JP2595004B2 - 酵素固定化用担体とその酵素固定化方法および酵素脱着方法 - Google Patents
酵素固定化用担体とその酵素固定化方法および酵素脱着方法Info
- Publication number
- JP2595004B2 JP2595004B2 JP63008523A JP852388A JP2595004B2 JP 2595004 B2 JP2595004 B2 JP 2595004B2 JP 63008523 A JP63008523 A JP 63008523A JP 852388 A JP852388 A JP 852388A JP 2595004 B2 JP2595004 B2 JP 2595004B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- carrier
- glycidyl
- immobilized
- base
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は酵素固定化用担体および当該担体に酵素を固
定化する方法さらに使用済酵素を担体から脱着する方法
に関するものである。
定化する方法さらに使用済酵素を担体から脱着する方法
に関するものである。
＜従来の技術＞ 酵素反応は特に食品、医薬品製造の分野で工業的に利
用されているが、旧来の溶液状酵素を用いる回分式で
は、反応後に酵素を失活させることなく生成物と分離す
ることが困難なため、回収再利用ができず不経済である
ことから、種々の方法にて酵素を不溶性の担体に固定化
する研究が盛んに行われており、既に実用化されている
例もある。
用されているが、旧来の溶液状酵素を用いる回分式で
は、反応後に酵素を失活させることなく生成物と分離す
ることが困難なため、回収再利用ができず不経済である
ことから、種々の方法にて酵素を不溶性の担体に固定化
する研究が盛んに行われており、既に実用化されている
例もある。
イオン交換樹脂はこのような酵素固定化用の不溶性担
体として良く用いられ、通常イオン結合および吸着法に
より酵素を固定化するが、次のような問題点がある。
体として良く用いられ、通常イオン結合および吸着法に
より酵素を固定化するが、次のような問題点がある。
例えばポリフェノール系の陰イオン交換樹脂であるデ
ュオライトA7に吸着固定化する方法（特開昭49−8016
0）では、疎水性に基づく吸着が強いので酵素が脱着し
にくく、使用することにより失活した酵素を脱着して担
体を再使用することが困難である。
ュオライトA7に吸着固定化する方法（特開昭49−8016
0）では、疎水性に基づく吸着が強いので酵素が脱着し
にくく、使用することにより失活した酵素を脱着して担
体を再使用することが困難である。
一方、主としてイオン結合を利用して固定化した場合
には一般に吸着力が弱いために反応中に酵素が離脱する
ことが多く、例えばスチレン−ジビニルベンゼン系陰イ
オン交換樹脂ではイオン交換基に活性水素を含まない担
体を用いる方法（特開昭61−15690）では、樹脂担体に
酵素を吸着固定化した後、さらに多価アルデヒドで酵素
間を架橋して吸着力の弱い点を補強しているが十分では
ない。
には一般に吸着力が弱いために反応中に酵素が離脱する
ことが多く、例えばスチレン−ジビニルベンゼン系陰イ
オン交換樹脂ではイオン交換基に活性水素を含まない担
体を用いる方法（特開昭61−15690）では、樹脂担体に
酵素を吸着固定化した後、さらに多価アルデヒドで酵素
間を架橋して吸着力の弱い点を補強しているが十分では
ない。
また多価アルデヒドを用いて担体と酵素間を直接架橋
し固定化する方法ではアミン基を含むセルロース、Seph
arose、ポリアクリルアミド等、種々の担体について検
討されており、この方法は酵素の離脱がなく固定化法と
しては優れているものの、使用済酵素の脱着が可能で繰
り返し使用に適した担体とその脱着法が見出されていな
い。
し固定化する方法ではアミン基を含むセルロース、Seph
arose、ポリアクリルアミド等、種々の担体について検
討されており、この方法は酵素の離脱がなく固定化法と
しては優れているものの、使用済酵素の脱着が可能で繰
り返し使用に適した担体とその脱着法が見出されていな
い。
＜本発明が解決しようとする問題点＞ 本発明は固定化した酵素が反応中に離脱することなく
使用酵素の安定pHおよび温度範囲において、長期間に渡
り高い活性を維持し、かつ一定期間使用した後には容易
に酵素を脱着することができ、繰り返し使用に耐える十
分な物理的および化学的強度を有する担体およびその酵
素固定化方法さらに使用済酵素の脱着方法を提供するこ
とを目的とする。
使用酵素の安定pHおよび温度範囲において、長期間に渡
り高い活性を維持し、かつ一定期間使用した後には容易
に酵素を脱着することができ、繰り返し使用に耐える十
分な物理的および化学的強度を有する担体およびその酵
素固定化方法さらに使用済酵素の脱着方法を提供するこ
とを目的とする。
＜問題点を解決するための手段＞ 前述の目的を達成するために本発明者等は鋭意研究を
行った結果、担体として不飽和カルボン酸グリシジルエ
ステルの重合物で、イオン交換基としてエタノールアミ
ン等の第一級アミンを付加した担体を用いて製造した固
定化酵素が長期間安定して高い活性を維持し、またグル
タルアルデヒドを介在させることにより前記交換基に強
固に酵素を結合させることができ、さらに温アルカリ溶
液により容易に酵素を脱着することができ、担体が繰り
返し使用可能であることを見出し本発明を完成した。
行った結果、担体として不飽和カルボン酸グリシジルエ
ステルの重合物で、イオン交換基としてエタノールアミ
ン等の第一級アミンを付加した担体を用いて製造した固
定化酵素が長期間安定して高い活性を維持し、またグル
タルアルデヒドを介在させることにより前記交換基に強
固に酵素を結合させることができ、さらに温アルカリ溶
液により容易に酵素を脱着することができ、担体が繰り
返し使用可能であることを見出し本発明を完成した。
すなわち本発明の第一発明は巨大網状構造を有する塩
基性陰イオン交換樹脂の母体が、不飽和カルボン酸グリ
シジルエステルの重合物であり、イオン交換基として第
一級アミンを有することを特徴とする酵素固定化用担体
であり、本発明の第二発明は前記酵素固定化用担体に酵
素を固定化するにあたり、第一級アミンからなるイオン
交換基にグルタルアルデヒドを架橋剤として介在させて
酵素を結合させることを特徴とする酵素固定化方法であ
り、本発明の第三発明は上述のごとくして得た固定化酵
素を使用した後、当該固定化酵素に温アルカリ溶液を接
触させて酵素を脱着することを特徴とする酵素脱着方法
である。
基性陰イオン交換樹脂の母体が、不飽和カルボン酸グリ
シジルエステルの重合物であり、イオン交換基として第
一級アミンを有することを特徴とする酵素固定化用担体
であり、本発明の第二発明は前記酵素固定化用担体に酵
素を固定化するにあたり、第一級アミンからなるイオン
交換基にグルタルアルデヒドを架橋剤として介在させて
酵素を結合させることを特徴とする酵素固定化方法であ
り、本発明の第三発明は上述のごとくして得た固定化酵
素を使用した後、当該固定化酵素に温アルカリ溶液を接
触させて酵素を脱着することを特徴とする酵素脱着方法
である。
＜作用＞ 前述したごとく弱塩基性陰イオン交換樹脂に酵素を吸
着させた固定化酵素は酵素の吸着が弱く反応中に離脱す
るため、後述する実施例で示すごとく短期間で急激に活
性が低下し、また酵素を吸着させた後グルタルアルデヒ
ドで酵素間を架橋してもその効果は十分ではない。それ
に対して第一級アミンを有するイオン交換樹脂担体と酵
素間をグルタルアルデヒドで架橋して製造したものは酵
素反応中に酵素の離脱がなく長期間高い活性を維持でき
る。
着させた固定化酵素は酵素の吸着が弱く反応中に離脱す
るため、後述する実施例で示すごとく短期間で急激に活
性が低下し、また酵素を吸着させた後グルタルアルデヒ
ドで酵素間を架橋してもその効果は十分ではない。それ
に対して第一級アミンを有するイオン交換樹脂担体と酵
素間をグルタルアルデヒドで架橋して製造したものは酵
素反応中に酵素の離脱がなく長期間高い活性を維持でき
る。
しかしながら酵素反応中に酵素の離脱がなく、長期間
高い活性を維持できても、使用後に酵素の脱着が可能で
担体が繰り返し使用可能でなければ経済的に不利であ
る。後述する実施例で示したごとくイオン交換樹脂の母
体として一般的なスチレン−ジビニルベンゼン系の母体
に第一級アミンを導入したものの場合は固定化した酵素
の脱着が十分でないため、脱着後再び固定化したときの
活性が低下する。この原因はスチレン−ジビニルベンゼ
ンの共重合体が極めて疎水性であるために酵素固定化時
にイオン結合と同時に、酵素が疎水性に基づく吸着を生
じているためと考えられた。
高い活性を維持できても、使用後に酵素の脱着が可能で
担体が繰り返し使用可能でなければ経済的に不利であ
る。後述する実施例で示したごとくイオン交換樹脂の母
体として一般的なスチレン−ジビニルベンゼン系の母体
に第一級アミンを導入したものの場合は固定化した酵素
の脱着が十分でないため、脱着後再び固定化したときの
活性が低下する。この原因はスチレン−ジビニルベンゼ
ンの共重合体が極めて疎水性であるために酵素固定化時
にイオン結合と同時に、酵素が疎水性に基づく吸着を生
じているためと考えられた。
この問題を解決するために鋭意検討を行った結果、不
飽和カルボン酸グリシジルエステルのポリマーに第一級
アミンを付加した巨大網状構造を有する担体を用い、担
体の官能基と酵素間をグルタルアルデヒドで架橋して得
られる固定化酵素が温アルカリ溶液によって容易に脱着
されることを見出した。本担体は（１）式に例示した反
応式によってモノマーおよび架橋剤の親水性に加えて交
換基導入反応時にエポキシ環が開裂し、一方に交換基が
付加するとともに他方にアルコール性水酸基が生成する
ことから極めて親水性の高いポリマーであり、そのため
前述したような酵素の疎水性吸着が起こりにくいと考え
られる。
飽和カルボン酸グリシジルエステルのポリマーに第一級
アミンを付加した巨大網状構造を有する担体を用い、担
体の官能基と酵素間をグルタルアルデヒドで架橋して得
られる固定化酵素が温アルカリ溶液によって容易に脱着
されることを見出した。本担体は（１）式に例示した反
応式によってモノマーおよび架橋剤の親水性に加えて交
換基導入反応時にエポキシ環が開裂し、一方に交換基が
付加するとともに他方にアルコール性水酸基が生成する
ことから極めて親水性の高いポリマーであり、そのため
前述したような酵素の疎水性吸着が起こりにくいと考え
られる。
本発明に用いる担体としては、不飽和カルボン酸グリ
シジルエステルの重合物からなり、イオン交換基として
第一級アミンを有する巨大網状構造を有する塩基性陰イ
オン交換樹脂であって、好ましくはメタアクリル酸グリ
シジルエステルまたはアクリル酸グリシジルエステル、
クロトン酸グリシジルエステル等に、架橋剤としてジメ
タアクリル酸エチレングリコール、ジメタアクリル酸ポ
リエチレングリコール等を重合反応させて得た母体にエ
タノールアミン、プロパノールアミン、アンモニア等を
付加して、第一級アミンを官能基として形成させたもの
である。
シジルエステルの重合物からなり、イオン交換基として
第一級アミンを有する巨大網状構造を有する塩基性陰イ
オン交換樹脂であって、好ましくはメタアクリル酸グリ
シジルエステルまたはアクリル酸グリシジルエステル、
クロトン酸グリシジルエステル等に、架橋剤としてジメ
タアクリル酸エチレングリコール、ジメタアクリル酸ポ
リエチレングリコール等を重合反応させて得た母体にエ
タノールアミン、プロパノールアミン、アンモニア等を
付加して、第一級アミンを官能基として形成させたもの
である。
巨大網状構造を有する母体の物理的構造としては平均
粒子径0.2〜1mmで、細孔径が100〜2,000Å、細孔容積胃
が0.5〜1.5ml/g程度のものが用いられる。
粒子径0.2〜1mmで、細孔径が100〜2,000Å、細孔容積胃
が0.5〜1.5ml/g程度のものが用いられる。
本発明で使用する酵素としては特に限定はなく、加水
分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素、異性化酵素等が挙
げられ、特にグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、プロ
テアーゼ、サイクロデキストリングルカノトランスファ
ーゼ、オキシダーゼ、インメラーゼ等が好適である。
分解酵素、転移酵素、酸化還元酵素、異性化酵素等が挙
げられ、特にグルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、プロ
テアーゼ、サイクロデキストリングルカノトランスファ
ーゼ、オキシダーゼ、インメラーゼ等が好適である。
次に酵素の固定化法について説明すると、まず当該担
体をpH緩衝液を用いて使用酵素の安定pHに緩衝化し、次
いで同緩衝液に溶解した0.5〜10％濃度のグルタルアル
デヒド溶液と４〜40℃にて0.5〜２時間接触させ、その
後緩衝液で過剰のグルタルアルデヒドを洗い流す。この
ようにして調整した担体と酵素溶液とを１時間以上、好
ましくは２〜５時間接触させて酵素を固定化した後、過
剰の酵素を緩衝液で洗い流すことにより得ることができ
る。酵素の使用量は使用する酵素によって異なるが蛋白
として0.5〜50mg−蛋白/ml/担体の範囲が適当である。
体をpH緩衝液を用いて使用酵素の安定pHに緩衝化し、次
いで同緩衝液に溶解した0.5〜10％濃度のグルタルアル
デヒド溶液と４〜40℃にて0.5〜２時間接触させ、その
後緩衝液で過剰のグルタルアルデヒドを洗い流す。この
ようにして調整した担体と酵素溶液とを１時間以上、好
ましくは２〜５時間接触させて酵素を固定化した後、過
剰の酵素を緩衝液で洗い流すことにより得ることができ
る。酵素の使用量は使用する酵素によって異なるが蛋白
として0.5〜50mg−蛋白/ml/担体の範囲が適当である。
上述のような担体の第一級アミンにグルタルアルデヒ
ドを架橋剤として介在させて酵素を結合する反応は
（２）式および（３）式のごとく例示される。
ドを架橋剤として介在させて酵素を結合する反応は
（２）式および（３）式のごとく例示される。
担体−NH2＋OHC−（CH2）３−CHO →担体−Ｎ＝CH−（CH2）３−CHO ……（２） 担体−Ｎ＝CH−（CH2）３−CHO＋酵素 →担体−Ｎ＝CH−（CH2）３−CH＝Ｎ−酵素 ……（３） 当該担体とグルタルアルデヒドあるいは酵素溶液との
接触方法としてはバッチ法でもカラムに充填して上向流
あるいは下向流にて通液して実施しても良い。
接触方法としてはバッチ法でもカラムに充填して上向流
あるいは下向流にて通液して実施しても良い。
次に上記のようにして製造した固定化酵素を一定期間
使用して、活性の低下した酵素を脱着する方法について
説明すると、まず反応に使用した固定化酵素を水洗して
その後0.5〜10％濃度、特に好ましくは２〜５％のアル
カリ溶液、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
炭酸ナトリウム溶液と40〜70℃にて0.5時間以上、好ま
しくは１〜３時間接触させて酵素蛋白をグルタルアルデ
ヒドとともに脱着し、担体を水洗する。
使用して、活性の低下した酵素を脱着する方法について
説明すると、まず反応に使用した固定化酵素を水洗して
その後0.5〜10％濃度、特に好ましくは２〜５％のアル
カリ溶液、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
炭酸ナトリウム溶液と40〜70℃にて0.5時間以上、好ま
しくは１〜３時間接触させて酵素蛋白をグルタルアルデ
ヒドとともに脱着し、担体を水洗する。
以後は前述した方法で担体の緩衝化、グルタルアルデ
ヒド処理を実施し、酵素溶液と接触させて再固定化し目
的の反応に使用する。このようにして担体を繰り返し使
用することができる。脱着の際のアルカリ溶液との接触
方法はバッチ法でも担体をカラムに充填し通液して実施
しても良い。
ヒド処理を実施し、酵素溶液と接触させて再固定化し目
的の反応に使用する。このようにして担体を繰り返し使
用することができる。脱着の際のアルカリ溶液との接触
方法はバッチ法でも担体をカラムに充填し通液して実施
しても良い。
＜効果＞ 以上説明したごとく、本発明の担体は担体と酵素間を
グルタルアルデヒドを架橋剤として介在させて固定化す
る方法を用いる担体として好適であり、初期の活性が高
く、かつ酵素反応中に酵素の離脱がないため長期間に渡
って高い活性を維持できるばかりでなく、温アルカリ溶
液によって使用済酵素が容易に脱着できる。従って旧来
のバッチ反応に比べて酵素の使用量が極めて少なく、担
体も繰り返し使用できるため経済的メリットは非常に大
きい。
グルタルアルデヒドを架橋剤として介在させて固定化す
る方法を用いる担体として好適であり、初期の活性が高
く、かつ酵素反応中に酵素の離脱がないため長期間に渡
って高い活性を維持できるばかりでなく、温アルカリ溶
液によって使用済酵素が容易に脱着できる。従って旧来
のバッチ反応に比べて酵素の使用量が極めて少なく、担
体も繰り返し使用できるため経済的メリットは非常に大
きい。
以下に本発明を実施例をもってさらに詳しく説明す
る。なお本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例
に限定されるものではない。
る。なお本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例
に限定されるものではない。
実施例１（固定化担体の製造法） メタアクリル酸グルシジルエステル200g、ジメタアク
リル酸エチレングリコール50g、過酸化ベンゾイル2gお
よびトルエン250gの混合溶液をポリビニルアルコール2g
を溶解した水1,000mlに加えた。この混合液を撹拌しな
がら60℃で４時間反応し重合させた。冷却後生成物を濾
過洗浄し、60℃で16時間真空乾燥し、205gの白色不透明
の球状樹脂を得た。
リル酸エチレングリコール50g、過酸化ベンゾイル2gお
よびトルエン250gの混合溶液をポリビニルアルコール2g
を溶解した水1,000mlに加えた。この混合液を撹拌しな
がら60℃で４時間反応し重合させた。冷却後生成物を濾
過洗浄し、60℃で16時間真空乾燥し、205gの白色不透明
の球状樹脂を得た。
得られた球状樹脂100gをエタノールアミン500ml中に
加え、110〜120℃で６時間撹拌して反応させた。冷却後
生成物を濾過洗浄し、60℃で16時間真空乾燥し117gの生
成物を得た。
加え、110〜120℃で６時間撹拌して反応させた。冷却後
生成物を濾過洗浄し、60℃で16時間真空乾燥し117gの生
成物を得た。
この樹脂の粒径は、100〜500μｍであり、水銀ポロシ
メーター法で測定した細孔容積は1.12ml/g乾燥樹脂であ
り、細孔直径100Å以上の細孔に基づく比表面積は53.3m
2/g乾燥樹脂であった。
メーター法で測定した細孔容積は1.12ml/g乾燥樹脂であ
り、細孔直径100Å以上の細孔に基づく比表面積は53.3m
2/g乾燥樹脂であった。
実施例２ 実施例１で得た担体にグルコアミラーゼを固定化した
例について述べる。
例について述べる。
まず担体50mlをカラムに充填し、４％濃度の水酸化ナ
トリウム溶液250mlを50℃にて通液した後イオン交換水
にて洗浄する。次いで0.1M−酢酸・酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.0）約1,000mlを通液して緩衝化した後、担体を
カラムからビーカーに取り出し、同緩衝液に溶解した５
％グルタルアルデヒド溶液100mlを加えて撹拌しながら
１時間反応させ、その後グラスフィルターにて固液分離
し、さらに緩衝液にて過剰のグルタルアルデヒドを洗浄
する。
トリウム溶液250mlを50℃にて通液した後イオン交換水
にて洗浄する。次いで0.1M−酢酸・酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.0）約1,000mlを通液して緩衝化した後、担体を
カラムからビーカーに取り出し、同緩衝液に溶解した５
％グルタルアルデヒド溶液100mlを加えて撹拌しながら
１時間反応させ、その後グラスフィルターにて固液分離
し、さらに緩衝液にて過剰のグルタルアルデヒドを洗浄
する。
上記の方法で調整した担体2g・wetをビーカーに取
り、緩衝液5.7mlとグルカミラーゼ溶液30ml（蛋白量と
して26mg/g・wet添加）とを加え、撹拌しながら２時間
反応させて酵素を固定化し、その後グラスフィルターに
て固液分離し、さらに過剰の酵素を緩衝液にて洗浄して
グルコアミラーゼ固定化酵素を得る。
り、緩衝液5.7mlとグルカミラーゼ溶液30ml（蛋白量と
して26mg/g・wet添加）とを加え、撹拌しながら２時間
反応させて酵素を固定化し、その後グラスフィルターに
て固液分離し、さらに過剰の酵素を緩衝液にて洗浄して
グルコアミラーゼ固定化酵素を得る。
このようにして得た固定化酵素は湿潤担体1g・wetあ
たり22mgの蛋白が固定化されていた。
たり22mgの蛋白が固定化されていた。
この固定化酵素を内径10mmのジャケット付きカラムに
充填し、pH5.0の緩衝液に溶解した10％マルトース液を5
0℃にて通液した。通液の流速は基質マルトースのグル
コースへの転換率が99％になるように初期に設定し、以
後も同一流速にて連続通液してグルコースへの転換率の
経日変化を測定した。
充填し、pH5.0の緩衝液に溶解した10％マルトース液を5
0℃にて通液した。通液の流速は基質マルトースのグル
コースへの転換率が99％になるように初期に設定し、以
後も同一流速にて連続通液してグルコースへの転換率の
経日変化を測定した。
また比較のために前述と同じ酵素量を用い、下記Ａ、
Ｂ、Ｃの３種の異なる方法で調整した固定化酵素をカラ
ムに充填し、10％マルトース液を通液してグルコースへ
の転換率の経日変化を測定した。
Ｂ、Ｃの３種の異なる方法で調整した固定化酵素をカラ
ムに充填し、10％マルトース液を通液してグルコースへ
の転換率の経日変化を測定した。
A:母体がスチレンとジビニルベンゼンの共重合体で交換
基として第三級アミンを有する市販樹脂を緩衝化し、酵
素液を加えて１時間撹拌して吸着させて得た。
基として第三級アミンを有する市販樹脂を緩衝化し、酵
素液を加えて１時間撹拌して吸着させて得た。
B:Aの方法で得られた固定化酵素に、さらに緩衝液に溶
解した0.5％のグルタルアルデヒド溶液を加えて、３時
間撹拌しながら酵素間を架橋して得た。
解した0.5％のグルタルアルデヒド溶液を加えて、３時
間撹拌しながら酵素間を架橋して得た。
C:母体がスチレンとジビニルベンゼンの共重合体で交換
基として第一級アミンを有するものを合成し、本発明の
担体と全く同じ条件で担体と酵素間をグルタルアルデヒ
ドで架橋して固定化した。
基として第一級アミンを有するものを合成し、本発明の
担体と全く同じ条件で担体と酵素間をグルタルアルデヒ
ドで架橋して固定化した。
その結果、通液開始時にグルコースへの転換率が99％
を達成し得る流速は固定化酵素ＡがSV＝2.3（h-1）、Ｂ
がSV＝2.5（h-1）、ＣがSV＝3.2（h-1）であるのに対
し、本発明の固定化酵素の場合にはSV＝3.8（h-1）と大
きく、すなわち初期の活性が非常に高く、かつ固定化酵
素のライフの指標である活性半減期（グルコースへの転
換率が49.5％に低下するまでの通液日数）は第１図に示
したごとく固定化酵素Ａ、Ｂがそれぞれ12日間、25日間
であるのに対して本発明の固定化酵素は68日と極めて優
れた性能を示した。
を達成し得る流速は固定化酵素ＡがSV＝2.3（h-1）、Ｂ
がSV＝2.5（h-1）、ＣがSV＝3.2（h-1）であるのに対
し、本発明の固定化酵素の場合にはSV＝3.8（h-1）と大
きく、すなわち初期の活性が非常に高く、かつ固定化酵
素のライフの指標である活性半減期（グルコースへの転
換率が49.5％に低下するまでの通液日数）は第１図に示
したごとく固定化酵素Ａ、Ｂがそれぞれ12日間、25日間
であるのに対して本発明の固定化酵素は68日と極めて優
れた性能を示した。
次に本発明の固定化酵素の脱着方法について説明する
と、本発明の固定化酵素2g・wetをビーカーに取り、４
％の水酸化ナトリウム水溶液15mlを加えて50℃にて２時
間撹拌し、その後グラスフィルターで固液分離し、さら
に水洗して脱着した酵素蛋白を洗い出す。このようにし
て脱着した担体に前述の方法で酵素を再固定化する。
と、本発明の固定化酵素2g・wetをビーカーに取り、４
％の水酸化ナトリウム水溶液15mlを加えて50℃にて２時
間撹拌し、その後グラスフィルターで固液分離し、さら
に水洗して脱着した酵素蛋白を洗い出す。このようにし
て脱着した担体に前述の方法で酵素を再固定化する。
比較例として上記の固定化酵素Ｃについても全く同じ
条件で脱着、再固定化を実施した。
条件で脱着、再固定化を実施した。
脱着試験の結果、本発明の固定化酵素の場合蛋白脱着
率が98％とほぼ完全に酵素が脱着し、再固定化時の固定
化率も85％と第１回目の88％とほぼ同じであるのに対し
て、固定化酵素Ｃは固定化法が同じであるのに11.3％と
脱着率が非常に低く、また再固定化率も29.6％と第１回
目の49.6％に比べて低下が大きく脱着が困難であった。
率が98％とほぼ完全に酵素が脱着し、再固定化時の固定
化率も85％と第１回目の88％とほぼ同じであるのに対し
て、固定化酵素Ｃは固定化法が同じであるのに11.3％と
脱着率が非常に低く、また再固定化率も29.6％と第１回
目の49.6％に比べて低下が大きく脱着が困難であった。
また本発明の固定化酵素については再固定化後の通液
試験を実施したが、第１図に示したごとく活性半減期も
66日と第１回目とほぼ同じ性能が得られた。
試験を実施したが、第１図に示したごとく活性半減期も
66日と第１回目とほぼ同じ性能が得られた。
さらに本発明の固定化酵素は少なくとも２回〜７回の
脱着、再固定化についても第１回目の固定化酵素とほぼ
同様の初期活性を維持できることが確認されている。
脱着、再固定化についても第１回目の固定化酵素とほぼ
同様の初期活性を維持できることが確認されている。
実施例３ 実施例１で得た担体に実施例２と同様な方法で、ただ
しpH6.0の酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を用い、グルタ
ルアルデヒドを結合した単体2g・wetに0.6ml（蛋白量と
して40mg/g・wet添加）のタカアミラーゼ酵素液を加え
て固定化した。このようにして得られる固定化酵素は1g
あたり18.3mgの蛋白が固定化されていた。基質として分
岐デキストリンにサイクロデキストリングルカノトラン
スファーゼを添加して調整した下記の糖組成の分岐サイ
クロデキストリン生成反応液を基質として、10％濃度、
50℃にて上記固定化酵素を充填したカラムに通液した。
このタカアミラーゼ固定化酵素を用いる反応の主目的は
β−サイクロデキストリン（以下β−CDと表す）のオリ
ゴ糖への分解であるが、酵素反応が強過ぎると一部分分
岐CDをも分解してしまうため、通液方法としては反応液
中にβ−CDが１〜２％分解されずに残るように通液流速
を便宜変更し、処理流速の低下を調べた。
しpH6.0の酢酸・酢酸ナトリウム緩衝液を用い、グルタ
ルアルデヒドを結合した単体2g・wetに0.6ml（蛋白量と
して40mg/g・wet添加）のタカアミラーゼ酵素液を加え
て固定化した。このようにして得られる固定化酵素は1g
あたり18.3mgの蛋白が固定化されていた。基質として分
岐デキストリンにサイクロデキストリングルカノトラン
スファーゼを添加して調整した下記の糖組成の分岐サイ
クロデキストリン生成反応液を基質として、10％濃度、
50℃にて上記固定化酵素を充填したカラムに通液した。
このタカアミラーゼ固定化酵素を用いる反応の主目的は
β−サイクロデキストリン（以下β−CDと表す）のオリ
ゴ糖への分解であるが、酵素反応が強過ぎると一部分分
岐CDをも分解してしまうため、通液方法としては反応液
中にβ−CDが１〜２％分解されずに残るように通液流速
を便宜変更し、処理流速の低下を調べた。
分岐CD反応液の糖組成 デキストリン:56.2％ 分岐CD : 9.0％ α−CD :15.6％ β−CD :17.6％ γ−CD : 2.6％ 比較例としては母体がスチレンとジビニルベンゼンの
共重合体で交換基として第三級アミンを有する市販樹脂
を担体として用い、実施例２の固定化酵素Ａ、Ｂと同様
な固定化法でタカアミラーゼを固定化したものについて
通液を実施した。
共重合体で交換基として第三級アミンを有する市販樹脂
を担体として用い、実施例２の固定化酵素Ａ、Ｂと同様
な固定化法でタカアミラーゼを固定化したものについて
通液を実施した。
その結果第２図に示したごとく、タカアミラーゼの50
℃における熱安定性を十分でないためにいずれも活性半
減期は十分ではないものの、比較例の固定化酵素に比
べ、本発明の固定化酵素は通液開始時の流速すなわち初
期の活性が高く、また活性半減期（通液流速が開始時の
半分になるまで）も長く相対的には非常に優れていた。
℃における熱安定性を十分でないためにいずれも活性半
減期は十分ではないものの、比較例の固定化酵素に比
べ、本発明の固定化酵素は通液開始時の流速すなわち初
期の活性が高く、また活性半減期（通液流速が開始時の
半分になるまで）も長く相対的には非常に優れていた。
また実施例２と同様の方法で脱着、再固定化して得ら
れる本発明の固定化酵素は第２図に示したごとく第１回
目と全く同等の初期活性および安定性を示した。
れる本発明の固定化酵素は第２図に示したごとく第１回
目と全く同等の初期活性および安定性を示した。
第１図は実施例２における固定化グルコアミラーゼの通
液ライフ試験の結果を示すグラフであり、縦軸にグルコ
ース生成率、横軸に通液日数を示し、また第２図は実施
例３における固定化タカアミラーゼの通液ライフ試験の
結果を示すグラフであり、縦軸に通液流速、横軸に通液
日数を示す。
液ライフ試験の結果を示すグラフであり、縦軸にグルコ
ース生成率、横軸に通液日数を示し、また第２図は実施
例３における固定化タカアミラーゼの通液ライフ試験の
結果を示すグラフであり、縦軸に通液流速、横軸に通液
日数を示す。
Claims (7)
- 【請求項１】巨大網状構造を有する塩基性陰イオン交換
樹脂の母体が、不飽和カルボン酸グリシジルエステルの
重合物であり、イオン交換基として第一級アミンを有す
ることを特徴とする酵素固定化担体。 - 【請求項２】塩基性陰イオン交換樹脂の母体が、メタア
クリル酸グリシジルエステルまたはアクリル酸グリシジ
ルエステルあるいはクロトン酸グリシジルエステルと、
架橋剤であるジメタアクリル酸エチレングリコールある
いはジメタアクリル酸ポリエチレングリコールの共重合
物である請求項１記載の酵素固定化用担体。 - 【請求項３】巨大網状構造が有する塩基性陰イオン交換
樹脂の母体が、不飽和カルボン酸グリシジルエステルの
重合物であり、イオン交換基として第一級アミンを有す
る酵素固定化用担体に酵素を固定化するにあたり、前記
第一級アミンにグルタルアルデヒドを架橋剤として介在
させて酵素を結合させたことを特徴とする酵素固定化方
法。 - 【請求項４】塩基性陰イオン交換樹脂の母体が、メタア
クリル酸グリシジルエステルまたはアクリル酸グリシジ
ルエステルあるいはクロント酸グリシジルエステルと、
架橋剤であるジメタアクリル酸エチレングリコールある
いはジメタアクリル酸ポリエチレングリコールの共重合
物である請求項３記載の酵素固定化方法。 - 【請求項５】巨大網状構造を有する塩基性陰イオン交換
樹脂の母体が、不飽和カルボン酸グリシジルエステルの
重合物であり、イオン交換基として第一級アミンを有す
る酵素固定化用担体の前記第一級アミンにグルタルアル
デヒドを架橋剤として介在させて酵素を結合した固定化
酵素を一定期間使用した後、当該固定化酵素に温アルカ
リ溶液を接触させることを特徴とする酵素脱着方法。 - 【請求項６】塩基性陰イオン交換樹脂の母体が、メタア
クリル酸グリシジルエステルまたはアクリル酸グリシジ
ルエステルあるいはクロトン酸グリシジルエステルと、
架橋剤であるジメタアクリル酸エチレングリコールある
いはジメタアクリル酸ポリエチレングリコールの共重合
物である請求項５記載の酵素脱着方法。 - 【請求項７】温アルカリ溶液が、温度40ないし70℃で、
濃度0.5ないし10重量％の水酸化ナトリウム溶液または
水酸化カリウム溶液または炭酸ナトリウム溶液である請
求項５または請求項６記載の酵素脱着方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63008523A JP2595004B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-01-20 | 酵素固定化用担体とその酵素固定化方法および酵素脱着方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63008523A JP2595004B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-01-20 | 酵素固定化用担体とその酵素固定化方法および酵素脱着方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01187086A JPH01187086A (ja) | 1989-07-26 |
| JP2595004B2 true JP2595004B2 (ja) | 1997-03-26 |
Family
ID=11695503
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63008523A Expired - Fee Related JP2595004B2 (ja) | 1988-01-20 | 1988-01-20 | 酵素固定化用担体とその酵素固定化方法および酵素脱着方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2595004B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220286012A1 (en) * | 2021-03-08 | 2022-09-08 | Nidec Corporation | Rotary electric machine and drive device |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19909584A1 (de) * | 1999-03-04 | 2000-09-14 | Haemosys Gmbh | Trennverfahren |
| JP5242230B2 (ja) | 2008-04-21 | 2013-07-24 | 花王株式会社 | 固定化酵素の製造方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5824354A (ja) * | 1981-08-04 | 1983-02-14 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 親水性の弱塩基性陰イオン交換樹脂 |
-
1988
- 1988-01-20 JP JP63008523A patent/JP2595004B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5824354A (ja) * | 1981-08-04 | 1983-02-14 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | 親水性の弱塩基性陰イオン交換樹脂 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20220286012A1 (en) * | 2021-03-08 | 2022-09-08 | Nidec Corporation | Rotary electric machine and drive device |
| US11863043B2 (en) * | 2021-03-08 | 2024-01-02 | Nidec Corporation | Rotary electric machine and drive device |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01187086A (ja) | 1989-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0339087B2 (ja) | ||
| KR940005581B1 (ko) | 효소의 고정화방법 및 고정화 효소 | |
| US5939294A (en) | Immobilization of microogranisms on weakly basic anion exchange substance for producing isomaltulose | |
| JP2595004B2 (ja) | 酵素固定化用担体とその酵素固定化方法および酵素脱着方法 | |
| JPS6219835B2 (ja) | ||
| JP2834190B2 (ja) | 失活酵素の脱着方法 | |
| JPS59205981A (ja) | 微生物の固定化方法および固定化微生物を含む寒天繊維 | |
| JP2661710B2 (ja) | 固定化酵素 | |
| CN100554417C (zh) | 海藻酸-碳酸钙杂化凝胶固定β-葡萄糖醛酸苷酶的方法 | |
| HU204084B (en) | Process for producing enzymes bonded to a carrier | |
| JP2795281B2 (ja) | 固定化酵素 | |
| JP2524984B2 (ja) | 固定化酵素 | |
| JPS6321475B2 (ja) | ||
| JPS63314201A (ja) | シクロデキストリンの固定化方法 | |
| JP2000513570A (ja) | 固定化された微生物によるイソマルツロースの製造方法およびそのための担体 | |
| KR900003710B1 (ko) | 고정화 프럭토실트랜스퍼라제의 제조법 | |
| JPS61185196A (ja) | サイクロデキストリンの生成方法 | |
| JPH0716411B2 (ja) | 固定化酵素 | |
| JP2778975B2 (ja) | マルトシル―サイクロデキストリンの製造方法 | |
| JPS5920357B2 (ja) | 脂質の酵素分解法 | |
| CN1385524A (zh) | 青霉素酰化酶与含青霉素酰化酶细胞的固定化方法 | |
| US5215905A (en) | Immobilization of fructosyltransferase on a basic, porous anion-exchange resin | |
| JPS62155089A (ja) | 固定化酵素 | |
| JPH08501218A (ja) | 固定化グリコラートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下における，グリコール酸の酸化によるグリオキシル酸の製造 | |
| JPH0693837B2 (ja) | 固定化酵素及びその製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |