがなされ例えば、
イオン結合法、ゲル包括法あるいは共有結合法に
よつてアミノアシラーゼを水に不溶性担体に吸着
乃至包括させる方法等が知られている。このう
ち、イオン結合法による場合は基質濃度やイオン
強度が高くなると酵素が不溶性担体から遊離しや
すいため安定性が低く、カラムに充填して連続反
応を行なう際の圧損失も高い欠点があるが酵素剤
調製操作が容易であることから、これまでにも水
に不溶性担体として陰イオン交換樹脂や多孔性陰
イオン交換樹脂を用いる方法（特公昭48−8835
号、同51−16954号）が検討されている。しかし
ながらこれらの方法も基質濃度やイオン強度が高
いと酵素が遊離するというイオン結合法のもつ固
有の欠点を解決したものではない。しかるに、本発明者らはこれらの欠点を解決す
べく鋭意研究を重ねた結果、第４級アンモニウム
基が導入された水に不溶性の多孔性陰イオン交換
体（以下、単に多孔性陰イオン交換体という）に
アミノアシラーゼが吸着により直接結合してお
り、かつアミノアシラーゼ相互間が蛋白質架橋剤
で架橋されてなる固定化アミノアシラーゼ剤が高
い基質濃度やイオン強度においても酵素が遊離せ
ず、圧損失も低い等種々の利点をもつことを見出
し本発明を完成するに至つた。即ち、本発明によれば当該固定化アミノアシラ
ーゼ剤は、多孔性陰イオン交換体にアミノアシラ
ーゼを吸着により直接結合させ、ついで蛋白質架
橋剤で処理してアミノアシラーゼ相互間を架橋さ
せることにより製することができる。本発明の固定化アミノアシラーゼ剤において、
多孔性陰イオン交換体に吸着により直接結合させ
るアミノアシラーゼとしては、Ｎ−アシル−Ｌ−
アミノ酸を加水分解してＬ−アミノ酸へ転換せし
め得るものであれば何れの酵素源から得られたも
のであつてもよく、とりわけ活性の強いアスペル
ギルス属、ペニシリウム属及びムコール属に属す
る糸状菌アミノアシラーゼが好適にあげられる。
該アミノアシラーゼは公知慣用手段によつてその
酵素源から採取することができる。また、アミノアシラーゼが吸着により直接結合
する多孔性陰イオン交換体としては数百〜数千Å
程度の孔径の細孔を多数有し、大きな比表面積と
細孔容積とを有する水に不溶性の多孔性物質に第
４級アンモニウム基が導入されたものであつて
も、適当な粒子径を有するものがあげられる。特
に、該多孔性陰イオン交換体としては、細孔径が
約300〜3000Åである細孔を有し、その細孔容積
が約0.3〜１ml／ｇであり、更に比表面積が約10
〜150m²／ｇである多孔性フエノール系樹脂（例
えばフエノールホルマリン縮合体）、多孔性スチ
レン系樹脂（例えばスチレン・ジビニルベンゼン
共重合体）、多孔性シリカまたは多孔性ガラス
に、トリメチルアンモニウム基、ジメチルヒドロ
キシエチルアンモニウム基の如き第４級アンモニ
ウム基が導入されたものであつて、その粒子径が
平均約0.1〜1.0mm、とりわけ0.3〜0.8mmであるも
のが好ましい。上記条件を満たす多孔性陰イオン
交換体を具体的に例示すれば、例えば細孔径約
1000Å、細孔容積約0.8ml／ｇ、比表面積約25
m²／ｇ、粒子径100〜200μｍ、トリメチルアンモ
ニウム基が導入された多孔性シリカ（商品名“ス
フエロジルQMA”、ローヌ・プーラン社製）、細
孔径約450〜500Å細孔容積約0.96ml／ｇ、比表面
積約30m²／ｇ、粒子径0.35〜0.55mmでトリメチル
アンモニウム基が導入された多孔性スチレン・ジ
ビニルベンゼン共重合体（商品名“ダイヤイオン
HPA−25”、三菱化成製）、細孔径約250Å細孔容
積約0.35ml／ｇ、比表面積約25〜35m²／ｇ、粒子
径0.3〜1.2mmでトリメチルアンモニウム基が導入
された多孔性ポリスチレン（商品名“デユオライ
トＡ−161”、ダイヤモンドシヤムロツク社製）、
細孔径約250Å、細孔容積約0.35ml／ｇ、比表面
積約25〜35m²／ｇ、粒子径約0.3〜1.2mmでジメチ
ルヒドロキシエチルアンモニウム基が導入された
多孔性ポリスチレン（商品名“デユオライトＡ−
162”、ダイヤモンドシヤムロツク社製）、細孔径
約300Å、細孔容積約0.5ml／ｇ、比表面積約25
m²／ｇ、粒子径約0.3〜0.8mmでトリメチルアンモ
ニウム基が導入された多孔性スチレン・ジビニル
ベンゼン共重合体（商品名“ダウエツクスMSA
−１”、ダウケミカル社製）、細孔径約300〜2000
Å、細孔容積約0.95ml／ｇ、比表面積約42m²／
ｇ、粒子径約0.4〜0.5mmでトリメチルアンモニウ
ム基を有する多孔性ポリスチレン（商品名“アン
バーライトIRA−904”、ロームアンドハース社
製）等を好適にあげることができる。更に、多孔性陰イオン交換体にアミノアシラー
ゼを吸着により直接結合させたのちアミノアシラ
ーゼ相互間を架橋する蛋白質架橋剤としては、例
えばグリオキザール、マロンジアルデヒド、サク
シンジアルデヒド、グルタルアルデヒド、アジポ
アルデヒド等の炭素数２〜６個を有する脂肪族ジ
アルデヒドがあげられ、とりわけグリオキザール
およびグルタルアルデヒドが好ましい。本発明の固定化アミノアシラーゼ剤の調製にあ
たつて、まず、多孔性陰イオン交換体にアミノア
シラーゼを吸着により直接結合させるには、水ま
たは適当な緩衝液中で、多孔性陰イオン交換体に
アミノアシラーゼを接触させて行なうのが好まし
い。多孔性陰イオン交換体との結合に供する前記
アミノアシラーゼとしては、精製純化されたもの
であつても、また粗製のものであつてもよく、そ
の所要使用量は多孔性陰イオン交換体の種類によ
つて必ずしも一定ではないが、概ね該交換体１ml
に対して約100〜10000単位、とりわけ1000〜5000
単位程度であるのが好ましい。適当な緩衝液とし
ては、例えばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を使
用することができ、とりわけその濃度が約0.05〜
0.1モル濃度、PHが約７〜９程度である緩衝液が
適当である。このようにして得たアシラーゼを吸着により直
接結合せる多孔性イオン交換体をついで蛋白質架
橋剤でアミノアシラーゼ相互間を架橋させるに
は、水または上記の如き適当な緩衝液中、該イオ
ン交換体に蛋白質架橋剤を接触させて行なうのが
好ましい。この場合、蛋白質架橋剤の濃度が低く
すぎると、架橋が充分行なわれないため酵素の脱
離を防止し得ず、またその濃度が高すぎると、酵
素の失活が激しいため、蛋白質架橋剤の濃度は、
多孔性陰イオン交換体に吸着した酵素量に応じて
調整されるが、一般的には0.01〜0.05％の範囲で
あるのが好ましい。また、本発明の固定化アミノアシラーゼ剤の調
製は、上記の如く段階的に行なうことが出来る
が、通常同一系内で一挙に行なえば操作が簡便で
あり好ましい。この場合水または前記適当な緩衝
液中、多孔性陰イオン交換体にアミノアシラーゼ
および蛋白質架橋剤を同時に接触させることによ
り固定化アミノアシラーゼ剤を調製することがで
きる。上記いずれの方法によつても多孔性陰イオ
ン交換体へのアミノアシラーゼの結合、および蛋
白質架橋剤による架橋は、約４〜10℃で行えば酵
素の失活も少なく、吸着率、架橋率を向上せしめ
得るので好ましい。このような固定化アミノアシラーゼ剤の調製は
バツチ法によつても、またカラム法によつても行
なうことができる。バツチ法により行なう場合
は、アミノアシラーゼを水または緩衝液に溶解
し、これに多孔性陰イオン交換体を加え、前記結
合の条件下にかくはんすると多孔性陰イオン交換
体とアミノアシラーゼとの結合体が生成してくる
ので、この結合体をデカンテーシヨン、ロ過ある
いは遠心分離する如き公知分離手段により採取
し、ついで、あらかじめ蛋白質架橋剤を水または
緩衝液に溶解した溶液に上記結合体を加え、前記
架橋の条件下にかくはんすることにより、段階的
に固定化アミノアシラーゼ剤を生成せしめること
が出来る。また上記多孔性陰イオン交換体の生成
した溶液に、直接蛋白質架橋剤を添加し、同様の
条件下にかくはんすることにより、同一系内で一
挙に固定化アミノアシラーゼ剤を生成せしめるこ
とが出来る。生成した固定化アミノアシラーゼ剤
は上記公知分離手段により容易に採取することが
出来る。またカラム法により行なう場合は、多孔
性陰イオン交換体をカラムに充填し、このカラム
にアミノアシラーゼを含む水または緩衝液を流下
したのち、つづいて蛋白質架橋剤を含む水または
緩衝液を流下することにより、固定化アミノアシ
ラーゼ剤を得ることができる。いずれの場合も流
下速度は、SV約0.1〜0.5程度であるのが適当であ
る。本発明の固定化アミノアシラーゼ剤は、高い基
質濃度乃至イオン強度においても酵素を脱離する
ことが殆どなく、このため安定した酵素活性を長
期間発現し得る。実験例１下記により調製した固定化アミノアシラーゼ剤
に基質溶液を連続的に作用させ、該アシラーゼ剤
の初期酵素活性に対する経時的な残存酵素活性率
を求めた。１固定化アミノアシラーゼ剤の調製 (i) 本発明のアミノアシラーゼ剤：第１表に示す多孔性陰イオン交換体を水で
膨潤させ、その10mlにアスペルギルス・オリ
ゼ由来の粗アミノアシラーゼ溶液50ml〔粗ア
ミノアシラーゼ500mg（15000μmol／ｈ）を
リン酸緩衝液（PH7.5）50mlに溶解した溶
液〕を加えた。ついでこの混合液に最終濃度
が0.05％になるようにグルタルアルデヒドを
加え、10℃で18時間振とう反応後、ろ過、水
洗することにより、固定化アミノアシラーゼ
剤を得た。 (ii) 対照(1)の固定化アミノアシラーゼ剤：第１表に示す多孔性陰イオン交換体を水で
膨潤させ、その10mlにアスペルギルス・オリ
ゼ由来の粗アミノアシラーゼ溶液50ml（(i)に
同じ）を加えた。10℃にて18時間振とう後、
ろ過、水洗することにより、固定化アミノア
シラーゼ剤を得た。 (iii) 対照(2)の固定化アミノアシラーゼ剤： (i)において多孔性陰イオン交換体に代えて
ゲル型の陰イオン交換樹脂を用い、以下同様
に処理することにより、固定化アミノアシラ
ーゼ剤を得た。２実験方法上記により得た固定化アミノアシラーゼ剤を
それぞれ10ml宛カラムに充填し、37℃にて
0.6M濃度のＮ−アセチル−DLメチオニン水溶
液（PH7.0、５×10^-4MCo⁺⁺含有）を６ml／ｈ
の流速で導通し、酵素反応を行なつた。活性測
定時は80ml／ｈの流速で基質溶液を導通し流速
液中のＬ−メチオニンを定量し１時間当り生成
するＬ−メチオニンのマイクロモル数で固定化
アミノアシラーゼ剤の活性を表わし、初期活性
とした。酵素反応を10日間連続して行ない、10
日間経過後に上記と同様にして固定化アミノア
シラーゼ剤の活性を求め、その値を初期活性
100とした場合に対する比率で表わした。３結果第１表に示す通りであり、本発明のアミノア
シラーゼ剤は、対照アミノアシラーゼ剤に比し
てはるかに高い残存酵素活性を有し、長期間酵
素活性が高い状態で保持されることが認められ
た。これに対して対照(1)は経時的に酵素活性が
低下することが認められ、特に、この酵素剤は
酵素反応初期においてさえ、担体から酵素が遊
離してくることも認められた。更に対照(2)で
は、酵素が樹脂に全く吸着されないことが認め
られた。

【表】で陰イオン交換基としてトリメチルイン

【表】比率で表わす。
実験例２トリメチルアンモニウム基を有し、細孔径約
1000Å、細孔容積約0.8ml／ｇ、比表面積約25
m²／ｇ、粒子径約1000〜2000μｍの多孔性シリカ
（商品名“スフエロジルQMA”、ローヌ・プーラ
ン社製）を用い、以下、実験例１(i)及び(ii)と同様
にして本発明及び対照の固定化アミノアシラーゼ
剤を調製する。この固定化アミノアシラーゼ剤を用いてＮ−ア
セチル−DL−フエニルアラニン（PH7.5×
10^-4M、Co⁺⁺含有）、Ｎ−アセチル−DL−メチオ
ニン（PH７、５×10^-4MCo⁺⁺含有）をそれぞれ基
質として連続酵素反応を行なつた。その結果を第
２表に示す。第２表において明らかな如く、本発明の固定化
アミノアシラーゼ剤は長期間酵素活性が安定であ
る。対照の固定化アミノアシラーゼ剤は、固定化
初期から基質濃度の高いことによつて酵素がリー
クし、低活性であり、反応継続によりさらに活性
が低下している。この点からも高基質濃度下においても本発明の
固定化アミノアシラーゼ剤がすぐれていることが
明らかである。

【表】実験例３実験例２と同様の多孔性陰イオン交換体を用
い、アスペルギルス・オリゼ由来の粗アミノアシ
ラーゼ溶液50ml（粗アミノアシラーゼ500mg、
15000μmoles／ｈ、0.05Mリン酸緩衝液に溶解、
PH7.5）を加え、さらにこの混合液にグルタルア
ルデヒドを第３表に示す各濃度になるよう加え、
以下、実験例１と同様にして固定化処理した。得
られた、グルタルアルデヒド濃度の異なる架橋処
理をした固定化アミノアシラーゼ剤を用い、
0.6M／のＮ−アセチル−DX−メチオニンを基
質として連続酵素反応を行ない固定化アミノアシ
ラーゼ剤の安定性を比較した。結果を第３表に示す。第３表から明らかな如
く、グルタルアルデヒド濃度が低いと架橋が充分
でなく酵素が早くからリークし、またグルタルア
ルデヒド濃度が高いと酵素活性の低下が生じ、い
ずれも固定化アミノアシラーゼ剤の活性が低下し
好ましくない。

【表】実施例１トリメチルアンモニウム基を有し、細孔径約
1000Å、細孔容積約0.8ml／ｇ、比表面積約25
m²／ｇ、粒子径約100〜200μｍの多孔性シリカ
（商品名“スフエロジルQMA”、ローヌ・プーラ
ン社製）を水で膨潤させたもの10mlに、アスペル
ギルス・オリゼ由来の粗アミノアシラーゼ溶液50
ml（粗アミノアシラーゼ500mg、1500μmoles／
ｈ、0.05Mリン酸緩衝液に溶解、PH7.5）を加
え、さらにこの混合液に最終濃度が0.05％になる
ようにグルタルアルデヒドを加え、10℃で18時間
振とう反応する。ついでろ過し、水洗することに
より、固定化アミノアシラーゼ剤10mlを得た。この固定化アミノアシラーゼ剤10mlは6500μ
moles／ｈのアミノアシラーゼ活性を示した。実施例２トリメチルアンモニウム基を有し、細孔径約
450〜500Å細孔容積約0.96ml／ｇ、比表面積約30
m²／ｇ、粒子径約0.35〜0.55mmの多孔性スチレ
ン・ジビニルベンゼン共重合体（商品名“ダイヤ
イオンHPA−25”、三菱化成工業製）を用い、以
下実施例１と同様にして固定化アミノアシラーゼ
剤を得た。この固定化アミノアシラーゼ剤10mlは5300μ
moles／ｈのアミノアシラーゼ活性を示した。実施例３トリメチルアンモニウム基を有し、細孔径約
250Å、細孔容積約0.35ml／ｇ、比表面積約25〜
35m²／ｇ、粒子径約0.3〜1.2mmの多孔性ポリスチ
レン（商品名“デユオライトＡ−161”、ダイヤモ
ンドシヤムロツク社製）を用い、以下実施例１と
同様にして固定化アミノアシラーゼ剤を得た。この固定化アミノアシラーゼ剤10mlは2600μ
moles／ｈのアミノアシラーゼ活性を示した。実施例４トリメチルアンモニウム基を有し、細孔径約
300Å、細孔容積約0.5ml／ｇ、比表面積約25m²／
ｇ、粒子径約0.3〜0.8mmの多孔性スチレン・ジビ
ニルベンゼン共重合体（商品名“ダウエツクス
MSA−１”、ダウケミカル社製）を用い、以下実
施例１と同様にして固定化アミノアシラーゼ剤を
得た。この固定化アミノアシラーゼ剤10mlは2200μ
moles／ｈのアミノアシラーゼ活性を示した。実施例５トリメチルアンモニウム基を有し、細孔径約
300〜2000Å細孔容積約0.95ml／ｇ、比表面積約
42m²／ｇ、粒子径約0.4〜0.5mmの多孔性スチレ
ン・ジビニルベンゼン共重合体（商品名“アンバ
ーライトIRA−904”、ロームアンドハース社製）
を用い、以下、実施例１と同様にして固定化アミ
ノアシラーゼ剤を得た。この固定化アミノアシラーゼ剤10mlは4600μ
moles／ｈのアミノアシラーゼ活性を示した。

Claims

【特許請求の範囲】１第４級アンモニウム基が導入された水不溶性
の多孔性陰イオン交換体にアミノアシラーゼが吸
着により直接結合しており、かつアミノアシラー
ゼ相互間が蛋白質架橋剤で架橋されてなる固定化
アミノアシラーゼ剤。２第４級アンモニウム基が導入された水不溶性
の多孔性陰イオン交換体にアミノアシラーゼを吸
着により直接結合させ、ついで蛋白質架橋剤で処
理してアミノアシラーゼ相互間を架橋させること
を特徴とする固定化アミノアシラーゼ剤の製法。