JPS62155089A - 固定化酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は固定化酵素の製造方法に関する。さらに詳しく
は、酵素の固定化量が多くて活性が高く、かつ繰り返し
使用しても失活することが少ない固定化酵素の製造方法
に関する。

〔従来の技術〕

従来粉末状の酵素を酵素反応に用いていたが、この方法
だと反応終了後、反応系から酵素を分離することが難か
しく操作性が悪く、また分離回収した酵素が再使用でき
ず経済性が悪い等の欠点がある。これらの欠点を解決す
るものとして酵素を担体等に固定化し、酵素反応に用い
る方法が試みられている。

すなわち固定化酵素は、反応系からの分離が簡単で、反
応の制御が容易に行え、均質な生成物が得られ、また使
用した酵素は再使用が可能で経済性に優れる。さらに固
定化酵素は粉末状で用いるよりも耐熱性が増し反応温度
を高くすることができ反応速度、反応率が増加する等の
利点を有する。

酵素を固定化する方法としては、担体結合法、架橋法、
包括法等が知られている。なかでも強度が高く実用的で
、かつ製造の容易な担体結合法が優れている。例えば架
橋法は激しい条件下で酵素の架橋反応を行なうため酵素
が失活し易く得られる固定化酵素は活性が低い。また包
括法は製造時の重合反応の制御が難かしく、また得られ
る固定化酵素は強度が少ないあるいは繰り返し使用時に
酵素が脱離し活性が低下する等の欠点がある。

担体結合法としては例えばマクロ多孔性フェノールホル
ムアルデヒド系陰イオン交換樹脂を担体とし、これに酵
素を吸着し固定化する方法（特開昭５９−１８３６９１
　）多糖類ゲルにリポキシゲナーゼを固定化する方法（
特公昭５９−５１２８０　）等が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながらイオン交換樹脂を担体とする方法は、多孔
質型の樹脂を用いた場合、ゲル型の樹脂に比べて酵素の
固定化量が増すものの主として樹脂の内部に酵素が固定
されるため、酵素を作用させる液との接触率が低く、有
効に働く酵素の量が少ないこと、固定化された酵素の結
合力が弱く担体から遊離しやすいこと等の欠点がある。

また多糖類ゲルを担体として用いる方法は、担体の強度
が低く反応に用いると破砕して損耗率が高い、カラムに
充填して反応を行なう場合圧力損失が太きく、取扱いが
難かしい等の欠点がある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上記課題を解決するため鋭意研究を行なっ
た結果、特定の樹脂母体を有し、かつアミノ基およびポ
リエーテル基を官能基として有する樹脂を用い、これに
酵素を吸着させ、さらに多官能性架橋剤で酵素を樹脂上
に固定化することにより、酵素の吸着固定化量が多くて
活性が高く、強度が強（苛酷な反応条件下でも使用でき
、かつ酵素の庶出が少なく繰り返し使用にも十分耐える
固定化酵素の製造方法を見出し本発明を完成するに至っ
た。

即ち本発明は官能基を有する樹脂を担体とし、この担体
に酵素を吸着させた後、さらに多官能性架橋剤を反応さ
せて固定化酵素を製造する方法において、担体としてス
チレン−ジビニルベンゼン共重合樹脂、塩化ビニル樹脂
、塩化ビニリデン樹脂のいずれかの樹脂母体に、モノあ
るいはポリアミノ基およびポリエーテル基を官能基とし
て有する樹脂を用い、この担体に酵素を吸着させた後、
さらに多官能性架橋剤を反応させる固定化酵素の製造方
法である。

本発明において用いる固定化酵素用の担体としてはスチ
レン−ジビニルベンゼン共重合体、塩化ビニル樹脂、塩
化ビニリデン樹脂のいずれかを樹脂母体とし、これにア
ミノ基およびポリエーテル基を官能基として有する樹脂
が挙げられ、特にスチレン−ジビニルベンゼン共重合体
を樹脂母体とし、かつアミ７基およびポリエーテル基を
官能基として有する樹脂が好ましい。また担体としての
樹脂はゲル型もしくはポーラス型が存在するが、酵素の
吸着量を多（し固定化率を、高める上でポーラス型樹脂
が望ましい。

上記担体としての樹脂は例えば、■スチレンージビニル
ベンゼン系共重合体にクロロメチルエーテルを反応せし
めてクロロメチル化した後、導入したクロロメチル基の
一部にアンモニアあるいはエチレンジアミン、ジエチレ
ントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレ
ンペンタミン、ペンタエチレンへキサミン等のポリアル
キレンポリアミンを反応せしめて１級または２級アミノ
基を導入し、ついで残部のクロロメチル基にエチレンオ
キサイド重合体、プロピレンオキサイド重合体、ブチレ
ンオキサイド重合体等のポリエーテル型ジオール、好ま
しくは分子量１，０００〜１０，０００のポリエーテル
型ジオールを水素化ナトリウム、水素化カリウムの存在
下に作用させポリエーテル基を形成せしめるかまたは残
部のクロロメチル基にポリエーテル型ジオールとナトリ
ウム、カリウムとのアルコラードを作用させ、ポリエー
テル基を形成せしめたアミン基およびポリエーテル基を
有する樹脂、■塩化化工ニル樹脂たは塩化ビニリデン樹
脂に、その有する塩素の一部にポリアルキレンポリアミ
ンを反応せしめて１級または２級アミン基を導入し、つ
いで残部の塩素にポリエーテル型ジオールを水素化ナト
リウム、水素化カリウムの存在下に作用させポリエーテ
ル基を形成せしめるか、または残部の塩素にポリエーテ
ル型ジオールとナトリウムまたはカリウムとのアルコラ
ードを作用させポリエーテル基を形成せしめたアミン基
およびポリエーテル基を有する樹脂等が挙げられる。こ
れらの樹脂のうちでも上記■の樹脂が好ましく、特にク
ロロメチル化したスチレン−ジビニルベンゼン兵重合体
に溶剤の存在下アンモニアあるいはポリアルキレンポリ
アミンを反応せしめた後、水素化リチウムまたは水素化
カリウムの存在下にポリエーテル型ジオールを反応せし
めポリエーテル基を導入した樹脂が好ましい。上記反応
に用いる溶剤としてはベンゼン、トルエン、キシレン、
ジオキサン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＭＥＫ等が挙げられる。

ポリエーテル基の導入は、ポリエーテル型ジオールの片
端だけが反応して樹脂母体に枝状に結合した状態のポリ
エーテル基よりも、両端が反応して環状に結合した状態
のポリエーテル基を多く生成するのが良（、そうするこ
とによりこの環状に結合した状態のポリエーテル基はそ
の環の中に酵素を安定に固定化して酵素の脱離が極めて
少なくなる。

樹脂に導入するアミン基とポリエーテル基の比はモル比
（ポリアルキレンポリアミンとポリエーテル型ジオール
の形にて）で１：１〜１０が好ましく、この範囲であれ
ば樹脂に対する酵素の吸着量が多く、かつ吸着された酵
素を多官能性架橋剤で強固に固定することができる。ポ
リエーテル基の導入量が１モル以下では酵素の吸着量が
少なく、また１０モル以上では酵素の吸着量が多いもの
の、それを多官能性架橋剤により固定するに際し、固定
化力が弱いものとなる。

本発明に用いる酵素としてはリパーゼ、リポオキシナー
ゼ、インベルターゼ、カタラーゼ、アスパルターゼ、ア
スパラギナーゼ等が挙げられるが特に上記に限定されな
い。

本発明において担体に酵素を吸着させる方法としては、
例えば担体１ｇあたり１０〜５００　ｍｇの酵素を担体
に対し容量で３〜２０倍の水または緩衝液に溶解した酵
素溶液を調製し、この酵素溶液に担体を浸漬し３０分〜
８時間撹拌して吸着するバッチ法、担体をカラムに充填
し酵素溶液を通液速度ＳＶ０．５〜２０で通液し吸着す
るカラム法等が挙げられる。

酵素を溶解した溶液のｐＨは酵素が失活しない範囲であ
れば特に限定されないが酵素の失活を防ぐためｐＨ３〜
１０に調整し吸着反応に用いることが好ましい。また酵
素溶液の液温は酵素の失活を防ぐため０〜３５°Ｃで吸
着に用いることが好ましい。

酵素を吸着した担体は、酵素が主として環状のポリエー
テル基に強固に吸着され、このまま反応に用いても酵素
の脱離する恐れは少ないが、さらに多官能性架橋剤を反
応させ固定化することにより、繰り返し使用等のより苛
酷な使用条件に耐えるものとなる。

本発明に用いる多官能性架橋剤としては、グルタルアル
デヒド、マロンアルデヒド、スクシニルアルデヒド、グ
リオキザール、ジアルデヒド澱粉等が挙げられる。

酵素を吸着した担体に多官能性架橋剤を反応させ酵素を
固定化する反応は、多官能性架橋剤水溶液に酵素を吸着
した担体を添加し撹拌して行なう。

反応条件としては酵素が失活しないよう、例えば多官能
性架橋剤水溶液の濃度１〜２０重量％、ｐＨ３〜１０、
反応温度０〜３５°Ｃが好ましく、このような条件下に
反応を１５分〜２４時間行なう。反応終了後は、水また
は緩衝液で洗浄を行ない、未反応の多官能性架橋剤ある
いは脱離しやすい酵素を除去することが好ましい。

上記のようにして得られる固定化酵素は、酵素の固定化
量が多くて活性が高（、かつ繰り返し使用しても失活す
ることが少なく、例えばトリグリセライドの加水分解反
応、トリグリセライドのエステル交換反応、エステルの
合成反応、リン脂質ノエステル交換反応、トリグリセラ
イドの酸化反応等の反応に用いることができる。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳しく説明する。

実施例１ キャンディダンリンドラッセ起源の乾燥粉末リパーゼ（
活性３６０　ｕｎｉｔ／　ｍｇ）　３　ｇを０．０５　
モル濃度のリン酸水溶液１５０而に溶解しｐＨ６，０の
溶液を調製した。

球状ホーラス型のスチレンージビニルベンゼン共重合体
を（粒度゛２０〜４０メツシュ）をクロルメチル化した
後、ジオキサン中に導入されたクロルメチル基の１０モ
ル％にアンモニアを反応させ残部のクロルメチル基にポ
リエチレングライコール（Ｍ　Ｗ　５０００　）のジン
デュームアルコラートを反応させて得られた樹脂３０ｇ
を上記リパーゼ溶液に加え、室温で５時間撹拌した後樹
脂を濾別し、ついで十分に水洗してリパーゼを吸着した
樹脂を得た。

リパーゼを吸着した樹脂を、リン酸でｐＨ５に調整した
０、０５モル濃度のグルタルアルデヒド水溶液２００　
ｍ！に加え、室温で５時間反応を行なった後樹脂を濾別
し水洗してリパーゼを固定化した樹脂（以下固定化リパ
ーゼと称する）を得た。

この固定化リパーゼは、オリーブ油の加水分解を行ない
３７°Ｃで１分間に１μｍｏｌ当量の脂肪酸を遊離する
のに必要な酵素量をｌ　（Ｊｎｉｔとすると（０農化３
６８６０　（１９６２））、１ｇ当り３５　Ｕｎｉｔ　
ノ活性（酵素の固定化Ｍ　１２１　ｍｇ／　ｇ−固定化
リパーゼ）であった。

上記固定化リパーゼ２０ｍ１をサフラワー油と水（１：
１ｖ／ｖ）ノ混合液１００ｍ１に添加し、振とう機（１
２４ストｏ　−り／ｍ１ｎ）を用いて、３７°Ｃで２４
時時間上うして、サフラワー油の加水分解反応を行なっ
た。加水分解率は９８％であった。

上記で使用した樹脂を用いて、上記と同様の条件でサフ
ラワー油の加水分解反応を繰り返し行なったところ、１
０回目の加水分解率は９０％であった。

比較例１ 球状、ポーラス型の弱塩基性イオン交換樹脂（粒度：２
０〜４０メツシユ）に実施例１と同様にキャンディダシ
リンドラッセ起源の乾燥粉末リパーゼの０．０５モルリ
ン酸水溶液（ｐＨ６）を用いてリパーゼを吸着せしめ、
次いで実施例１と同様にリン酸でｐＨ６に調整した０、
０５モル濃度のグルタルアルデヒド水溶液を用いて固定
化反応を行ない、固定化リパーゼを得た。得られた固定
化リパーゼの活性は２ＯＵ賃ｔ／ｍｇであった。

この固定化リパーゼの加水分解能を実施例１と同様にサ
フラワー油と水（１：ｌｖ／ｖ）混合液を用いて測定し
たところ、サフラワー油に対する加水分解率は１回目が
９６％であり、５回目は７０％であった。

実施例２ リゾブスデルマ由来のリパーゼ（活性３５Ｑ　Ｕｎｉｔ
　／ｍｇ）２ｇを０．０５　モルリン酸水溶液１００ｍ
１に溶解しｐＨ６の溶液を調製した。

２０〜４０メツシユの塩化ビニル樹脂に、その有するク
ロルの１０モル％をテトラヒドロフラン中アジモニアで
置換し、残部のクロルにポリオキシプロピレングライコ
ール（ＭＷ　５０００　）のジンデュームアルコラート
を反応させて得られた樹脂３０ｇを上記リパーゼ溶液に
加え室温で５時間撹拌した後、樹脂を濾別し水洗してリ
パーゼを吸着した樹脂を得た。この樹脂に実施例１と同
様に、０．０５モル濃度のグルタルアルデヒド（１）Ｈ
６）１５０ｍｌを用いて１しで−ゼの固定化を行ない、
樹脂１ｇ当り５Ｑ　Ｕｎｉｔの活性を有する固定化リパ
ーゼを得た。

この固定化リパーゼ１０而を、サフラワー油５０ｇ、パ
ルミチン酸エチル５０ｇ及びｎ−ヘキサン１００　ｇか
らなる混合溶液に添加し、４０°Ｃで４８時間撹拌して
、エステル交換反応を行なった。反応終了後反応液をＴ
ＬＣで、トリグリセリドを分解抽出してエステル交換油
（Ａ）を得た。さらに使用した固定化すぐ一ゼを用いて
上記と同様の条件でエステル交換反応を繰り返し、計５
回用いてエステル交換油（Ｂ）を得た。

サフラワー油および得られたエステル交換油の脂肪酸組
成をＧＬＣで分析しその結果を表−１に、また各々のβ
位に結合する脂肪酸の分析結果を表−２に示す。

表−１ 表−２ 比較例２ エポキシアクティベイティドセファロース６Ｂ（ファル
マンア社製）に実施例２と同様にリゾプスデルマ由来の
リパーゼの０，０５モル濃度リン酸水溶液を用いてリパ
ーゼを吸着せしめ、次いで実施例２と同様に００５モル
濃度のグルタルアルデヒド水溶液を用いて固定化反応を
行ない、固定化リパーゼを得た。得られた固定化リパー
ゼの活性は２５Ｕｎｉｔ　／　ｇであった。

この固定化リパーゼを用いて実施例２と同様に、サフラ
ワー油ドパルミチン酸エチルとのエステル交換反応を行
ない、得られたエステル交換油（Ｃ）を得た。さらに使
用した固定化リパーゼを用いて上記と同様の条件でエス
テル交換反応を繰り返し、計５回用いてエステル交換油
（Ｄ）を得た。

サフラワー油および得られたエステル交換油の脂肪酸組
成をＧＬＣで分析しその結果を表−３に、また各々のβ
位に結合する脂肪酸の分析結果を表＝４に示す。

表−３ 表−４ 実施例３ 大豆起源の乾燥粉末リパーゼ（リポキシナーゼ１、活性
１５０　Ｕｎｉｔ／ｍｇ）　１　ｇを０．００５　モル
濃度のホウ酸水溶液１００而に溶解してｐＨ６，５の溶
液を調整した。

球状、ポーラス型のスチレン−ジビニルベンゼン共重合
体（粒度：２０〜４０メツシユ）をクロルメチル化した
後、トルエン中導入されたクロルメチル基の５％にエチ
レンジアミンを反応しトルエンを留去し、ジオキサン中
で残部のクロルメチル基にポリエチレングリコール（Ｍ
Ｗ　７０００　）のジソデュームアルコラートを反応さ
せて得られた樹脂２０ｇを上記リパーゼ溶液に加え、１
０°Ｃで３時間撹拌した後、樹脂を濾別し、さらに十分
水洗してリパーゼを吸着した樹脂を得た。

リパーゼを吸着した樹脂を、リン酸でｐＨ６，５に調整
した０５モル濃度のグルタルアルデヒド水溶液１５０　
ｍｌに加え、５°Ｃで３時間撹拌した。撹拌終了後樹脂
を濾別し十分水洗して、樹脂１ｇ当り７５Ｕｎｉｔの活
性を有する固定化リパーゼを得た。

この固定化リパーゼｌＱｍｌとサフラワー油３Ｑｍｌを
イオン交換水３Ｑ　ｍｌに加え、液温を３０°Ｃに保ち
ながら超音波による撹拌下に空気を吹き込んで酸化反応
を行なった。反応中、経時的に反応液の紫外線吸光度（
２３４ｎｍ）を測定し、単位時間当りの酸化物（共役オ
クタジエン酸）の生成量を求め、酸化反応の速度を算出
した。この時の反応速度は０．９　ミＩＪモル／分であ
った。

実施例４ クロモバクテリウムリパーゼ（１３Ｕｎｉｔ／ｍｇ）　
３　ｇを０．０５モル濃度のリン酸水溶液１５０ｍ１に
溶解し、ｐＨ５，５の溶液を調製した。

塩化ビニリデン樹脂をクロルメチル化し、ＤＭＦ中で導
入したクロルメチル基の５モル％にトリエチレンテトラ
ミンを反応しＤＭＦを留去し、ついで応して得られた樹
脂３０ｇを上記リパーゼ溶液に加え実施例１と同様に室
温で５時間撹拌して、樹脂にリパーゼを吸着させ、つい
で０．０５モルｅ度のグルタルアルデヒドで酵素を固定
化して樹脂１ｇ当り３０　Ｕｎｉｔの活性を有する固定
化リパーゼを得た。

この固定化リパーゼ１０ｍ１をグリセリン５モルとオレ
イン酸１モルとの混合溶液に加え４０°Ｃで７２時間撹
拌してエステル化反応を行なったところ、グリセリンの
エステル化率は９５％であった。

〔発明の効果〕

以上説明したように本発明はアミノ基およびボリエーテ
ル基を官能基として有する特定の樹脂を担体とし、この
樹脂担体に酵素を吸着させた後、さらに多官能性架橋剤
を反応せしめる固定化酵素の製造方法であり、酵素の固
定化量が多くて活性が高（、かつ担体に酵素が強固に結
合した固定化酵素が得られ、従来の固定化酵素に比べて
少量の添加量でエステル交換反応、加水分解反応、エス
テルの合成反応等を行なうことができ、かつ繰り返し使
用しても活性の低下が少なく経済性に優れる等の効果を
有する。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、官能基を有する樹脂を担体とし、この担体に酵素を
   吸着させた後、さらに多官能性架橋剤を反応させて固定
   化酵素を製造する方法において、担体としてスチレン−
   ジビニルベンゼン共重合体、塩化ビニル樹脂、塩化ビニ
   リデン樹脂のいずれかを樹脂母体とし、かつアミノ基お
   よびポリエーテル基を官能基として有する樹脂を用い、
   この担体に酵素を吸着させた後、さらに多官能性架橋剤
   を反応させることを特徴とする固定化酵素の製造方法。