CN112980826B - 一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其制备方法和应用。该方法包括将含有丙烯酰胺单体和N,N‑亚甲基双丙烯酰胺的水相和含有复配乳化剂的有机相混合后，进行反相乳液聚合反应而得到聚丙烯酰胺水凝胶微球的步骤以及将脂肪酶物理吸附到所述聚丙烯酰胺水凝胶微球而得到脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的步骤，其中所述复配乳化剂为是司盘类乳化剂和吐温类乳化剂混合而制备得到，所述复配乳化剂的HLB值为3～7。本发明所得催化材料环保无毒、易于从反应体系中分离、可循环利用，从而在生物催化、食品工业等各个领域都将有广泛的应用价值。

Description

一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其制备方法和应用，属于酶固定化领域。
背景技术
脂肪酶是一种具有多种催化能力且能够催化一些不溶于水的底物的酶，因此广泛应用于许多反应中，如酯键的水解、合成、醇解、氨解、过氧化、环氧化和酯交换等，又因为酶本身所具有的高效、专一性强、反应条件温和等特点，在食品、化学医药、化妆品生产等领域具有广泛的应用前景。然而，酶在非生理环境中的脆性和快速老化限制了它们的工业应用，并且脂肪酶结构中的三种氨基酸丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸所形成的“盖子”结构对脂肪酶的催化活性中心与底物的结合影响很大，需要一个微水环境来帮助脂肪酶暴露活性中心，以便脂肪酶与有机相中的底物结合来充分发挥催化活性。为了克服这些缺点，人们开发了各种方法来提高脂肪酶的性能，如基因工程、酶的化学修饰和固定化等方法。其中酶的固定化是一种很有前途的方法，可以提高酶的稳定性、活性和选择性。
常用的固定化方法通常是通过共价结合、物理吸附或包埋等方式将酶固定在各种载体上。例如大孔树脂，介孔二氧化硅，溶胶凝胶材料，磁性颗粒等都被用作固定化载体。物理吸附法反应条件温和，可以很大程度上保留酶本身的构相，因此可以极大程度上减少酶的变性或失活，而且因为制作工艺简单，使用成本较为低廉，所以将其应用于研究的也相对比较多。物理吸附法所使用的载体也比较广泛，既可以是无机材料也可以是高分子材料。
众多的研究表明，在这些材料当中，相对较软、生物相容性较好，具有交联网络结构的水凝胶是一类理想的固定化酶基材。用这种基材固定酶易于分离，不仅可以保留酶的最大活性，其具有的机械性能还可以有效增强酶的稳定性。水凝胶也会为酶提供一种半湿润的环境，这种环境对维持酶的活性非常重要。但传统的水凝胶通常以形成对酶的包封来达到固定化效果，这样就极大的增加了酶与底物的传质阻力。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料及其的制备方法，该方法是将丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶于水相后与含有复配乳化剂的有机相混合，形成反相乳液，加入引发剂后进行聚合反应生成聚丙烯酰胺水凝胶微球，再将脂肪酶物理吸附到微球上，得到脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。聚丙烯酰胺无毒无味，耐酸碱，强度好，可通过廉价易得的丙烯酰胺作为单体聚合得到。聚合物分子链中氨基作为固定化载体具有高蛋白质亲和性且其生物相容性好，安全无毒。本发明利用聚丙烯酰胺微球的微孔结构所带来的大的比表面积，以及丙烯酰胺结构中酰胺基与脂肪酶之间形成的大量氢键对脂肪酶进行有效的负载。此外聚丙烯酰胺水凝胶微球的吸水性和高含水量则可以为脂肪酶在不含水的底物中营造出一个微水环境，帮助脂肪酶中的三种氨基酸所形成的“盖子”结构的打开，使脂肪酶的活性中心与底物相接触，从而完成一些酯化，转酯等反应，充分发挥脂肪酶的催化性能。
本发明的技术方案如下：
一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法，包括将含有丙烯酰胺单体和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的水相和含有复配乳化剂的有机相混合后，进行反相乳液聚合反应而得到聚丙烯酰胺水凝胶微球的步骤以及将脂肪酶物理吸附到所述聚丙烯酰胺水凝胶微球而得到脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的步骤，其中所述复配乳化剂是司盘类乳化剂和吐温类乳化剂混合而制备得到，所述复配乳化剂的HLB值为3～7。
在上述技术方案中，所述司盘类乳化剂为司盘85、司盘65、司盘80、司盘60中的一种，优选为司盘80，所述吐温类乳化剂为吐温80、吐温60、吐温40、吐温20中的一种，优选为吐温80。在复配乳化剂中，司盘类乳化剂和吐温类乳化剂的质量比为1：0.1～0.4，优选为1：0.2～0.3。
在上述技术方案中，在所述水相中所述丙烯酰胺单体和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为1：0.003～0.03，优选为1：0.01
在上述技术方案中，所述水相是将丙烯酰胺单体和N,N-亚甲基双丙烯酰胺加入到含有分散剂的无水乙醇或水中，搅拌溶解而制备得到，其中所述分散剂为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种。分散剂在水相分散介质(即无水乙醇或水)中的质量百分浓度为0.1～0.8％。制备水相时，可在适当加热温度下进行搅拌溶解，以达到充分溶解的目的，优选加热温度为70℃以下，更优选为50～65℃。
在上述技术方案中，所述有机相是将复配乳化剂加入到有机相分散介质中，搅拌溶解而制备得到，其中所述有机相分散介质为二甲苯、正己烷、环己烷中的一种，所述复配乳化剂在分散介质中的质量体积浓度(W/V，g/mL)为1～20％，优选为5～15％。制备有机相时，可在适当加热温度下进行搅拌溶解，以达到充分溶解的目的，优选加热温度为70℃以下，更优选为50～65℃。
在上述技术方案中，所述反相乳液聚合反应步骤为，将所述水相和有机相混合，在50～65℃下搅拌20～60min并通入氮气以制备油包水型乳液，加入引发剂，在70～85℃、搅拌下反应2～8h，其中，所述搅拌的速率为350～800rpm。所述引发剂为偶氮二异丁腈、过硫酸铵、过硫酸钾中的一种。所述引发剂在反相乳液聚合反应的反应液中的质量百分浓度为0.05～0.5％。所述水相和有机相优选按质量比1：1～7进行混合，更优选1：2～5。
在上述技术方案中，所述脂肪酶的物理吸附的方法为，将所述聚丙烯酰胺水凝胶微球放入含有所述脂肪酶的酶溶液中，在350～800rpm下振荡1～12h，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球。通过在适当速度下进行振荡，能够使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的。其中，脂肪酶按适当的浓度制备成酶溶液，并与聚烯酰胺水凝胶微球接触，使脂肪酶充分吸附到聚烯酰胺水凝胶微球表面以及形成在微球中的微孔中。酶溶液的浓度不进行特别限定，本领域技术人员可根据实际需要能够适当调整酶溶液的浓度。聚丙烯酰胺水凝胶微球和酶溶液按照质量体积(g/mL)比1:10～100进行混合，优选1:25～60，并进行振荡。
在上述技术方案中，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶发酵液。
在本发明优选的技术方案中，脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)将丙烯酰胺(12g)、N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g)、0.18g分散剂加入到30～50mL无水乙醇或水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将8～12g复配乳化剂加入到80～150mL有机相分散介质中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下剧烈搅拌20～60min并通入氮气以制备油包水型乳液，加入引发剂，并在70～85℃进行反相乳液聚合2～8h，机械搅拌速率保持恒定在350～800rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡1～12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的。
在本发明中，在制备水相中所使用的分散剂浓度对反相乳液聚合反应的进行及微球粒径的大小有重要的影响。提高分散剂的浓度，会减小均相界面的表面张力，同时也会提高体系的粘度，增大单体液滴的运动阻力，使其相互间的碰撞力减小，有利于形成小粒径的单体液滴。使用低分散剂浓度，能得到较大粒径颗粒，使用高分散剂浓度，能得到较小粒径颗粒。
在本发明中，复配乳化剂的用量对乳液的稳定性和产物微球的粒径有着重要的影响。乳化剂的作用是降低乳液的表面张力，使单体乳化成小液滴并形成胶束，提供引发和聚合的场所。一般情况下，随着乳化剂浓度的增高，乳液体系会更加稳定；但是高浓度的乳化剂会形成更多的胶束，从而产生更多的可聚合场所，使得最终的乳胶粒子粒径减小。
在本发明中，所述机械搅拌速率对聚合反应的进行及微球粒径的大小有重要的影响。机械搅拌在反相乳液聚合反应中起着重要作用，不仅直接关系到最终聚合物粒子的粒径大小及其分布，而且也影响着聚合反应体系的传热效果。在单体聚合初期，机械搅拌能够维持单体小液滴的分裂与聚并平衡，机械搅拌强度越大，剪切力越大，体系处于湍流的状态，大液滴就会分裂为小液滴，随着搅拌速度的增大，会导致液滴碰撞聚并。如果搅拌强度过大或者过小，都会增加粒子间碰撞的几率，使得粒子之间发生粘结，使得最终聚合物粒子的粒径变大。
本发明的另一目的是提供上述方法制得的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料，该催化材料由聚丙烯酰胺为主体，脂肪酶物理吸附在聚丙烯酰胺水凝胶微球表面。
本发明所述脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料，先由丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺水凝胶微球，丙烯酰胺结构中酰胺基与脂肪酶之间形成的大量氢键使脂肪酶吸附在聚丙烯酰胺水凝胶微球表面，得到脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球。聚丙烯酰胺水凝胶微球由丙烯酰胺主体，N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂聚合形成聚丙烯酰胺水凝胶微球，微球所具有的孔道结构提供了较大的比表面积，为脂肪酶提供了充足的附着位点。聚丙烯酰胺水凝胶微球与脂肪酶通过较强的氢键作用组装，完成了对酶的负载。
本发明的另一目的是提供上述脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料作为酯化反应的催化剂的用途。尤其是作为催化共轭亚油酸与无水乙醇发生酯化反应生成共轭亚油酸乙酯的催化剂的用途。
本发明合成了聚丙烯酰胺水凝胶微球，该材料的微米级尺寸和孔道结构具有比表面积较大的优点，丙烯酰胺结构中酰胺基与脂肪酶之间形成的大量氢键使脂肪酶吸附在聚丙烯酰胺水凝胶微球表面，还可以最大程度的保持酶的天然构象而不降低酶活力。同时本发明利用聚丙烯酰胺水凝胶微球的吸水性和高含水量可以为脂肪酶在不含水的底物中营造出一个微水环境，帮助脂肪酶中的三种氨基酸所形成的“盖子”结构的打开，使脂肪酶的活性中心与底物相接触，从而完成一些酯化，转酯等反应，充分发挥脂肪酶的催化性能，并将其应用于合成共轭亚油酸乙酯的催化反应中。
通过本发明的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
(1)采用反相乳液聚合法制备了聚丙烯酰胺水凝胶微球，结合了该材料的微米级尺寸和孔道结构所带来的大的比表面积，以及丙烯酰胺结构中酰胺基与脂肪酶之间形成的大量氢键可以使脂肪酶吸附在聚丙烯酰胺水凝胶微球表面的优点，将其作为酶固定化的载体。
(2)通过物理吸附法固定脂肪酶，因聚丙烯酰胺水凝胶微球的特性使载体与酶有较强的作用力从而不易脱落还可以最大程度的保持酶的天然构象而不降低酶活力。
(3)脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球的吸水性和高含水量则可以为脂肪酶在不含水的底物中营造出一个微水环境，帮助脂肪酶中的三种氨基酸所形成的“盖子”结构的打开，使脂肪酶的活性中心与底物相接触，从而完成一些酯化，转酯等反应，充分发挥脂肪酶的催化性能。
(4)本发明固定化成本低、耗时短、试验操作简单、所用材料生物相容性好，可大规模应用于工业生产中。
附图说明
图1为脂肪酶、实施例5中所合成的聚丙烯酰胺水凝胶微球、脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球的红外光谱图。
图2为实施例3、例5、例8所得聚丙烯酰胺水凝胶微球扫描电镜图。
图3为示出脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球的循环利用性的图。
图4为以共轭亚油酸、无水乙醇为原料生成共轭亚油酸乙酯的红外光谱图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案更加清晰，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用的试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
下述实施例所用的材料以及脂肪酶酶活力测定的方法：
1、材料：
脂肪酶：南极假丝酵母脂肪酶，购自深圳绿维康公司。
丙烯酰胺：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
N,N-亚甲基双丙烯酰胺：购自天津市光复精细化工研究所。
磷酸盐缓冲液(PBS)：0.01M，pH 7.4，按照常规方法配置得到。
2、脂肪酶酶活力的测定方法：以棕榈酸对硝基苯酯(p-NPP)为底物，采用比色法，底物在脂肪酶的催化下生成对硝基苯酚(p-NP)，其中p-NP在402nm的波长下有最大吸光值。在一定浓度范围内，体系的吸光度值与p-NP的浓度呈线性关系。具体操作步骤如下：
(1)对硝基苯酚标准曲线的绘制：将p-NP(2mM)分别稀释成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2μmol/mL，依次加入4mL底物乳化液以及5mL反应终止液(Na2CO3水溶液)，以p-NP的浓度为横坐标，OD402 nm值为纵坐标，绘制标准曲线。
(2)酶活力的测定：分别取四支试管，一支作为空白对照，另外三支作为样品(三个平行试验)，首先，将含固定化酶的PBS溶液、底物溶液、终止液分开预热5-10min(37℃)，然后向1mL含有固定化酶的PBS溶液中加入4mL的底物溶液，持续振荡反应5min，最后向反应体系中加入终止液Na2CO3持续振荡5min，而后将固定化脂肪酶与反应体系用离心机分离，上清液在402nm波长下测OD值，收集固定化脂肪酶，再次加入上述反应体系中，在相同条件下进行催化与分离，实现脂肪酶的循环利用，并对每个循环中脂肪酶的酶活力进行检测。空白对照以1mL PBS溶液作为对照。
脂肪酶活力单位(U)定义为：在上述实验条件下，1min内催化底物释放出1μmol的对硝基苯酚所需要的酶量定义为一个酶活单位。
实施例1
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将8g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.12g，0.08％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中机械搅拌速率保持恒定在350rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例2
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将9g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.12g，0.08％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中机械搅拌速率保持恒定在350rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例3
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将10g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.12g，0.08％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中机械搅拌速率保持恒定在350rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例4
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将11g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.12g，0.08％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中机械搅拌速率保持恒定在350rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例5
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将12g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.12g，0.08％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中机械搅拌速率保持恒定在350rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例6
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将10g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.12g，0.08％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中，机械搅拌速率保持恒定在500rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例7
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将10g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.12g，0.08％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中，机械搅拌速率保持恒定在650rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例8
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将10g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.12g，0.08％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中，机械搅拌速率保持恒定在800rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例9
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将10g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.14g，0.1％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中机械搅拌速率保持恒定在500rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例10
(1)将丙烯酰胺(12g，168.82mmol)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(0.12g，0.78mmol)，0.18g聚乙烯吡咯烷酮加入到40mL纯净水中，在65℃下机械搅拌至溶解，作为水相；
(2)将10g复配乳化剂(司盘80：吐温80＝1：0.3)加入到120mL环己烷中，在65℃下机械搅拌至充分混合，作为有机相；
(3)将有机相、水相混合，反应器在65℃下以500rpm搅拌30min并通入氮气除去溶液中氧气以制备油包水型乳液，加入过硫酸铵(0.1g，0.07％)，并在70℃进行反相乳液聚合反应2h，聚合反应过程中机械搅拌速率保持恒定在500rpm；
(4)反应结束后，依次用乙醇和水彻底洗涤制备得到的聚丙烯酰胺水凝胶微球，除去未反应的单体；
(5)称取0.5g聚丙烯酰胺水凝胶微球放入20mL的浓度为20mg/mL的脂肪酶溶液中，然后放到摇床上震荡12h，使酶与聚烯酰胺水凝胶微球充分接触，达到尽可能多的吸附脂肪酶的目的，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
实施例11
图1为脂肪酶、实施例5中的聚丙烯酰胺水凝胶微球和脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球的红外吸收光谱图。图中脂肪酶中的特征峰1635cm-1、1538cm-1为游离脂肪酶中-CONH(酰胺键)的伸缩振动峰，2800-3000cm-1的峰为-CH2和-CH3的伸缩振动峰，在3419cm-1为-OH的伸缩振动峰。图中聚丙烯酰胺水凝胶微球的特征峰3436cm-1为伯酰胺N-H伸缩振动峰，2929cm-1处的吸收峰为-CH2的不对称伸缩振动峰，1645cm-1处的吸收峰为C＝O的伸缩振动峰，1453cm-1为-CH2和-CH3的弯曲振动峰。红外结果显示，聚丙烯酰胺水凝胶微球被成功地制备出来。从红外谱图中可以看出脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球同时具有脂肪酶和聚丙烯酰胺水凝胶微球的特征吸收峰。这些结果表明，脂肪酶成功地吸附到了聚丙烯酰胺水凝胶微球上。
图2中的图a、b、c分别为实施例3、实施例5、实施例8所合成的聚丙烯酰胺水凝胶微球的扫描电镜图。从图中可以看出，随着复配乳化剂用量的增多和机械搅拌速率的增大，聚丙烯酰胺水凝胶微球的粒径随之减小。
实施例12
按照所述的酶活力检测方法，检测上述实施例1-10的方法制备得到的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球的催化活性以及循环利用性能，结果如图3。由图3可知，所制备的载体吸附脂肪酶后的酶催化活性为2018.62U/g，(游离酶发酵液的酶活力为(2431.29U/g)。本发明中制备的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球所采用的物理吸附的方法固定脂肪酶，很好地保留了脂肪酶的活性，并且经过11次重复使用后酶活力还能达到初始酶活力的34％左右。图3是只是例示出在实施例6中制备得到的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球的催化活性和循环利用性能图，其他实施例中制备得到的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球均具备图3所示相当的催化活性和循环利用性能。
实施例13
将实施例6中所得到的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球作为催化剂，以共轭亚油酸和无水乙醇为原料生产共轭亚油酸乙酯，具体方法为：将0.3g脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球加入到3g共轭亚油酸与1.5g无水乙醇混合液中，在70℃下搅拌12h，反应液过滤，分离催化材料沉淀，收集滤液得到共轭亚油酸乙酯。通过对产物共轭亚油酸乙酯的产率进行测定，进而评价其转酯化程度，共轭亚油酸乙酯产率越高，反应越完全。从酶催化体系中回收的催化材料，再次加入上述反应体系中，在相同条件下进行催化，实现脂肪酶的循环利用。图4为共轭亚油酸、经脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化后的产物、产物纯化后得到的共轭亚油酸乙酯的红外谱图。

Claims (8)

1.一种脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法，其特征在于，包括将含有丙烯酰胺单体和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的水相和含有复配乳化剂的有机相混合后，进行反相乳液聚合反应而得到聚丙烯酰胺水凝胶微球的步骤以及将脂肪酶物理吸附到所述聚丙烯酰胺水凝胶微球而得到脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的步骤，其中所述复配乳化剂是司盘类乳化剂和吐温类乳化剂混合而制备得到，所述复配乳化剂的HLB值为3～7，
在所述水相中所述丙烯酰胺单体和N,N-亚甲基双丙烯酰胺的质量比为1:0.003～0.03，
所述水相是将丙烯酰胺单体和N,N-亚甲基双丙烯酰胺加入到含有分散剂的无水乙醇或水中，搅拌溶解而制备得到，其中所述分散剂为聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种，所述分散剂在所述无水乙醇或水中的质量百分浓度为0.1～0.8％。
2.根据权利要求1所述的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法，其特征在于，所述司盘类乳化剂为司盘85、司盘65、司盘80、司盘60中的一种，所述吐温类乳化剂为吐温80、吐温60、吐温40、吐温20中的一种。
3.根据权利要求1所述的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法，其特征在于，所述有机相是将复配乳化剂加入到有机相分散介质中，搅拌溶解而制备得到，其中所述有机相分散介质为二甲苯、正己烷、环己烷中的一种，所述复配乳化剂在有机相分散介质中的浓度为1～20％。
4.根据权利要求1所述的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球的制备方法，其特征在于，所述反相乳液聚合反应步骤为，将所述水相和有机相混合，在50～65℃下搅拌20～60min并通入氮气以制备油包水型乳液，加入引发剂，在70～85℃、搅拌下反应2～8h，其中，所述搅拌的速率为350～800rpm。
5.根据权利要求4所述的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法，其特征在于，所述引发剂为偶氮二异丁腈、过硫酸铵、过硫酸钾中的一种。
6.根据权利要求1所述的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法，其特征在于，所述物理吸附的方法为，将所述聚丙烯酰胺水凝胶微球放入含有所述脂肪酶的酶溶液中，在350～800rpm下振荡1～12h，得脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料。
7.根据权利要求1所述的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料的制备方法，其特征在于，所述脂肪酶为南极假丝酵母脂肪酶发酵液。
8.权利要求1～7中任一项所述的制备方法制得的脂肪酶/聚丙烯酰胺水凝胶微球催化材料在作为酯化反应的催化剂中的用途。
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CN114214300B (zh) * 2021-12-17 2024-03-12 安徽工业大学 一种固定化酶材料及其制备方法和应用
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CN101899130B (zh) * 2010-08-02 2011-12-07 陕西师范大学 大孔聚丙烯酰胺树脂的制备方法及其应用
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CN108503880B (zh) * 2018-03-20 2020-10-20 大连工业大学 一种反相微乳液聚合制备聚丙烯酰胺-海藻酸钙复合微球的方法
CN111285951B (zh) * 2020-03-04 2022-10-18 大连工业大学 一种脂肪酶/聚离子液体-苯乙烯微球/水凝胶催化材料及其制备方法和应用

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